何微微茹 雷石妙麗燕銀芳晉 玲

［1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中（藏） 藥資源研究所，甘肅蘭州 730000］

羌活始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是中醫(yī)臨床常用解表、祛風(fēng)濕藥。羌活的主要成分是揮發(fā)油、香豆素、有機(jī)酸和糖類［1-3］，其中羌活醇和異歐前胡素是其主要活性物質(zhì)［1-4］，其含有量和總量可作為羌活藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)［5］。由于羌活中揮發(fā)油含有量較高，其在儲(chǔ)藏過程中極易走油、蟲蛀，切制為飲片后變質(zhì)問題更甚，倉(cāng)儲(chǔ)損失嚴(yán)重［6-8］。但目前為止，除陸善旦等［9］簡(jiǎn)單考察了傳統(tǒng)包材對(duì)羌活藥材外觀和含水量的影響外，尚未見有關(guān)羌活包裝、儲(chǔ)存的研究。因此，有必要對(duì)羌活及其飲片的適宜包裝、儲(chǔ)藏條件進(jìn)行探索。目前，當(dāng)歸［10-11］、大黃［12-13］、黨參［14-15］等易變質(zhì)藥材的包裝倉(cāng)儲(chǔ)研究基本都以外觀性狀、水分、浸出物、含有量等指標(biāo)作為儲(chǔ)藏效果的判斷依據(jù)，未能深入探明包裝、儲(chǔ)藏條件對(duì)藥材內(nèi)在質(zhì)量的具體影響。因此，本課題組對(duì)不同包裝、儲(chǔ)存條件下的羌活飲片主要活性成分（羌活醇、異歐前胡素）和4 種內(nèi)在指標(biāo)成分（綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、佛手柑內(nèi)酯）的含有量進(jìn)行考察，以期探明包裝、儲(chǔ)藏條件對(duì)其內(nèi)在質(zhì)量的影響，確定最佳包裝材料和適宜貯藏條件。

1 材料與處理

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 羌活藥材飲片，甘肅隴脈藥材有限公司提供，批號(hào)170701。3 種包裝材料分別為牛皮紙凝膜紙袋、聚乙烯塑料袋、聚乙烯鋁箔復(fù)合袋。

1.1.2 試劑與藥物 屈臣氏飲用水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司，20170905-20180705）；乙腈、甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司）；磷酸、無水乙醇（分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠）。對(duì)照品異歐前胡素（180620）、羌活醇（180326）、綠原酸（180310）、佛手柑內(nèi)酯（180320）、紫花前胡苷（180308）均購(gòu)于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；阿魏酸（上海源葉生物科技有限公司，H25M6L1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）。

1.1.3 儀器 U-3000 RSLC 快速液相色譜儀（賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司）；LSC-735 藥品冷藏（陰涼）陳列柜（江蘇美百加電氣科技有限公司）；RRHP-200 萬能高速粉碎機(jī)（上海菲力博實(shí)業(yè)公司）；DHG-9123A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；AL104 分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；KH5200B 超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；F1-ClipTip 移液槍（美國(guó)Thermo Fisher 公司）。

1.2 處理 羌活飲片模擬市售包裝，每袋0.1 kg，以高溫封口機(jī)封口，包裝和儲(chǔ)藏處理見表1，儲(chǔ)存期為1 年（2017.09.20 至2018.09.20）。本實(shí)驗(yàn)中，常溫條件即在室溫環(huán)境中存放，陰涼、冷藏條件是將藥材放入可調(diào)溫藥品柜中，陰涼柜溫度設(shè)置為16.8 ℃，冷藏柜溫度設(shè)置為8.2 ℃。儲(chǔ)藏期間每2 個(gè)月對(duì)不同包裝、儲(chǔ)藏處理的羌活飲片進(jìn)行含水量和含有量測(cè)定。

表1 樣品包裝、儲(chǔ)藏方法Tab.1 Packaging and storage methods of samples

2 方法

2.1 含水量測(cè)定 羌活含水量按2015 年版《中國(guó)藥典》 第三部中所載通則0832 中的第四法（甲苯法）進(jìn)行。

2.2 含有量測(cè)定 樣品含有量測(cè)定采用液相色譜法，測(cè)定成分包括綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、佛手柑內(nèi)酯、羌活醇、異歐前胡素。計(jì)算以樣品干重（除去水分）時(shí)的含有量為準(zhǔn)。

2.2.1 色譜條件 采用Waters UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相0.3%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～4 min，90%A，10%B；4～8 min，90%～47%A，10%～53%B；8～12 min，47%～20% A，53%～80% B；12～16 min，20% A，80% B；16～18 min，20%～90%A，80%～10% B）；體積流量0.2 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)246 nm；進(jìn)樣量1.0 μL。樣品及混合對(duì)照品色譜圖見圖1。

圖1 各成分UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取對(duì)照品綠原酸1.91 mg、阿魏酸5.99 mg、紫花前胡苷2.55 mg、佛手柑內(nèi)酯5.30 mg、羌活醇7.57 mg、異歐前胡素4.21 mg，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，配成6 個(gè)對(duì)照品貯備液。精密量取綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、佛手柑內(nèi)酯、羌活醇、異歐前胡素對(duì)照品貯備液各1 mL，置于10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，配成混合對(duì)照品溶液。4 ℃保存，備用。

2.2.3 供試品溶液制備 取羌活藥材粉末（過60目篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，取出，放至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 線性關(guān)系考察 分別將綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、佛手柑內(nèi)酯、羌活醇、異歐前胡素對(duì)照品母液梯度稀釋，各對(duì)照品配制5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度的對(duì)照品溶液。分別取6 種對(duì)照品的系列質(zhì)量濃度溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下依次進(jìn)樣。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取儲(chǔ)藏6 個(gè)月的CK樣品供試品溶液1 μL，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、佛手柑內(nèi)酯、羌活醇、異歐前胡素峰面積RSD 分別為 1.13%、1.14%、1.00%、0.99%、1.01%、1.01%。表明儀器精密度良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取儲(chǔ)藏6 個(gè)月的CK 樣品供試品溶液，分別于放置0、3、6、12、18、24 h時(shí)，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、佛手柑內(nèi)酯、羌活醇、異歐前胡素峰面積RSD 分別為1.92%、2.01%、1.85%、1.53%、1.09%、1.20%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取儲(chǔ)藏6 個(gè)月的CK 樣品粉末6 份，每份0.2 g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、佛手柑內(nèi)酯、羌活醇、異歐前胡素峰面積RSD 分別為1.60%、1.64%、1.90%、1.80%、1.73%、1.64%。表 明該方法重復(fù)性性良好。

2.2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含有量的CK 樣品（儲(chǔ)藏12 月）5 份，每份0.2 g，分別精密加入一定量的綠原酸、阿魏酸、紫花前胡苷、佛手柑內(nèi)酯、羌活醇、異歐前胡素對(duì)照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝5）

3 結(jié)果與分析

3.1 含水量測(cè)定 各樣品在12 個(gè)月儲(chǔ)藏期間的含水量情況見表4。

表4 儲(chǔ)存期間各樣品含水量（%）Tab.4 Moisture content of various samples during storage（%）

3.2 含有量測(cè)定

3.2.1 初始樣品含有量 對(duì)未做包裝儲(chǔ)藏處理的初始羌活飲片樣品（儲(chǔ)藏0 個(gè)月）5 種指標(biāo)成分含有量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表5。

表5 初始樣品各指標(biāo)成分含有量Tab.5 Contents of index components in initial samples

3.2.2 綠原酸含有量 測(cè)定得各樣品中綠原酸含有量見圖2。可知，1 年儲(chǔ)藏期間，不同包裝、儲(chǔ)藏條件下的羌活飲片，其綠原酸含有量及含有量變化各不相同。樣品CK 的綠原酸含有量基本隨儲(chǔ)存時(shí)間的增加而持續(xù)降低，樣品C 的含有量變化趨勢(shì)與之相似，其他處理樣品的綠原酸含有量則呈現(xiàn)出不同程度地高低波動(dòng)；紙袋包裝的樣品A、B、C 的含有量整體略高，尤其樣品A，其含有量波動(dòng)小，月間含有量高，儲(chǔ)藏到第10 個(gè)月和12 個(gè)月時(shí)，含有量顯著高于其他處理的樣品。塑料袋包裝樣品D、E、F、G 的含有量總體較小，其中，樣品G 的含有量波動(dòng)最大，且儲(chǔ)藏到第2、6、8 個(gè)月時(shí)，其含有量顯著低于其他處理的樣品；不同光照處理的樣品D、F，D 在1 年內(nèi)的月間含有量基本都顯著高于F（除第2 個(gè)月外）。

圖2 綠原酸含有量Fig.2 Content of chlorogenic acid

3.2.3 阿魏酸含有量 測(cè)定得各樣品中阿魏酸含有量見圖3?？芍?，儲(chǔ)存1 年間，除樣品C、G 外，其他樣品的阿魏酸含有量基本都呈現(xiàn)為上升趨勢(shì)。其中，樣品E、F 的阿魏酸含有量隨儲(chǔ)存時(shí)間的增加而持續(xù)升高，而且在儲(chǔ)藏期內(nèi)，樣品E 的阿魏酸含有量一直顯著高于其他處理的樣品；此外，相較于常溫、陰涼儲(chǔ)藏的樣品，同材料包裝后低溫儲(chǔ)存的樣品（C、G、M）其阿魏酸含有量整體偏低，且儲(chǔ)存期間含有量波動(dòng)較大；對(duì)于不同光照處理的樣品D、F，二者儲(chǔ)存期間的含有量差異不大，但樣品D 的含有量波動(dòng)較大，而樣品F 的含有量則穩(wěn)定升高。

圖3 阿魏酸含有量Fig.3 Content of ferulic acid

3.2.4 紫花前胡苷含有量 測(cè)定得各樣品中紫花前胡苷含有量見圖4?？芍瑑?chǔ)存期間，羌活中紫花前胡苷的含有量變化無具體規(guī)律，但不同包裝、儲(chǔ)存條件下的樣品其紫花前胡苷的含有量表現(xiàn)為不同程度地上下波動(dòng)。其中，樣品D 的紫花前胡苷含有量在1 年間波動(dòng)最小，相較于同處理、避光儲(chǔ)存的樣品F，其儲(chǔ)存2、4、8、10、12 個(gè)月時(shí)的含有量均顯著高于樣品F；塑料袋包裝的樣品D、E、F、G，其含有量整體較其他材料包裝的樣品高；鋁塑復(fù)合袋包裝的樣品K、L、M，其含有量波動(dòng)整體較其他材料包裝的樣品大，其中樣品L 的紫花前胡苷的含有量波動(dòng)最大，在1.031%～0.295%之間。

圖4 紫花前胡苷含有量Fig.4 Content of nodakenin

3.2.5 佛手柑內(nèi)酯含有量 測(cè)定得各樣品中佛手柑內(nèi)酯含有量見圖5?？芍撆蓟铒嬈蟹鹗指虄?nèi)酯含有量較低，最高為0.13%。但1 年儲(chǔ)藏期間，各處理樣品中佛手柑內(nèi)酯的含有量還是表現(xiàn)出了不同程度地升降變化，總體變化趨勢(shì)為先升高后降低，且所有樣品的佛手柑內(nèi)酯含有量都在儲(chǔ)藏到6 個(gè)月時(shí)達(dá)到最高；同一儲(chǔ)存期下各樣品的佛手柑含有量差異不明顯，尤其儲(chǔ)藏的前6 個(gè)月，樣品間差異極小；但低溫儲(chǔ)存的樣品C、G、M 中佛手柑內(nèi)酯的含有量整體稍高于常溫、陰涼條件下儲(chǔ)存的樣品；不同光照條件下儲(chǔ)存的樣品D、F 在1 年間的含有量差異不明顯。

圖5 佛手柑內(nèi)酯含有量Fig.5 Content of bergapten

3.2.6 羌活醇含有量 測(cè)定得各樣品中羌活醇含有量見圖6?？芍?，該批羌活中羌活醇的含有量整體較高，儲(chǔ)存期間含有量最高可達(dá)1.041%（C，10 個(gè)月），最低0.689%（A，2 個(gè)月）。1 年間，不同處理的樣品中羌活醇的含有量表現(xiàn)出不同程度地升降變化，但除樣品B、C 外，其他樣品中羌活醇的含有量基本都表現(xiàn)為先升高后降低，且含有量最高的時(shí)間基本都在儲(chǔ)藏6 個(gè)月或8 個(gè)月；除樣品B 的含有量在0 至4 個(gè)月間有驟升驟降外，其余各樣品的羌活醇含有量波動(dòng)都較??；同一儲(chǔ)藏時(shí)間下，各樣品間羌活醇含有量差異不太明顯，但樣品CK 和A 的月間含有量基本都顯著低于其他樣品，而鋁塑復(fù)合袋包裝的樣品K、L、M 的月間含有量整體稍高于其他材料包裝的樣品；不同光照處理的樣品D、F，其含有量變化趨勢(shì)一致，1 年內(nèi)的月間含有量無太大差異。

圖6 羌活醇含有量Fig.6 Content of notopterol

3.2.7 異歐前胡素含有量 測(cè)定得各樣品中異歐前胡素含有量見圖7?？芍? 年儲(chǔ)藏期間，各樣品中異歐前胡素的含有量發(fā)生了不同程度地升降變化，但無明顯變化規(guī)律。其中，樣品G 的含有量變化幅度最小，1 年間僅在0.345%～0.415%間波動(dòng)，而鋁塑復(fù)合袋包裝的樣品K、L、M 的含有量升降幅度整體較大，其中M 的變化幅度最大，在0.292%～0.491%間變化；同一儲(chǔ)藏期下，各樣品間異歐前胡素的含有量差異不太明顯，但樣品CK和A 的月間含有量都顯著低于其他樣品；不同光照條件下儲(chǔ)存樣品D、F，兩者的月間含有量無太大差異，年間含有量升降趨勢(shì)也基本相同。

圖7 異歐前胡素含有量Fig.7 Content of isoimperatorin

3.2.8 指標(biāo)成分總含有量 計(jì)算得各樣品中6 種成分的總含有量見圖8?？芍鳂悠分? 種成分的總含有量在1 年間都有升降變化，但無明顯規(guī)律；對(duì)比同一儲(chǔ)藏時(shí)間下各樣品的總含有量，樣品間的差異不太明顯，但樣品CK、A 的的月間總含有量基本都顯著低于其他樣品，且兩者的總含有量變化趨勢(shì)相似；塑料袋包裝的樣品D、E、F、G，其月間總含有量整體略高于其他材料包裝的樣品，且年間含有量升降幅度都較小，尤其樣品G，其含有量?jī)H在1.897%～2.131%間波動(dòng)；不同光照條件處理的樣品D、F，兩者的年間含有量升降趨勢(shì)相似，但樣品D（光照儲(chǔ)存）的總含有量變化幅度比F（避光儲(chǔ)存）小，且月間總含有量也稍高于樣品F。

4 討論與結(jié)論

4.1 儲(chǔ)存時(shí)間的影響 1 年儲(chǔ)藏期內(nèi)，隨儲(chǔ)存時(shí)間的增加，6 種成分的含有量表現(xiàn)出不同趨勢(shì)的升降變化。其中，綠原酸的含有量基本呈持續(xù)降低趨勢(shì)；阿魏酸的含有量則隨儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢升高；佛手柑內(nèi)酯的含有量先升高后降低；羌活醇的含有量也基本表現(xiàn)為先升高后降低；紫花前胡苷和異歐前胡素的含有量隨儲(chǔ)存時(shí)間變化的規(guī)律不明顯。由此可知，羌活藥材的內(nèi)在質(zhì)量并非簡(jiǎn)單地隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加而逐漸損耗變差，其具體的質(zhì)量變化情況是由各內(nèi)在成分的含有量變化規(guī)律綜合調(diào)控的。因此，研究中藥材有效期時(shí)，應(yīng)綜合考慮多種內(nèi)在成分隨儲(chǔ)存時(shí)間變化的規(guī)律，從整體上把握藥材質(zhì)量。

圖8 指標(biāo)成分總含有量Fig.8 Total content of index components

一般來說，藥材儲(chǔ)藏過程中有效成分會(huì)逐漸散失，但有些藥材會(huì)在微生物活動(dòng)影響下發(fā)生“陳化”現(xiàn)象，表現(xiàn)出有效成分含有量隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)而升高的變化規(guī)律，如陳皮中的黃酮類成分［16-18］。本研究中，佛手柑內(nèi)酯和羌活醇的含有量在1 年間表現(xiàn)為先升高后降低的變化規(guī)律，可能與“陳氏”現(xiàn)象有關(guān)。儲(chǔ)藏初期（約0～6 個(gè)月），羌活藥材中自帶的微生物（包裝前未滅菌）生長(zhǎng)代謝旺盛，導(dǎo)致相關(guān)酶活性變化，刺激了佛手柑內(nèi)酯和羌活醇的合成，所以此2 種成分含有量逐漸升高；儲(chǔ)藏后期（約6～12 個(gè)月），由于包裝后密閉、干燥的環(huán)境抑制了微生物的活動(dòng)，佛手柑內(nèi)酯和羌活醇含有量不再增加，反而隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸損耗，所以含有量又逐漸降低。

4.2 包裝、儲(chǔ)存條件的影響 目前，絕大多數(shù)有關(guān)中藥材適宜儲(chǔ)存條件的研究在考察藥材內(nèi)在質(zhì)量時(shí)以藥典含有量指標(biāo)為依據(jù)，蘇娟等［19］以毛蕊花糖苷的含有量為依據(jù)研究了不同包裝熟地黃飲片的穩(wěn)定性；鐘凌云［20］以葛根素含有量為指標(biāo)考察葛根飲片的適宜包裝儲(chǔ)藏方法；王聰穎等［21］對(duì)比了蜜炙紫菀小包裝飲片與散裝飲片中紫菀酮的含有量變化。但中藥材性質(zhì)復(fù)雜，成分多樣，各內(nèi)在成分隨儲(chǔ)藏條件變化的規(guī)律并不完全一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，包裝材料、儲(chǔ)藏溫度、儲(chǔ)藏光照對(duì)6 種成分含有量的影響各不相同。包裝材料主要影響綠原酸、紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素的含有量；儲(chǔ)藏溫度對(duì)阿魏酸和佛手柑內(nèi)酯含有量的影響較大；儲(chǔ)藏光照條件主要影響綠原酸和紫花前胡苷的含有量。所以，篩選藥材的適宜包裝、儲(chǔ)藏條件時(shí)，不宜只以《中國(guó)藥典》 含有量指標(biāo)為依據(jù)，而應(yīng)綜合考慮多個(gè)成分隨處理因素變化的規(guī)律。

4.3 最佳儲(chǔ)存條件 雖然不同的包裝、儲(chǔ)藏條件對(duì)羌活中6 種成分的含有量具有不同的影響，但以指標(biāo)成分總量綜合來看，塑料袋包裝、光照條件下儲(chǔ)存更適宜于羌活飲片內(nèi)在質(zhì)量的保存；儲(chǔ)藏溫度對(duì)指標(biāo)成分總量的影響不太明顯，但塑料袋包裝的羌活飲片中，低溫儲(chǔ)存的其指標(biāo)成分總量波動(dòng)最小。所以，可將塑料袋包裝、低溫儲(chǔ)存作為組合條件用于羌活飲片的合理儲(chǔ)存。

課題組前期研究也顯示，相較于避光儲(chǔ)藏，光照條件下儲(chǔ)藏的羌活其揮發(fā)油損耗更多。光照儲(chǔ)存有利于綠原酸和紫花前胡苷的保存，避光儲(chǔ)存則能減少羌活揮發(fā)油的損失。但選擇適宜儲(chǔ)存條件的目的并不是保證藥材中某些成分的含有量，而是保存藥效。從保存藥效的角度分析，羌活的主要藥效成分是揮發(fā)油和香豆素類［22-23］，其總揮發(fā)油具有明顯的抗炎作用和鎮(zhèn)痛作用［24］，保證揮發(fā)油含有量更有意義，所以實(shí)際生產(chǎn)中羌活還是應(yīng)該避光儲(chǔ)存。