■王智勇 曾建國 劉 薇*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128；2.中獸藥湖南省重點實驗室，湖南長沙410128）

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第217 號公告批準(zhǔn)了源自金銀花中的綠原酸作為具有促進(jìn)肉仔雞生長、提高飼料轉(zhuǎn)化效率、增強機體抗氧化能力、改善腸道菌群結(jié)構(gòu)等功效的新型飼料添加劑；同時綠原酸被應(yīng)用于水產(chǎn)飼料行業(yè)也有多年歷史[1]。而異綠原酸在結(jié)構(gòu)上比綠原酸多一個咖啡?；鶊F，具有抗氧化、抗炎、抗病毒等重要生物活性，以及調(diào)血脂、抗纖維化、抗動脈粥樣硬化、抑制組胺釋放、抑制平滑肌收縮等臨床應(yīng)用價值[2]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，天然異綠原酸的來源十分廣泛，因其屬于縮酚酸，可通過熱回流提取法、大孔樹脂吸附法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、酶解法等提取得到；而化學(xué)合成的異綠原酸往往副產(chǎn)物較多且分離困難，其合成工藝也往往成本太高。所以從天然植物中提取異綠原酸仍是研究的主流，但目前針對異綠原酸的提取工藝研究仍處于相對薄弱階段。

1 異綠原酸化學(xué)結(jié)構(gòu)

異綠原酸類化合物是經(jīng)植物體內(nèi)有氧呼吸過程中的莽草酸途徑，由咖啡酸(caffeic acid)與奎尼酸(quinic acid)生成的縮酚酸，屬于二咖啡?？鼘幩犷惢衔?。理論上，兩個咖啡酰以不同的結(jié)構(gòu)方式結(jié)合在奎尼酸上，有6 種同分異構(gòu)體，但至今從天然植物中發(fā)現(xiàn)的二咖啡?？鼘幩犷惢衔镏挥?種：1，3-二咖啡?？崴幔ㄈR薊素）、3，4-二咖啡?？崴幔ó惥G原酸B）、3，5-二咖啡?？崴幔ó惥G原酸C）、4，5-二咖啡酰奎尼酸（異綠原酸A），并且目前研究最多的是后3 種，圖1為異綠原酸A、B、C的結(jié)構(gòu)式。

2 異綠原酸生物活性

近年來，異綠原酸的抗炎癥、抗菌、抗病毒、抗氧化、保護(hù)肝臟等生物活性已逐漸被人們所熟知[3-9]。除此之外，國外的一些研究還發(fā)現(xiàn)異綠原酸具有抗癌、治療急性肺損傷、抗鞭毛蟲、抑制遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)錄與翻譯、保護(hù)代謝系統(tǒng)、抑制平滑肌收縮、促凝血、降血壓等臨床藥用價值。

圖1 異綠原酸A（1）、B（2）、C（3）的結(jié)構(gòu)式

2.1 抗炎癥

大量研究表明，異綠原酸具有良好的體內(nèi)外抗炎活性。Kimura等[10]研究發(fā)現(xiàn)，三種不同異構(gòu)體的異綠原酸能抑制人體外周血多形核白細(xì)胞A23187誘導(dǎo)鈣離子產(chǎn)生白三烯B4，同時異綠原酸B 又能刺激分泌前列腺素E2，這兩方面作用足以表明異綠原酸具有良好的抗炎活性。楊敏[11]對佐劑關(guān)節(jié)炎小鼠進(jìn)行動物實驗研究，發(fā)現(xiàn)分離自苦丁茶中的異綠原酸類化合物對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有良好的治療效果。侯彩平[12]利用LPS誘導(dǎo)的炎癥狀態(tài)下斑馬魚模型，證明異綠原酸A能降低斑馬魚體內(nèi)一氧化氮和活性氧的產(chǎn)生，緩解卵黃囊水腫和降低斑馬魚心率，此作用具有濃度依賴性。異綠原酸A在實驗濃度范圍（5～40 pg/mL）內(nèi)能使CuSO4誘導(dǎo)的斑馬魚體內(nèi)測線巨噬細(xì)胞數(shù)減少，且減少的數(shù)量隨異綠原酸A濃度的升高而增多。倪付勇等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，異綠原酸A和異綠原酸C能抑制白細(xì)胞遷移和超氧陰離子產(chǎn)生的炎癥過程，具有良好的體外抗炎作用。

2.2 抗菌

異綠原酸對細(xì)菌和真菌均具有一定的抑制效果。從結(jié)構(gòu)上來看，異綠原酸比綠原酸更對稱，極性更小，且包含兩個咖啡?；蛊溆懈嗔u基，因此可以推測，異綠原酸比綠原酸破壞細(xì)菌細(xì)胞壁、膜結(jié)構(gòu)的能力更強，抑菌效果更好。周志娥等[14]發(fā)現(xiàn)綠原酸和異綠原酸A 對大腸桿菌的抑制作用強于苯甲酸鈉和山梨酸鉀。楊岸奇等[15]發(fā)現(xiàn)綠原酸對一些真菌也有抑制作用，如新生隱球菌、念珠菌和煙曲霉。當(dāng)綠原酸奎寧基團上的羥基與游離氨基結(jié)合時，對真菌的抑制作用更強。李更森[16]發(fā)現(xiàn)，異綠原酸可以降低體外構(gòu)建的野生型銅綠假單胞菌-煙曲霉混合生物膜細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。異綠原酸與兩性霉素B+美羅培南聯(lián)合應(yīng)用，可明顯提高混合生物膜內(nèi)煙曲霉菌和銅綠假單胞菌的殺滅效果，即對真菌及細(xì)菌的殺滅均具有顯著的協(xié)同作用。羅勁等[17]發(fā)現(xiàn)異綠原酸在體外不能殺死煙曲霉生物被膜內(nèi)菌體，但可對煙曲霉早期和成熟期生物被膜有破壞作用，其作用呈濃度依賴性。張瑾鈺等[18]通過在體外復(fù)制煙曲霉的生物膜模型，證明了異綠原酸對體外煙曲霉生物膜形成有抑制作用，因此具有一定的抗真菌活性。

2.3 抗病毒

雖然許多文獻(xiàn)中均提到異綠原酸具有抗病毒活性，但通過實驗證明異綠原酸抗病毒作用的文獻(xiàn)依然較少。有研究表明，綠原酸類物質(zhì)可以通過增強DNA自我保護(hù)來抑制HBV病毒感染，這對乙型肝炎病毒的體內(nèi)復(fù)制具有很好的阻礙作用。在此基礎(chǔ)上，楊岸奇等[15]的研究表明，起抗HBV病毒作用的綠原酸類物質(zhì)主要是異綠原酸C和異綠原酸A。付運星[19]建立了犬瘟熱病毒感染犬腎細(xì)胞(MDCK)模型，證明了異綠原酸A可以通過影響TLR3信號通路，在體外成功抵抗犬瘟熱病毒感染，但無法對犬瘟熱病毒進(jìn)行進(jìn)一步滅活以及無法預(yù)防犬瘟熱病毒對動物機體的感染，即異綠原酸A可以作為潛在抗犬瘟熱病毒的物質(zhì)。Cao等[20]等通過建立細(xì)胞和動物模型，證實食品中提取的抗氧化劑異綠原酸C可通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽的氧化還原穩(wěn)態(tài)，防止腸病毒71（ev71）感染，從而體現(xiàn)異綠原酸C 的抗病毒作用。另外，美國加州大學(xué)Robinson等[21]研究發(fā)現(xiàn)，異綠原酸A不僅抑制能HIV-1整合酶的活性，還能阻礙HIV-1病毒在組織中的復(fù)制過程，其治療指數(shù)高于100。

2.4 抗氧化

由于異綠原酸與綠原酸在結(jié)構(gòu)上很相似，所以同樣具有良好的體內(nèi)外抗氧化活性。侯彩平[12]采用DPPH法、水楊酸比色法、鄰苯三酚自氧化法及還原力測定法來進(jìn)行體外抗氧化實驗,利用皮膚熒光斑馬魚模型研究異綠原酸的體內(nèi)抗氧化活性。結(jié)果表明，異綠原酸A對自由基有較好的清除能力，有良好的體內(nèi)體外抗氧化活性，并且發(fā)現(xiàn)隨著異綠原酸A濃度的增加，其相對抗氧化能力逐漸下降。楊岸奇等[15]建立了四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型，并對其原位及其t-BOOH介導(dǎo)的心臟和肝臟勻漿進(jìn)行化學(xué)發(fā)光實驗，證明綠原酸的幾種同分異構(gòu)體均具有一定的抗氧化作用。Iwai等[22]通過實驗證明異綠原酸C是綠咖啡豆7種咖啡?？鼘幩犷惢衔镏锌寡趸钚宰詈玫?。還有研究表明，3,5-二咖啡?？鼘幩嵬ㄟ^激活pi3k/akt 信號通路保護(hù)h9c2心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡[23]。Xia等[24]將化學(xué)分析和生物活性鑒定相結(jié)合，用DPPH、ABTS等自由基清除實驗得出艾蒿中的綠原酸、異綠原酸B、A、C、麥角酰二醇、乙酰西丁和尤帕替林等成分具有較強的抗氧化活性。Liu等[25]用DPPH自由基清除活性測定法評價50%金銀花甲醇提取物抗氧化活性。結(jié)果表明，該提取物的抗氧化活性與指紋圖譜中的異綠原酸B、異綠原酸C、異綠原酸A及木犀草苷四峰密切相關(guān)。

2.5 增強肝功能及保肝護(hù)肝

近年來，國內(nèi)外的學(xué)者在異綠原酸類物質(zhì)對增強肝功能代謝及其保護(hù)作用方面研究較多。楊岸奇等[15]在其研究中發(fā)現(xiàn)，異綠原酸類物質(zhì)能修復(fù)由巨噬細(xì)胞和氯仿引起的肝損傷，并通過實驗發(fā)現(xiàn)囊吾提取物異綠原酸B可以緩解肝臟脂肪過氧化的過程，同時還發(fā)現(xiàn)10 μg/mL 的異綠原酸B 溶液的250 μg/mL 囊吾提取物溶液與對于降低由乙酰氨基酚注射引起的肝臟脂肪代謝障礙具有相當(dāng)?shù)男Ч?。Hao等[26]發(fā)現(xiàn)異綠原酸具有抗乙型肝炎作用，主要體現(xiàn)在：異綠原酸A的抗氧化性能和誘導(dǎo)細(xì)胞中血紅素氧合酶-1 可以達(dá)到對肝的保護(hù)作用。發(fā)現(xiàn)異綠原酸B能抑制氧化應(yīng)激，通過特定的信號通路抑制多種成纖維因子，對非酒精性脂肪性肝炎纖維化有顯著的保護(hù)作用。

特別是中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院劉鑫團隊，連續(xù)多次使用異綠原酸B 或C 對四氯化碳引起的小鼠肝損傷模型進(jìn)行研究，最終發(fā)現(xiàn)其相關(guān)信號通路，對肝炎纖維化的治療具有一定的臨床指導(dǎo)意義。2017年，劉鑫等[27]發(fā)現(xiàn)異綠原酸B(ICAB)對四氯化碳(CCl4)引起的小鼠急性肝損傷具有明顯地保肝降酶作用，其作用機制可能與參與調(diào)節(jié)其肝細(xì)胞中核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)信號通路、緩解氧化應(yīng)激相關(guān)。并且異綠原酸B在抗神經(jīng)退行性疾病方面優(yōu)于綠原酸也已被證實，這可能是因為異綠原酸B有更多的酚羥基。2019年，Liu等[28]又通過實驗證實，分離自兔耳草的異綠原酸B能通過Nrf2 抑制氧化應(yīng)激和通過mir-122/hif-1 信號通路抑制多種促纖維化因子，對非酒精性脂肪性肝炎的纖維化有顯著的保護(hù)作用。2020 年，Liu 等[29]的研究再次表明從紫菀中分離得到的異綠原酸A 可能通過抑制hmgb1/tlr4/nf-kappa 信號通路，來抵抗CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化。

2.6 抗癌

異綠原酸類物質(zhì)對某些癌癥具有一定的治療或輔助治療的作用。Yu 等[30]研究了金銀花提取物異綠原酸C 抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞系(tnbc) mda-mb-231(egfr)水平升高的分子機制，發(fā)現(xiàn)了異綠原酸C(icac)對表皮生長因子受體(egfr)誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(emt)和mda-mb-231 細(xì)胞侵襲的抑制作用依賴于egfr/磷脂酶c(plc)/extracellular regulated protein kinase 1(erk1)/slug信號通路的結(jié)論。此結(jié)論可以為下一步治療tnbc的策略提供線索。楊岸奇等[15]將其對綠原酸及其衍生物(包括異綠原酸)在加強抗癌藥物作用效果方面的研究開發(fā)成了專利，并闡明了其機理是綠原酸及其衍生物可增強癌細(xì)胞對抗癌藥物的敏感程度，從而使抗癌藥物能更好地發(fā)揮療效。

2.7 治療急性肺損傷

Wang等[31]研究表明異綠原酸A對LPS誘導(dǎo)的nfb/nlrp3信號通路的蛋白質(zhì)表達(dá)有抑制作用，可逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的作用，是治療急性肺損傷的有前途的單體，為今后急性肺損傷的治療研究提供參考。

2.8 平滑肌抑制作用

異綠原酸類物質(zhì)對平滑肌抑制作用體現(xiàn)在能解除支氣管平滑肌痙攣和抑制消化道平滑肌收縮。楊岸奇等[15]分別利用電流和乙酰膽堿刺激豚鼠回腸，發(fā)現(xiàn)異綠原酸類物質(zhì)對抑制回腸平滑肌收縮有一定的抑制作用，且此作用與罌粟堿作用相似。

2.9 抗鞭毛蟲

Zhang 等[32]研究表明，從艾蒿及其酯類衍生物中分離得到的3,5-二咖啡酰奎寧酸具有抗藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的亮氨酸合成酶和潛在的抗賈第鞭毛蟲作用。

2.10 其他作用

張瓊光等[33]證明，苦丁茶中異綠原酸部位能顯著改善實驗性2 型糖尿病小鼠的糖脂代謝紊亂。湯潔等[34]發(fā)現(xiàn)金銀花中的綠原酸、異綠原酸具有參與人體血小板凝集和凝血因子的生成等作用。Oh 等[35]研究表明596 μmol/L 的異綠原酸A 和534 μmol/L 的異綠原酸C具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性，這表明異綠原酸類化合物可能具有降低血壓的作用。

3 異綠原酸提取工藝

文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，異綠原酸類化合物主要來源于金銀花、苦丁茶、甜葉菊、艾蒿、兔耳草、丁公藤等天然植物。近年來，針對不同天然植物來源的異綠原酸，研究學(xué)者們分別開發(fā)了如熱回流提取法、大孔樹脂吸附法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、酶解等提取方法。但相對于綠原酸來說，異綠原酸的提取工藝研究依然較少。

異綠原酸類化合物極性較大，一般需要選用水、甲醇、乙醇等大極性的提取溶劑進(jìn)行提取。Scharlack等[36]發(fā)現(xiàn)，使用醇溶劑浸取得到的綠原酸類化合物具有較好的穩(wěn)定性，若同時采用超聲輔助浸取可提高該類化合物的得率。倪付勇等[13]首先對金銀花用70%的乙醇進(jìn)行提取，提取液再用大孔樹脂吸附法進(jìn)行分離和富集，最后利用制備色譜制備出高含量的咖啡?？鼘幩犷惢衔铮伺e可經(jīng)濟、快速、有效地得到異綠原酸A、B、C，為金銀花中異綠原酸類化合物的分離開辟了新思路。楊敏[11]設(shè)計了正交試驗對苦丁茶中異綠原酸水提取工藝進(jìn)行條件優(yōu)化，并采用高效液相色譜測定各工藝參數(shù)下得到的異綠原酸總含量。最終優(yōu)化出的提取工藝能將總異綠原酸的含量提高到82.30%。汪愛國等[37]采用自制螺旋管分餾萃取裝置連續(xù)萃取分離了金銀花粗粉中的綠原酸和總分異綠原酸。以水為流動相，乙酸乙酯為固定相，每個循環(huán)周期泵入原料液20 mL，流動相50 mL，反推固定相40 mL在該條件下，綠原酸和總分異綠原酸分離完全，最終得到總分異綠原酸干燥產(chǎn)品，純度為82.3%，回收率為90%。由于該套設(shè)備結(jié)構(gòu)簡單，操作簡便，連續(xù)制備量可達(dá)數(shù)千克每日，因此有利于工業(yè)化放大，可同時完成多級逆流萃取、分餾萃取和色譜洗脫等多種分離手段。

Sun等[38]采用高速逆流色譜(hsccc)和液-液萃取相結(jié)合的方法，成功地從中藥材中分離出異綠原酸A和異綠原酸B。以乙酸乙酯和-己烷-乙酸乙酯-水(3∶3∶4和1∶5∶4，V/V/V)為液-液萃取溶劑體系，去除混合物中的高、低極性雜質(zhì)。60 g的乙醇提取物經(jīng)溶劑分配精制得到1.7 g的富集部分，其中480 mg的異綠原酸A (純度98.3%)52.5 mg和37.6 mg的異綠原酸B(純度96.2%)。Qiu等[39]采用酶微反應(yīng)器與高效液相色譜相結(jié)合的方法，建立了一種在線篩選方法。并用該在線篩選系統(tǒng)從金銀花葉片中分離得到3個化合物，分別為異綠原酸B、1,5-二咖啡酰奎寧酸和異綠原酸C。該方法對中草藥中葡萄糖苷酶抑制劑的快速實時捕獲具有很大的潛力。Jiang等[40]開發(fā)了一種以離子液體為基礎(chǔ)的超聲波輔助提取技術(shù)(il-uae)，該技術(shù)是一種可持續(xù)地從杭白菊中提取和分離異綠原酸C的新方法。

4 異綠原酸含量檢測

由于異綠原酸的含量檢測一般需要多種對照品，并且異綠原酸對照品價格比較昂貴，所以除了少量研究是開發(fā)單個異綠原酸的檢測方法外，目前主流的檢測方法為王智民等[41]提出的一測多評的多指標(biāo)質(zhì)控模式。

甘玉等[42]以乙腈-0.1%磷酸(20∶80)為流動相，采用高效液相色譜儀和紫外檢測器對金銀花中異綠原酸A的含量進(jìn)行測定。結(jié)果表明，在9.6～96 μg/mL范圍內(nèi)，異綠原酸A 濃度和峰面積的線性關(guān)系良好，異綠 原 酸A 的 平 均 回 收 率 為102.07%(n=6)，RSD 為1.02%。該方法符合方法學(xué)考察的規(guī)定，可作為金銀花醇提液中異綠原酸A單個含量測定的方法。

付曉等[43]建立了同時測定甜葉菊中綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸C三種化合物的HPLC分析方法，并完成了此3 種化合物在根、莖、葉中的含量測定。結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，可用于同時檢測甜葉菊中3種異綠原酸類化合物。陳嘉媛等[44]建立了驅(qū)蟲斑鳩菊中異綠原酸A 和異綠原酸C 含量的同時檢測方法，該方法采用Shim-pack VP-ODS C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-乙腈-0.4%磷酸溶液（13.5∶13.5∶73）為流動相，流速為1 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長323 nm，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果證明該方法可用于同時檢測驅(qū)蟲斑鳩菊中異綠原酸A 和異綠原酸C的含量，并可為鑒定驅(qū)蟲斑鳩菊的藥材質(zhì)量提供幫助。張民達(dá)等[45]建立了一種同時測定甜葉菊原料中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C等6種綠原酸類化合物的HPLC分析方法。此一測多評法以綠原酸為內(nèi)標(biāo)，采用斜率校正法建立其與甜葉菊中其他5 種綠原酸類化合物及槲皮苷在相同條件下的相對校正因子，以此求得這幾種物質(zhì)的含量，并同時采用外標(biāo)法進(jìn)行同步驗證。結(jié)果表明此一測多評法準(zhǔn)確性高，與外標(biāo)法所得結(jié)果無顯著差異，可用于甜葉菊原料藥材的質(zhì)量控制。印酬等[46]建立了測定山銀花中新綠原酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C含量的HPLC分析方法，并用其觀察了貴州不同產(chǎn)地的10 批山銀花中的4 種異綠原酸的含量。徐小昆等[47]采用高效液相色譜方法對丁公藤屬植物中東莨菪苷、東莨菪素、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C等6種有效成分含量進(jìn)行同時測定，結(jié)果表明該一測多評法分離效果較好，簡便可行，適用于丁公藤類藥材的質(zhì)量控制。

除此之外，特征圖譜已經(jīng)在中藥材及其提取物方面有了廣泛的應(yīng)用，也可作為中藥材及其提取物在溯源上的質(zhì)量檢驗指標(biāo)。因此，異綠原酸在質(zhì)量控制方面亦可采用特征圖譜，從源頭控制其產(chǎn)品優(yōu)質(zhì)、安全、無公害，并保障其產(chǎn)品的可控性、規(guī)范化。