王麗麗 孫昌法 胡尚連

摘要： 以梁山慈竹為材料，提取葉片DNA并將其作為模板，采用正交設(shè)計試驗優(yōu)化影響梁山慈竹簡單重復(fù)序列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（SSR-PCR）體系的3個主要因素，并對21個梁山慈竹不同品系進行穩(wěn)定性驗證，結(jié)果表明，優(yōu)化的20 μL SSR-PCR反應(yīng)體系為2×Taq PCRMix 8 μL、模板DNA（20 ng/μL） 2.5μL 、SSR引物（1.0×10-4 mmol/L） 1 μL，無菌蒸餾水補足至20 μL;使用SSR引物BMK.38757對21個梁山慈竹不同品系進行擴增，擴增產(chǎn)物大小在 140 bp 左右，共有4個多態(tài)性位點;使用SSR引物L(fēng)6、R83對梁山慈竹進行擴增，均獲得3個多態(tài)性位點，且條帶清晰。

關(guān)鍵詞： 梁山慈竹;簡單重復(fù)序列（SSR）;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）;正交試驗;優(yōu)化

中圖分類號：S795.501? 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）05-0061-04

簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）別稱微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）[1]，由1～6個堿基重復(fù)串聯(lián)組成，其不同等位基因間的重復(fù)數(shù)具有豐富的差異，而其兩側(cè)的序列高度保守，可以在重復(fù)串聯(lián)序列的兩端設(shè)計引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增片段的長度檢測等位基因的多態(tài)性。SSR是Skinner等于1974年在研究寄居蟹時首次發(fā)現(xiàn)的[2]，此后人們相繼發(fā)現(xiàn)，SSR廣泛存在于真核生物中，由于其具有多態(tài)性高、容易檢測、共顯性等特點，SSR標(biāo)記技術(shù)很快在動植物遺傳檢測分析中得到廣泛應(yīng)用[3-4]。

SSR標(biāo)記根據(jù)開發(fā)方法可分為基因組SSR（gSSR）、表達序列標(biāo)簽SSR（EST-SSR）標(biāo)記，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測序相對價格越來越低，一些無參照基因組物種的EST-SSR開發(fā)也越來越容易。西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院實驗室在梁山慈竹分子層面研究上取得一定進展[5]，并獲得多個品系梁山慈竹的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[6-7]，這為梁山慈竹EST-SSR分子標(biāo)記的開發(fā)提供了堅實的基礎(chǔ)。在EST-SSR標(biāo)記開發(fā)過程中，PCR過程對后續(xù)電泳條帶的讀取具有直接的影響[8]，為保證PCR結(jié)果的可靠性，本研究對影響梁山慈竹 SSR-PCR 結(jié)果的主要因子進行優(yōu)化，以獲得較好的反應(yīng)體系，為后續(xù)梁山慈竹的遺傳多樣性、性狀關(guān)聯(lián)分析及分子輔助育種等研究奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

移液槍、PCR擴增儀、瓊脂糖凝膠電泳儀、垂直板電泳儀、凝膠成像儀、通風(fēng)櫥、離心機、數(shù)碼相機等。

1.2 試驗材料

野生型梁山慈竹及梁山慈竹20個栽培品系葉片，由西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院實驗室提供。

1.3 DNA提取及檢測

21個梁山慈竹品系的葉片基因DNA采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法進行提取[9]，并采用1%瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度法分別檢測提取的DNA質(zhì)量、濃度;分別取各品系DNA溶液10 μL，用蒸餾水稀釋至20 ng/μL后，在-20 ℃冰箱中保存，備用。

1.4 SSR-PCR體系優(yōu)化

以野生型梁山慈竹葉片DNA為模板，使用SSR引物BMK.38757（表1），對影響SSR-PCR效果的Taq PCRMix用量、引物濃度、DNA模板用量采用3因素4水平正交試驗進行優(yōu)化，具體設(shè)計見表2，反應(yīng)總體積為20 μL，不足的加雙蒸水補齊。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s，56 ℃下退火 30 s，72 ℃延伸25 s，32個循環(huán);72 ℃延伸 5 min;4 ℃ 保存。采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳2.5～3.0 h，電泳恒定電壓為600 V;使用ACS染液（2%硝酸銀，10%乙醇，0.5%冰醋酸）染色15～20 min，蒸餾水沖洗后，浸沒于由3%氫氧化鈉（NaOH）、0.1%甲醛配制成的顯影液中顯影約 15 min，至條帶清洗;采用數(shù)碼相機拍照記錄。

1.5 SSR-PCR反應(yīng)體系驗證

以野生型梁山慈竹葉片DNA為對照（CK），以20個梁山慈竹品系葉片DNA為試驗材料，以 BMK.38757、L6、R83為引物，分別在退化溫度為56、55、57 ℃，其他反應(yīng)程序同“1.4”節(jié)條件下對優(yōu)化的 SSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定性及引物擴增的多態(tài)性進行驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 梁山慈竹葉片DNA的提取與檢測

由圖1可見，21個梁山慈竹品系的葉片DNA電泳后均具有明亮的條帶，且條帶沒有明顯的拖尾。紫外分光光度計檢測結(jié)果顯示，各品系DNA在波長分別為260、280 nm處的吸光度比值均在 1.7～1.9之間，DNA濃度均在200 ng/μL以上，說明DNA降解較少，蛋白雜質(zhì)污染相對較輕，提取質(zhì)量較高，可滿足后續(xù)試驗要求。

2.2 梁山慈竹SSR-PCR體系的優(yōu)化

由圖2可知，采用引物BMK.38757共擴增出4條條帶;Taq PCRMix用量為10～12 μL（泳道9～泳道16）時，條帶染色過深，且容易出現(xiàn)引物二聚體;在Taq PCRMix用量相同條件（泳道1～泳道4）下，引物濃度或模板DNA用量的增加可以提升PCR的擴增效果;泳道5～泳道8的條帶則進一步表明，模板DNA用量的增加會使擴增條帶逐漸清晰，而引物濃度對擴增結(jié)果影響相對較小。因此，優(yōu)化的梁山慈竹SSR-PCR體系為2×Taq PCRMix 8 μL，模板DNA用量（20 ng/μL）2.5 μL，SSR引物（1.0×10-4 mmol/L）1 μL，無菌蒸餾水補足至20 μL。

2.3 梁山慈竹SSR-PCR優(yōu)化反應(yīng)體系的驗證

使用SSR引物BMK.38757，對野生型梁山慈竹及20個梁山慈竹栽培品系采用優(yōu)化反應(yīng)體系進行PCR擴增，結(jié)果（圖3）顯示，共獲得4個多態(tài)性位點，產(chǎn)物大小均在140 bp左右，條帶清晰，容易分辨，且均未見引物二聚體的產(chǎn)生。

圖4-（1）、圖4-（2）分別為采用引物L(fēng)6、引物R83在優(yōu)化體系下對部分梁山慈竹品系的PCR擴增結(jié)果，結(jié)果表明，2個引物均可獲得3個等位多態(tài)性位點，說明優(yōu)化體系能夠適用于多對引物，能夠得到清晰、無拖尾、易于讀取的條帶。

3 結(jié)論與討論

簡單重復(fù)序列標(biāo)記由于具有共顯性、數(shù)量豐富、多態(tài)性高、開發(fā)容易且開發(fā)時間短等特點[10]，自該技術(shù)誕生以來，得到廣大科研工作者的青睞，目前該技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于動植物的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、目標(biāo)基因定位、品種鑒定及輔助育種等研究[11-16]中。由于竹類植物以無性繁殖為主，其遺傳多樣性分析、分類等分子水平上的研究難度較大[17]，因此，將SSR分子標(biāo)記手段應(yīng)用在竹類植物研究上具有重要的意義。

SSR分子標(biāo)記的技術(shù)基礎(chǔ)是PCR擴增，影響PCR擴增的因素將直接影響SSR分子標(biāo)記的結(jié)果。本研究對梁山慈竹SSR-PCR的引物濃度、模板DNA濃度、Taq PCRMix等設(shè)計3因素4水平正交試驗，獲得的最佳反應(yīng)體系為Taq PCRMix 8 μL，模板DNA（20 ng/μL）2.5 μL，SSR引物（1.0×10-4 mmol/L） 1 μL，無菌蒸餾水補足至20 μL。

采用優(yōu)化的反應(yīng)體系對野生型梁山慈竹及20個梁山慈竹栽培品系進行PCR擴增，部分引物獲得較好的多態(tài)性位點，其中，引物BMK.38757獲得4個多態(tài)性位點，引物L(fēng)6、R83均可獲得3個多態(tài)性位點。表達序列標(biāo)簽SSR（EST-SSR）標(biāo)記可用于梁山慈竹不同栽培品種間的遺傳分析，結(jié)合性狀關(guān)聯(lián)分析[18-19]能夠應(yīng)用于優(yōu)良竹種選育與鑒別，有利于加快育種速度。

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收 稿日期：2019-02-12

基金項目：四川省“十三五”重點攻關(guān)項目（編號：2016NYZ0038）。

作者簡介：王麗麗（1992—），女，山東臨沂人，碩士，從事植物遺傳與品種改良。E-mail：1298901076@qq.com。

通信作者：胡尚連，博士，教授，從事植物生理與生物技術(shù)研究。E-mail：hashanglian@126.com。