楊妍 尹盈愛 董益陽

摘?要?黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）是真菌或霉菌產(chǎn)生的有毒代謝物，通過污染農(nóng)作物和食品從而對人體健康造成嚴重威脅。本研究建立了納米金（AuNPs）-適配體比色傳感法，采用不同序列長度的AFB1適配體檢測玉米油中AFB1。通過優(yōu)化適配體濃度、NaCl濃度和體系反應溫度，進一步提高體系檢測靈敏度。在最佳條件下，50（B50）和80（A80）個堿基長度的適配體建立的AuNPs-適配體比色傳感法的檢出限分別為13.55和10.56 ng/mL，線性范圍均為20～1000 ng/mL，且選擇性良好?；贐50和A80適配體比色傳感法檢測玉米油中AFB1的加標回收率分別為102.4%～104.9%和98.1%～109.1%。結(jié)果表明，基于B50和A80建立的AuNPs比色傳感法均可用于玉米油中AFB1特異性鑒定。本研究為現(xiàn)場快速檢測和高效篩查食品中AFB1污染提供了技術支持，為開發(fā)針對其它靶標的適配體傳感檢測方法奠定了基礎。

關鍵詞?黃曲霉毒素B1;適配體;納米金-適配體比色傳感法;玉米油

1?引 言

黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）是真菌黃曲霉（fungus Aspergillus flavus）和霉菌寄生曲霉（mold Aspergillus parasiticus）產(chǎn)生的次級代謝物[1]，多存在于花生、玉米、大米、大豆、小麥等農(nóng)副產(chǎn)品中[2]。AFB1具有急性和慢性毒性[3]，還可導致肝癌，被國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）列為I類致癌物[4]。AFB1對農(nóng)產(chǎn)品的消費安全以及人和動物的健康存在嚴重威脅，因此許多國家和組織設定了AFB1殘留的最高限量標準。我國對小麥、大麥及其制品的AFB1殘留量最高限量為5 μg/kg，玉米、玉米面和玉米制品的AFB1殘留量最高限量為20 μg/kg[5];歐盟規(guī)定所有谷物和谷物制品中的AFB1的最大殘留限量為2 μg/kg[6]。目前，檢測AFB1方法主要分為3類：第一類是儀器檢測法，如高效液相色譜-熒光法[7]、液相色譜-質(zhì)譜法[8]和氣相色譜-質(zhì)譜法[9]等，儀器法靈敏度高、重現(xiàn)性好，但存在設備昂貴不便攜、樣品前處理過程繁瑣、周期長等問題。第二類是基于免疫分析的快速檢測方法，酶聯(lián)免疫分析法[10]檢測快速、回收率高，但酶活性不穩(wěn)定，易導致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性、假陰性問題。膠體金免疫層析技術[11]操作方便、檢測時間短、成本低，但檢測結(jié)果的精確度仍存在一些問題。熒光免疫分析法[12]靈敏度高、可實現(xiàn)多組分樣品檢測，但反應條件嚴格，可選擇的熒光物質(zhì)受限，環(huán)境中稀土元素易影響反應。第三類方法是基于核酸適配體開發(fā)的簡單、快速、低成本的AFB1現(xiàn)場檢測和快速篩查方法。

核酸適配體是在體外通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選得到的單鏈寡核苷酸（DNA或RNA）[13，14]。適配體能以高親和力和特異性識別各種靶分子，包括金屬離子、藥物、有機小化合物、代謝產(chǎn)物、蛋白質(zhì)甚至細胞等[15～17]。與抗體相比，適配體具有批間差異性小、易合成和修飾、熱穩(wěn)定性高、生產(chǎn)成本較低等優(yōu)點[18，19]。近年來，適配體與熒光法、電化學、比色法相結(jié)合的生物傳感方法受到越來越多的關注[20～23]，其中，比色法成本低、檢測迅速、操作簡單，已廣泛應用于食品中真菌毒素[24]、四環(huán)素類抗生素[25]、磺胺類抗生素[26]等多種靶標的檢測。Yang等[24]基于納米金（AuNPs）聚集變色，開發(fā)了比色傳感法檢測赭曲霉毒素A（OTA）;Sun等[27]基于AuNPs類過氧化物酶活性建立了比色傳感法，檢測玉米中的赤霉烯酮。

在上述報道中，適配體比色傳感法均使用一條確定堿基序列長度的適配體檢測靶標分子，而堿基序列的組成以及序列長度是影響適配體與靶標的親和性的重要因素。為了比較不同序列長度適配體在實際檢測中的性能，本研究針對AFB1，選擇目前文獻報道中常用的50（B50）[28]和80（A80）[29]個堿基長度的AFB1適配體，建立了相應的AuNPs-適配體比色傳感方法，比較了兩種適配體傳感器在比色傳感中的檢測能力和選擇性，為食品中AFB1的現(xiàn)場檢測和快速篩查奠定了基礎。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

JEOL-100CX-II透射電子顯微鏡（日本日立株式會社）;Nanodrop 2000c紫外分光光度計、UV/UF超純水儀（美國Thermo Scientific公司）;pHS-3C pH計（上海雷磁儀器廠）;?3K 15臺式冷凍離心機（美國Sigma-Aldrich公司）;BT25S臺式電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）;RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

氯金酸（純度99%，國藥集團化學試劑公司）;檸檬酸三鈉、NaCl、MgCl2、KCl、CaCl2和HCl均為分析純（北京化工廠）;黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、OTA標準品（青島普瑞邦公司）;四環(huán)素（TC）標準品、分析純?nèi)u甲基甲烷（Tris）（美國Sigma-Aldrich公司）。玉米油購于本地超市。實驗用水為超純水（18.2 MΩ cm）。黃曲霉毒素B1適配體序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下： B50 [28]：5'-?GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA CA-3';A80[29]：5'-?AGC AGC ACA GAG GTC AGA TGG TGC TAT CAT GCG CTC AAT GGG AGA CTT TAG CTG CCC CCA CCT ATG CGT GCT ACC GTG AA-3'。

2.2?AuNPs的制備

采用檸檬酸鹽還原法合成AuNPs[25]。100 mL 1% 氯金酸溶液在攪拌下加熱至沸騰，然后快速加入3 mL 1%檸檬酸三鈉溶液。在劇烈攪拌下，溶液保持加熱約12 min，直到溶液顏色變成酒紅色。制得的AuNPs溶液于4℃避光保存。

2.3?基于AuNPs-適配體傳感法檢測AFB1

用結(jié)合緩沖液（100 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L MgCl2，5 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl2，pH 7.6）配制0.3 μmol/L AFB1適配體，然后將40 μL 適配體溶液和40 μL AFB1溶液充分混勻，孵育5 min，加入240 μL AuNPs孵育5 min，再加入40 μL 0.3 mol/L NaCl溶液充分混勻，反應5 min，裸眼觀察顏色變化，并用UV-Vis分光光度計掃描450～750 nm的光譜，記錄520和650 nm處吸收值變化。配制不同濃度的AFB1標準工作溶液（20、50、100、200、400、600、800和1000 ng/mL），用于繪制校準曲線。所有測定均在25℃進行。

2.4?選擇性研究

配制800 ng/mL的AFB1、AFB2、OTA和TC溶液，按照AuNPs-適配體傳感法檢測AFB1的步驟，分別用A80和B50進行適配體特異性評價，并取等體積的緩沖液做陰性對照實驗。

2.5?實際樣品測定

稱取4 g玉米油，加20 mL石油醚，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，再加20 mL提取液（甲醇-水，55∶45，V/V）充分振蕩搖勻。靜置分層，收集下層的甲醇-水溶液，上層液體再加5 mL提取液再次萃取，合并兩次萃取的下層溶液，65℃水浴中蒸干，然后放在冰盒冷卻3 min，準確加入1 mL苯-乙腈（98∶2，V/V）混合液，充分溶解蒸干的殘留物。將AFB1添加到預處理溶液中，用緩沖液分別稀釋成20、50、100、200、300、400、600、800和1000 ng/mL，用于繪制基質(zhì)匹配的校準曲線，并進行實際樣品中AFB1測定[30，31]。

3?結(jié)果與討論

3.1?比色法傳感法檢測AFB1的原理

本研究基于AuNPs比色法，使用50堿基和80個堿基長度適配體檢測AFB1，比較兩種適配體的檢測能力和選擇性，原理如圖1所示。采用檸檬酸還原法合成AuNPs，由于AuNPs顆粒表面帶負電荷的檸檬酸根離子，AuNPs顆粒間具有靜電排斥作用，在NaCl溶液中可以穩(wěn)定分散，溶液呈酒紅色。單鏈核酸適配體可以暴露堿基而非磷酸骨架，通過分子間范德華力吸附在帶負電荷的AuNPs顆粒表面[27]，阻礙AuNPs顆粒在NaCl溶液中的聚集，具有保護作用（圖1C-Ⅰ）。當體系中存在靶標AFB1分子，AFB1和適配體特異性識別誘導適配體結(jié)構(gòu)從無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)變?yōu)閯傂越Y(jié)構(gòu)，適配體對AuNPs的保護作用減弱，導致AuNPs在高濃度NaCl作用下發(fā)生聚集，溶液的顏色從紅色變?yōu)樗{色（圖1C-Ⅱ），并且溶液顏色變化程度與AFB1的濃度呈比例關系，因此，通過裸眼觀察或測定溶液吸收值可對AFB1的濃度進行定性或精密定量檢測。

3.2?AuNPs以及傳感體系的表征

圖2A為AuNPs在不同條件下的吸收光譜。采用檸檬酸還原法合成～13 nm AuNPs顆粒（圖2B）在520 nm處有最大吸收峰（圖2A，曲線a）。當加入0.3 mol/L NaCl時，AuNPs在520 nm處的吸收峰值降低，在710 nm處出現(xiàn)另一個吸收峰（圖2A，曲線b），這主要是由于NaCl誘導AuNPs顆粒聚集引起的。在分別添加0.3 μmol/L A80和B50適配體后，僅出現(xiàn)了520 nm的吸收峰，與AuNPs的特征峰相似（圖2A，曲線c和d），表明適配體可以保護AuNPs顆粒免受NaCl引起的聚集。在體系中加入800 ng/mL AFB1后，A80和B50體系同時觀察到在520和650 nm處的吸收峰（圖2A，曲線e和f），這是由于AFB1結(jié)合了部分A80和B50，使其失去了保護金納米粒子的作用。因此，采用A650/A520比值變化進行后續(xù)研究。

3.3?反應條件優(yōu)化

3.3.1?適配體濃度優(yōu)化?適配體濃度是影響比色傳感法檢測AFB1靈敏度的關鍵。AuNPs的分散性受NaCl濃度影響，因此，首先確定NaCl的起始工作濃度。如圖2C所示，隨著NaCl濃度增加，AuNPs在520 nm處的吸收峰值降低，在650 nm處的吸收峰值增加，當NaCl濃度為0.30和0.35 mol/L時，兩者特征吸收峰值相近。因此選擇0.3 mol/L為NaCl起始工作濃度。適配體可以保護AuNPs顆粒免于聚集，A80和B50濃度優(yōu)化結(jié)果如圖2D所示。在NaCl作用下，低濃度的適配體對AuNPs沒有足夠的保護作用，導致AuNPs聚集，溶液變藍。隨著適配體濃度增加，適配體對AuNPs的保護作用增強，使AuNPs在NaCl溶液中免于聚集，溶液顏色由藍變紅。當A80和B50濃度為0.3 μmol/L時，A650/A520值接近，由于適配體過量會降低檢測靈敏度，因此，選擇0.3 μmol/L作為適配體的最佳工作濃度。

3.3.2?NaCl濃度優(yōu)化?NaCl濃度影響AuNPs的分散性和適配體檢測AFB1的靈敏度。為了進一步提高檢測靈敏度，添加不同濃度的NaCl至A80和B50適配體與AFB1識別體系中，結(jié)果如圖3所示，0.20和0.25 mol/L NaCl不能破壞未結(jié)合AFB1的適配體對AuNPs的保護作用，溶液顏色仍為紅色。當NaCl濃度為0.30和0.35 mol/L時，AuNPs發(fā)生聚集，導致溶液顏色梯度變化（圖3B和3D），且AuNPs體系的A650/A520峰吸收比值隨NaCl濃度的增加而增大（圖3A和3C）。另外，NaCl濃度為0.30 mol/L時，B50和A80在50～800 ng/mL AFB1濃度范圍均能獲得良好的線性相關系數(shù)（R2B50=0.9807，R2A80=09679）。由于過高濃度的NaCl不利于提高檢測AFB1的靈敏度，因此，本研究選擇NaCl的最佳工作濃度為0.30 mol/L。

3.3.3?反應溫度優(yōu)化?體系的反應溫度對適配體和靶標分子識別有較大影響，而反應溫度在體系優(yōu)化過程中易被忽略，故常導致實際檢測結(jié)果不理想?？疾炝朔磻獪囟葘80和B50適配體識別AFB1能力的影響。如圖4所示，隨著溫度升高，AuNPs-適配體體系的顏色逐漸加深（圖4B和4D）。同時，A650/A520值響應幅度增加（圖4A和4C），4℃時響應幅度最低，37℃最高，25℃次之，表明溫度的升高可能有利于適配體對AFB1的識別和加速AuNPs的聚集。分析A650/A520值與AFB1濃度（50～800 ng/mL）的線性相關系數(shù)發(fā)現(xiàn)，較高溫度時，適配體檢測AFB1的線性范圍較窄。綜合考慮操作簡便和現(xiàn)場檢測的需求，最終選擇25℃作為體系的反應溫度。

3.4?AuNPs-適配體比色傳感法定量檢測AFB1

在最優(yōu)的實驗條件下，建立了AuNPs-B50和AuNPs-A80適配體比色傳感法定量檢測AFB1的方法。如圖5B所示，隨著AFB1濃度升高，溶液顏色逐漸由紅變藍，在AFB1濃度范圍為20～1000 ng/mL時（圖5A，黑線和紅線），AuNPs-B50和AuNPs-A80適配體比色傳感法檢測AFB1的A650/A520比值與AFB1濃度呈線性關系，線性方程分別為y1=6.5864×104C+0.0713 （R21=0.9976）和y2=6.1984 × 104C+ 00741（R22=0.9984）。

對于實際玉米油樣品，為了減弱樣品基質(zhì)對AFB1檢測的干擾，采用預處理的玉米油樣品繪制基質(zhì)匹配標準曲線，B50和A80適配體體系在玉米油樣品基質(zhì)體系中檢測AFB1的峰吸收比值略有降低，但線性相關性良好（圖5A，藍線和綠線），線性范圍均為20～1000 ng/mL，線性方程分別為 y3=4.3556×104C + 0.0934（R23=0.9934），y4=4.7343×104C + 0.0889（R24=0.9969），檢出限（3σ）分別為13.55和10.56 ng/mL，滿足國標對玉米油中AFB1的檢測要求[5]。本方法與文獻報道方法的分析性能比較見表1。本研究表明，B50和A80適配體建立的AuNPs-適配體比色傳感法具有良好的AFB1檢測能力，A80檢測玉米油基質(zhì)中AFB1的效果略優(yōu)于B50，可能與適配體的構(gòu)型和親和性（Kd，B50=75 nmol/L，Kd，A80=11.39 nmol/L）有關[28，29]。

3.5?選擇性

考察了AuNPs-適配體比色傳感法檢測AFB1的特異性。在相同的條件下，采用800 ng/mL的AFB2、OTA和TC進行了對比實驗。如圖5C所示，與AFB1明顯增加的峰吸收比值相比，AFB2的峰吸收比值略增，OTA和TC的峰吸收比值無明顯增加，且接近陰性對照組。這表明B50和A80適配體在AuNPs比色傳感法檢測中具有良好的選擇性和特異性。

3.6?玉米油實際樣品檢測

為了驗證建立的AuNPs-適配體比色傳感法的準確性和可靠性，采用本方法對玉米油樣品進行了檢測。本地超市購得玉米油樣品中未檢出AFB1。采用預處理的玉米油樣品進行AFB1加標回收實驗，加標水平為50、100和300 ng/mL。結(jié)果如表2所示，基于B50和A80適配體檢測AFB1的加標回收率范圍分別為102.4%～104.9%和98.1%～109.1%，相對標準偏差分別為4.1%～9.2%和2.9%～10.0%。上述結(jié)果表明，基于B50和A80適配體建立的AuNPs比色傳感法的準確度相當，定量檢測AFB1的結(jié)果準確可靠。本方法可用于玉米油中AFB1的快速篩查和現(xiàn)場檢測。

4?結(jié) 論

AuNPs比色傳感法的關鍵在于適配體在AuNPs表面的吸附和解吸作用，以及AuNPs-適配體體系在鹽溶液中的穩(wěn)定性。目前，大部分靶標分子常存在不同長度的適配體序列，因此，建立并評價不同長度適配體的AuNPs比色傳感分析方法至關重要。本研究基于AuNPs比色傳感技術，建立了50和80堿基長度的AFB1適配體定量檢測AFB1的方法，評價了兩條適配體檢測AFB1的能力。通過優(yōu)化適配體濃度、鹽濃度和溫度，得到AuNPs-B50和AuNPs-A80適配體比色傳感法檢測玉米油基質(zhì)中AFB1的檢出限分別為13.55和10.56 ng/mL，線性檢測范圍均為20～1000 ng/mL，選擇性均較高。本研究表明，在相同AFB1濃度范圍內(nèi)，A80適配體檢測玉米油中AFB1效果略優(yōu)于B50適配體，這可能與適配體本身的結(jié)構(gòu)和親和性有關，需結(jié)合其它分子互作技術深入探討。本檢測方法簡單快速，裸眼可視，易于進行定性和定量分析，可望發(fā)展為現(xiàn)場檢測和快速篩選樣品中AFB1的高效方法。本研究為建立和對比其它靶標相同而適配體序列長度不同的適配體傳感方法提供了參考。

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