■何曉濤 陳杰茹 王 堅(jiān) 王學(xué)梅 韓蒙蒙 朱 昊 陳韜羽 楊雨輝

（海南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，海南海口570228）

矮象草（Pennisetum purpereum）是一種適于紅壤地區(qū)種植的優(yōu)質(zhì)禾本科多年生新飼草品種，生長(zhǎng)于熱帶和亞熱帶地區(qū)。該品種由美國于20 世紀(jì)80 年代培育得到，廣西首先引進(jìn)，目前在我國南方地區(qū)已得到大量種植。因其分蘗多、產(chǎn)量高、品質(zhì)好、適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)、飼喂效果好的經(jīng)濟(jì)效益特點(diǎn)，現(xiàn)已成為重要的飼草資源[1]。刈割的矮象草通常通過調(diào)制成干草或青貯飼料的方式保存，但南方天氣潮濕多雨，矮象草莖粗且含水量高，因此不易調(diào)制為干草。而青貯不僅受天氣因素影響小，還能有效保存優(yōu)質(zhì)多汁青草飼料，更能在一定程度上降解牧草中的纖維素含量，提升其營養(yǎng)價(jià)值[2]，因此多采用青貯的方式貯存矮象草。青貯是一個(gè)十分復(fù)雜的生化反應(yīng)過程，有很多微生物的參與，其中起主要作用的微生物是乳酸菌，其生長(zhǎng)和繁殖需要足夠的可溶性碳水化合物用以提供必要的物質(zhì)保障[3]。Monika 等[4]研究表明，貝萊斯芽孢桿菌具有降解粗纖維的作用，可以將纖維素降解成還原性糖，從而增加可溶性碳水化合物，提升發(fā)酵底物的含量。纖維素酶是由多種纖維素水解酶組成的復(fù)雜酶系，可以將纖維素分解成寡糖或單糖[5]，也具有增加發(fā)酵底物含量的作用。李蘇新等[6]研究發(fā)現(xiàn)，通過添加3%雙歧乳酸桿菌增加乳酸菌含量，能有效提升矮象草青貯質(zhì)量。目前，有關(guān)如何提高矮象草青貯品質(zhì)的研究仍然較少，因此，本試驗(yàn)旨在研究添加貝萊斯芽孢桿菌、植物乳桿菌和纖維素酶對(duì)矮象草青貯效果的影響，為矮象草青貯飼料的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

青貯原料：海南省儋州市熱帶農(nóng)業(yè)基地種植的矮象草。

青貯添加劑：貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis，Vel，從白蟻腸道中篩選得到）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，Lab，由海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選得到）、纖維素酶（cellulase，Ce，9012-54-8，10 000 U/g，上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以生長(zhǎng)10周的矮象草為原料，設(shè)置6個(gè)不同的處理組：對(duì)照（CK）組，貝萊斯芽孢桿菌（VEL，3%）組，植物乳桿菌（LAB，3%）組，貝萊斯芽孢桿菌+植物乳桿菌（VEL+LAB，1.5%+1.5%）組，纖維素酶（CE，3%）組和纖維素酶+植物乳桿菌（CE+LAB，1.5%+1.5%）組。細(xì)菌添加量為2×106CFU/g鮮草，纖維素酶添加量為30 U/g鮮草，將菌液和纖維素酶分別稀釋到6.7×107CFU/mL和1 000 U/mL，3%添加量即為30 mL/kg，1.5%的添加量即為15 mL/kg。青貯30 d，分別在青貯2、4、8、12、20、28 d后，開啟封裝袋取樣分析。每組3個(gè)重復(fù)[7-8]。

1.2.2 青貯飼料的調(diào)制

于試驗(yàn)前1 d的18：00刈割矮象草，過夜晾干，將其切碎成長(zhǎng)度2～3 cm大小，并混勻均分成6組，第1組作為空白對(duì)照組，加入30 mL/kg 的純化水，其他5 組分別按比例加入2×106CFU/g 的菌液和30 U/g 鮮草的纖維素酶，混勻，取180 g 裝進(jìn)聚乙烯真空塑料袋（20 cm×30 cm）中，并用真空抽氣封口機(jī)排氣封口[9-10]。

1.2.3 感官鑒定

根據(jù)青貯飼料品質(zhì)評(píng)分表（見表1），參照GB/T 10220—2012/ISO 6658：2005《感官分析 方法學(xué) 總論》對(duì)樣品的水分、色澤、質(zhì)地和氣味進(jìn)行分?jǐn)?shù)統(tǒng)計(jì)，初步判定矮象草青貯效果。

1.2.4 微生物計(jì)數(shù)

1.2.4.1 Vel計(jì)數(shù)

使用CMC-Na 固體培養(yǎng)基，配制好的培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃高壓滅菌后倒入直徑90 mm 培養(yǎng)皿中制成CMC-Na瓊脂平板，密封室溫放置1～3 d，確保無污染。采用五點(diǎn)取樣法取20 g青貯飼料樣品放在180 mL生理鹽水中，在室溫條件下以180 r/min 的轉(zhuǎn)速振蕩浸泡2 h，得到浸泡液；取均勻浸泡液1 mL，置于10 mL的無菌試管中進(jìn)行梯度稀釋，稀釋10～107倍，取20 μL點(diǎn)滴在平板上，37 ℃培養(yǎng)18 h計(jì)數(shù)。

表1 感官鑒定評(píng)分

1.2.4.2 Lab計(jì)數(shù)[11]

使用MRS 固體培養(yǎng)基，倒入直徑90 mm 培養(yǎng)皿中制成MRS 瓊脂平板，密封室溫放置1～3 d，確保無污染。取均勻浸泡液1 mL，置于10 mL的無菌試管中進(jìn)行梯度稀釋，稀釋10～107倍，取20 μL 點(diǎn)滴在平板上，35 ℃厭氧培養(yǎng)18 h計(jì)數(shù)。

1.2.5 質(zhì)量指標(biāo)和營養(yǎng)指標(biāo)的測(cè)定

采用五點(diǎn)取樣法，取20 g 青貯飼料樣品放入70 mL純化水中，置于4 ℃冰箱靜置浸泡24 h，用濾紙過濾2遍，得到濾液，分裝為兩份，其中一份濾液A用來測(cè)定青貯飼料樣品的pH值[12]、氨態(tài)氮(ammonia-N，NH3-N，苯酚-次氯酸鈉法[13])、可溶性碳水化合物(Water soluable carbohydrate，WSC，蒽酮-硫酸法[14])；將另一份濾液經(jīng)高速冷凍離心機(jī)（Centrifuge 5810 R，Eppendorf）于10 000 r/min 離心5 min，取上清液再經(jīng)過0.25 μm 孔徑的有機(jī)濾膜過濾得到濾液B，采用LC-20A 型（島津，日本）高效液相色譜儀[色譜柱：型號(hào)Venusil XBP C18(2)，粒徑5 μm，孔徑100A，規(guī)格4.6 mm×250 mm，Agela, 中國；檢測(cè)器：SPDM20A；流動(dòng)相：1 mmol/L 磷酸二氫鈉溶液、甲醇；流速：1.0 mL/min；柱溫：26 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：217 nm；進(jìn)樣量：10 μL]測(cè)定乳酸（Lactic acid，LA）、乙酸（Acetic acid，AA）、丙酸（Propionic acid，PA）與丁酸（Butyric acid，BA）等有機(jī)酸含量（GB 5009.157—2016）。

將剩余樣品烘干粉碎，得到固體粉末，計(jì)算含水量，粉末過40 目篩后可用于測(cè)粗蛋白質(zhì)（Crude protein，CP，凱氏定氮法[15]）、中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（Acid detergent fiber，ADF，Van Soset分析法[16]）含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Duncan’s分析進(jìn)行多重比較，分析各組數(shù)據(jù)的差異顯著性，數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵品質(zhì)

2.1.1 感官鑒定(見表2)

表2 感官鑒定結(jié)果

經(jīng)過添加劑處理后，青貯的矮象草在色澤上能更大程度地保留原本的顏色，其中VEL 組、LAB 組和VEL+LAB組的顏色最好；質(zhì)地上也有所改善，相比對(duì)照組都未出現(xiàn)黏手現(xiàn)象；氣味上可聞出對(duì)照組有輕微腐敗的味道，CE 組和CE+LAB 組為正常酸味，而VEL組、LAB組和VEL+LAB組不僅有發(fā)酵的酸味，還帶有一點(diǎn)特殊的麥芽糖香味。因此，由感官鑒定可初步判斷，經(jīng)過添加劑處理后，矮象草的青貯質(zhì)量得到了提高，其中VEL+LAB組的青貯效果最好。

2.1.2 Vel和Lab濃度(見圖1)

由圖1a和圖1b所示，各組Vel和Lab數(shù)量的變化趨勢(shì)相同，分別在第12 d和第8 d時(shí)達(dá)到最大，之后逐漸減少，Vel在第28 d最少，Lab在第20 d達(dá)到最小值后，部分處理組出現(xiàn)了數(shù)量略微增加的現(xiàn)象，推測(cè)是對(duì)應(yīng)組出現(xiàn)了輕微漏氣所致。

2.1.3 pH值(見圖2)

圖1 不同處理組在不同青貯天數(shù)時(shí)Vel（a）和Lab（b）的數(shù)量統(tǒng)計(jì)

圖2 不同處理組在不同青貯天數(shù)時(shí)的pH值

如圖2 所示，VEL+LAB 組的pH 值降低速度最快且能達(dá)到較低的pH值，在第8 d達(dá)到最低pH值，能盡快抑制飼料中腐敗菌的活動(dòng)，減少營養(yǎng)物質(zhì)的流失。較低的pH值更容易保持青貯飼料的穩(wěn)定性，12 d后青貯飼料pH值出現(xiàn)一定程度的回升，穩(wěn)定性變差，但相比對(duì)照組，試驗(yàn)組的穩(wěn)定性得到了顯著性的提升。

2.1.4 NH3-N的濃度(見圖3)

如圖3 所示，隨著青貯時(shí)間的增加，處理組的NH3-N濃度整體呈增加趨勢(shì)，這與營養(yǎng)蛋白質(zhì)的降解損耗有關(guān)；相比對(duì)照組，試驗(yàn)組在青貯過程中基本都能保持較低濃度的NH3-N，其中VEL+LAB 組在28 d時(shí)濃度最低，其次是LAB組和CE組，均與對(duì)照組差異極顯著(P＜0.01)，說明其減少了蛋白質(zhì)的損耗。

2.1.5 有機(jī)酸的含量(見表3～表6)

如表3～表6 所示，CK 組和VEL 組在12 d 時(shí)乳酸含量達(dá)到最大，但VEL 組比CK 組乳酸積累的速度更快，其他處理組乳酸含量積累速度均有所提升，且在第8 d 時(shí)達(dá)到最大；乙酸積累相比乳酸會(huì)有一些滯后性，因?yàn)榍噘A過程中有一部分乳酸會(huì)轉(zhuǎn)化為乙酸；CK組和CE 組的丙酸含量在第28 d 時(shí)最大，VEL 組和LAB組在第20 d達(dá)到最大，VEL+LAB組和CE+LAB組在第12 d達(dá)到最大，隨后呈緩慢降低的趨勢(shì)；在整個(gè)青貯過程中，CK組在4、8、28 d均檢測(cè)到丁酸，VEL+LAB組未檢測(cè)到丁酸，VEL組、LAB組和VEL+LAB組有所改善，CE 組在12 d 和20 d 時(shí)檢測(cè)到較多的丁酸。說明除了CE組，其他處理組青貯質(zhì)量均有所改善。

圖3 不同處理組在不同青貯天數(shù)時(shí)NH3-N的濃度

2.2 營養(yǎng)成分

2.2.1 WSC含量(見圖4)

如圖4所示，所有處理組的WSC濃度都隨著青貯時(shí)間的增加而減少，這與青貯飼料中微生物的活動(dòng)有關(guān)，WSC為微生物提供了能量和營養(yǎng)物質(zhì)。第4 d時(shí)VEL組的WSC濃度最高，CE組和CE+LAB組最低，可能是因?yàn)橄啾扔贑e的直接作用，Vel需要增殖到一定濃度時(shí)才能對(duì)纖維素的分解達(dá)到較快的速度，而Vel的增殖需要時(shí)間，因此VEL組的WSC含量大量減少的過程比CE組和CE+LAB組滯后；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，可溶性碳水化合物被大量消耗，最后達(dá)到一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。

表3 不同處理組在不同青貯天數(shù)時(shí)發(fā)酵液中乳酸的含量(mg/mL)

表4 不同處理組在不同青貯天數(shù)時(shí)發(fā)酵液中乙酸的含量(mg/mL)

表5 不同處理組在不同青貯天數(shù)時(shí)發(fā)酵液中丙酸的含量(mg/mL)

表6 不同處理組在不同青貯天數(shù)時(shí)發(fā)酵液中丁酸的含量(mg/mL)

圖4 不同處理組在不同青貯天數(shù)時(shí)WSC的濃度

2.2.2 CP含量(見表7)

如表7所示，青貯20 d內(nèi)粗蛋白質(zhì)含量呈緩慢減少的趨勢(shì)，但各組無顯著性差異，到第28 d 時(shí)青貯飼料穩(wěn)定性變差，微生物開始活動(dòng)，粗蛋白質(zhì)含量降解速度加快，其中CE+LAB 組、CE組和CK組降解最多，呈顯著性差異；VEL+LAB 組降解最少，無顯著性差異，這可能是因?yàn)榍噘A時(shí)形成較低pH 的環(huán)境能更好地抑制了微生物的活動(dòng)。

2.2.3 NDF含量(見表8)

如表8 所示，青貯后CK 組、VEL 組、VEL+LAB 組和CE組NDF 降解較少，無顯著性差異；到第28 d時(shí)，LAB 組和CE+LAB 組降解較多，呈顯著性差異。與CK 組相比，CE 組和CE+LAB 組NDF 降解較多，呈顯著性差異。這一定程度上反映了添加Lab 對(duì)NDF 降解具有一定的促進(jìn)作用。

2.2.4 ADF含量(見表9)

如表9 所示，青貯前后，所有處理組的ADF 含量均呈下降趨勢(shì)，但CK 組和VEL 組的ADF 降解不顯著，其他試驗(yàn)組的ADF 降解均呈顯著性差異，說明添加Vel、Lab 和Ce 均對(duì)ADF 降解具有一定的促進(jìn)作用。

表7 不同處理組在不同青貯天數(shù)時(shí)粗蛋白質(zhì)的含量(%)

表8 不同處理組在不同青貯天數(shù)時(shí)中性洗滌纖維的含量(%)

表9 不同處理組在不同青貯天數(shù)時(shí)酸性洗滌纖維的含量(%)

3 討論

青貯飼料的pH 值、含水量、可溶性碳水化合物、乳酸以及丁酸等都是衡量其品質(zhì)的指標(biāo)。阿依古麗等[17]研究發(fā)現(xiàn)，pH 值降低到4.2 以下可以殺死幾乎所有的腐敗微生物，提高青貯飼料的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)保存時(shí)間；另一方面，青貯飼料的pH值受含水量和可溶性碳水化合物的影響，高海娟等[18]研究表明，含水量過高時(shí)梭狀桿菌大量增殖，抑制乳酸菌的增殖生長(zhǎng)，從而影響pH 值的降低，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果相一致。Amer等[19]研究表明，可溶性碳水化合物是微生物增殖生長(zhǎng)的底物，其含量過低時(shí)也會(huì)影響乳酸菌的增殖，從而導(dǎo)致pH 值難以降低，影響青貯飼料品質(zhì)。在一定范圍內(nèi)，提高可溶性碳水化合物含量，有助于乳酸菌的增殖和發(fā)酵；還可通過直接添加乳酸菌來加速發(fā)酵過程，從而加速青貯飼料pH值的下降，快速抑制腐敗微生物的活動(dòng)，減少營養(yǎng)損失，本試驗(yàn)添加了乳酸菌的試驗(yàn)組青貯質(zhì)量均有所提高，與前人研究相符。李改英等[20]研究表明，蛋白質(zhì)分解會(huì)導(dǎo)致氨態(tài)氮含量的增高，丁梭酸菌的發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生丁酸，優(yōu)質(zhì)的青貯飼料應(yīng)該含有較少的氨態(tài)氮和丁酸，本試驗(yàn)處理組相比對(duì)照組，除CE 組外，氨態(tài)氮和丁酸含量均有所下降。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，直接對(duì)矮象草進(jìn)行青貯的效果較差，這可能是因?yàn)榘蟛萸o干粗硬，青貯時(shí)難以通過擠壓來排盡空氣，且含水量、粗纖維含量高，可溶性碳水化合物含量低，導(dǎo)致青貯時(shí)難以壓實(shí)和排盡空氣，從而影響青貯效果；添加Lab 和Vel 均能提高青貯質(zhì)量，其中將Lab和Vel混合同時(shí)添加效果最好；但是添加Ce 的處理組效果相對(duì)差一些，可能是因?yàn)榇朔N纖維素酶對(duì)Lab具有抑制作用。

Bai 等[21]研究表明，微生物的活動(dòng)或使粗蛋白質(zhì)降解，而快速降低pH值可以抑制微生物的活動(dòng)，使青貯盡快達(dá)到穩(wěn)定期，從而減少粗蛋白質(zhì)的降解。Ni等[22]研究發(fā)現(xiàn)，添加乳酸菌能使其在青貯前期快速增加，從而產(chǎn)生大量乳酸，加快pH值的降低。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，添加Lab和Vel使pH值降低且加速了這一過程，粗蛋白質(zhì)的降解率也相應(yīng)降低，保留了更多的營養(yǎng)物質(zhì)。Uddin 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，提高青貯飼料中粗纖維的降解率，有利于增加反芻動(dòng)物的采食率，從而提高生產(chǎn)性能，本次試驗(yàn)各處理組的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的降解率都有所提高，因?yàn)樘砑拥腣el 和Ce 均具有降解粗纖維的作用。另外，Xu 等[24]研究表明，Lab也有降解粗纖維的作用，纖維素的降解能提高可溶性糖的含量，增加了乳酸菌的生長(zhǎng)底物，加快乳酸菌的繁殖，從而使pH值快速降低，提高青貯品質(zhì)。

4 結(jié)論

矮象草直接青貯質(zhì)量較差，添加Vel、Lab和Ce均能提高青貯品質(zhì)，其中同時(shí)添加Vel 和Lab 的效果最好，添加Ce 腐敗味道較重?？梢圆捎眉哟骎el 和Lab的添加量、碾壓莖干、延長(zhǎng)晾曬時(shí)間和添加玉米粉等方法解決難以排盡莖干空氣、含水量過高和可溶性碳水化合物不足的問題，進(jìn)一步提高青貯品質(zhì)。