■衛(wèi)育良 竇秀麗 梁萌青* 徐后國

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島266071；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，山東青島266237）

纈氨酸是一種重要的支鏈氨基酸，不但參與體內(nèi)蛋白質(zhì)的組成，而且參與蛋白質(zhì)的合成與分解代謝[1]。作為魚類的10 種必需氨基酸之一，之前的研究表明，飼料中纈氨酸不足，會顯著影響尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)[2]、美國紅魚(Sciaenops ocellatus)[3]、團頭魴(Megalobrama amblycephala Yih, 1955)[4]、草魚(Ctenopharyngodon idella Valenciennes)[5]等魚類的生長，表明飼料中適宜的纈氨酸水平對魚類生長具有重要意義。但是，這些研究主要集中在小規(guī)格的魚苗及魚種階段，即魚的初重小于50 g，對于體重超過100 g 的大規(guī)格魚育成階段的氨基酸需求研究較少。姚林杰等[6]研究發(fā)現(xiàn)，即使攝食配方相同的飼料，在不同生長階段，團頭魴肌肉所含的包括纈氨酸在內(nèi)的必需氨基酸含量也有差異，并據(jù)此猜測魚類在不同生長階段，對飼料必需氨基酸的需求不同。這一猜測在斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)上得到證實，王學(xué)武[7]的研究表明，22 g 的小規(guī)格斜帶石斑魚對賴氨酸的需求量為3.04%飼料干物質(zhì)(6.33%飼料蛋白)，而102 g 的大規(guī)格斜帶石斑魚對賴氨酸的需求量則為2.61%飼料干物質(zhì)(5.8%飼料蛋白)，同樣的，在蛋氨酸上，也發(fā)現(xiàn)不同規(guī)格的斜帶石斑魚必需氨基酸需求量不同。這表明，要構(gòu)建魚類精準的氨基酸營養(yǎng)需求數(shù)據(jù)庫，不但要考慮小規(guī)格苗種階段的纈氨酸需求量，還需要考慮大規(guī)格養(yǎng)成階段的需求量。

花鱸(Lateolabrax japonicus)在我國南北方均有養(yǎng)殖，是一種重要的海水養(yǎng)殖魚類，其纈氨酸的需求量已在初重8 g的小規(guī)格上進行研究[8]。因此，本試驗擬以(182.33±1.08) g 的大規(guī)格花鱸為研究對象，通過攝食生長試驗，進一步研究大規(guī)格花鱸的纈氨酸需求量，以期獲得花鱸精準的纈氨酸需求數(shù)據(jù)，為花鱸商品飼料的研發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗配制6 組粗蛋白質(zhì)約為42%、粗脂肪約為7.5%的等氮等脂的基礎(chǔ)飼料(見表1)。基礎(chǔ)飼料的完整蛋白以魚粉、玉米蛋白和明膠為蛋白源，剩余蛋白以混合晶體氨基酸補充，其中，晶體必需氨基酸的添加以花鱸實際體蛋白換算成43%蛋白所含的必需氨基酸含量為參考[8]，使除纈氨酸以外的其他必需氨基酸達到魚體最適需求量(見表2)。然后，分別向基礎(chǔ)飼料中添加0、0.40%、0.80%、1.20%、1.60%和2.00%晶體纈氨酸，以谷氨酸作為等氮替代物。為減少添加過量晶體氨基酸引起飼料pH 值減小，制備過程中用6 mol/L 的NaOH 進行pH 調(diào)節(jié)，然后制成直徑為5 mm 的顆粒飼料，于55 ℃下烘干保存，并取樣測定每組飼料的纈氨酸含量，測定結(jié)果分別為1.12%、1.54%、1.96%、2.28%、2.54%和2.87%飼料干物質(zhì)。

1.2 試驗魚及飼養(yǎng)管理

本試驗選擇初重(182.33±1.08) g規(guī)格的花鱸為養(yǎng)殖對象，在浙江省寧波市象山港灣水產(chǎn)苗種有限公司進行養(yǎng)殖試驗。試驗開始前，將花鱸放入體積為(3 m×6 m×3 m)的海水浮式網(wǎng)箱中先進行2 周的暫養(yǎng)。然后，將花鱸隨機放入體積為(1.5 m×1.5 m×2.0 m)的網(wǎng)箱中，試驗分為6個處理組，每個處理組設(shè)3 個重復(fù)，每個網(wǎng)箱放入18 尾魚，進行為期10 周的養(yǎng)殖試驗。試驗期間，每天06:00 和18:00 喂魚，海水溫度在25～30 ℃，鹽度在19～22，pH值7.2～7.5，溶解氧含量大約在7 mg/L。

1.3 樣品采集及生化指標測定

1.3.1 樣品采集

表1 飼料配方組成及其營養(yǎng)水平（干物質(zhì))

表2 飼料中氨基酸組成分析(% 干物質(zhì))

養(yǎng)殖試驗開始時，隨機挑選5 尾花鱸作為初始魚，保存在-20 ℃冰箱，用于魚體成分分析。養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，饑餓24 h，對每個網(wǎng)箱的魚稱重和記數(shù)，用于生長性能相關(guān)指標的測定。然后，隨機從每個養(yǎng)殖網(wǎng)箱中取3 尾花鱸，取肌肉和肝臟，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰柜，用于后續(xù)氨基酸及酶活性分析。最后，每個網(wǎng)箱再取4 尾花鱸，保存在-20 ℃冰箱中，用于魚體成分分析。

1.3.2 生化指標分析

飼料和全魚樣品的水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和灰分測定。用105 ℃的烘箱將飼料和全魚樣品烘干至恒重，濕重法計算樣品的水分含量；用凱氏定氮法測定樣品的粗蛋白質(zhì)含量(VELP UDK142 automatic distillation unit，意大利)；用索氏抽提法測定樣品的粗脂肪含量(FOSS 索氏抽提儀SOXTEC 2050，瑞典)；灰分含量，先進行炭化，后用馬弗爐進行灰化測得。

飼料及肌肉氨基酸含量測定。根據(jù)飼料及肌肉蛋白質(zhì)含量，稱取適量的樣品，用6 mol/L 的HCl 在110 ℃下水解22～24 h后，用氨基酸分析儀測定（日立L-8900型氨基酸分析儀，日本）。

肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)酶活性測定采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒。肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶活性測定采用谷草轉(zhuǎn)氨酶測試盒（C010-2-1）；肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性檢測采用谷丙轉(zhuǎn)氨酶測試盒(賴氏法，C009-2-1)。

1.4 計算方法及統(tǒng)計分析方法

成活率(SR，%)=100×N1/N0

增重率(WGR，%)=100×(W1-W0)/W0

攝食率(FI，%/d)=100×W/[T×(W1+W0)/2]

特定生長率(SGR，%/d)=100×(lnW1-lnW0)/T

飼料效率(FE)=(W1-W0)/W

蛋白質(zhì)效率(PER，%)=100×(W1-W0)/(W×P)

蛋白質(zhì)沉積率(PPV，%)=100×(W1×P1-W0×P0)/(W×P)

式中：N0、N1——初始魚數(shù)量和終末魚數(shù)量；

W、W0、W1——攝食的飼料干物質(zhì)重、初始魚體重和終末體重(g)；

P、P0、P1——飼料粗蛋白、初始魚體粗蛋白和終末魚體粗蛋白含量(g)；

T——試驗天數(shù)(d)。

所得試驗數(shù)據(jù)采用“平均值±標準差”表示，采用SPSS19.0 分析軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，當差異達到顯著（P＜0.05）水平時，用Duncan’s進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料纈氨酸水平對花鱸生長及飼料利用的影響(見表3)

表3 飼料不同纈氨酸水平對花鱸生長性能的影響

由表3可知，飼料中不同的纈氨酸水平影響了花鱸的末重、增重率、特定生長率、攝食率、飼料效率、蛋白質(zhì)效率和蛋白質(zhì)沉積率。其中，末重、增重率和特定生長率這三個直接反映生長的指標隨飼料纈氨酸的增加變化趨勢一致，均表現(xiàn)為隨著飼料纈氨酸的升高呈先升高后降低的趨勢，且最高點出現(xiàn)在纈氨酸水平為1.96%組。以特定生長率為評價指標，進行二次曲線擬合(y=-0.210 4x2+0.913 7x-0.097 9，R2=0.905 1)，得到初重(182.33±1.08) g規(guī)格的花鱸纈氨酸的最適需求量為2.17%飼料干物質(zhì)，占飼料蛋白的5.14%(圖1)。攝食率、蛋白質(zhì)效率和蛋白質(zhì)沉積率均隨著飼料纈氨酸水平的升高呈先升高后趨于平緩的趨勢，攝食率在纈氨酸為1.54%組出現(xiàn)拐點，蛋白質(zhì)效率和蛋白質(zhì)沉積率與特定生長率等指標一致，在1.96%組出現(xiàn)拐點。此外，飼料效率也隨著飼料纈氨酸的升高呈先升高后降低的趨勢，且在纈氨酸為1.96%組出現(xiàn)最大值，以飼料效率為評價指標，再次進行二次曲線擬合(y=-0.111 7x2+0.478 4x+0.180 2，R2=0.821 1)，得到花鱸纈氨酸最適需求量為2.14%，占飼料蛋白的5.07%(圖2)。

2.2 飼料纈氨酸水平對花鱸體組成的影響（見表4）

由表4 可知，花鱸魚體水分含量在65.95%～68.64%之間，粗蛋白質(zhì)含量在16.94%～17.60%之間，粗脂肪含量在8.60%～9.42%之間，粗灰分含量在4.05%～5.25%之間，但飼料不同纈氨酸水平對魚體水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和灰分均無顯著影響(P＞0.05)。

2.3 飼料纈氨酸水平對花鱸肌肉必需氨基酸組成的影響（見表5）

由表5可知，飼料纈氨酸水平的增加對肌肉中的纈氨酸含量無顯著影響(P＞0.05)。同樣的，除纈氨酸以外的肌肉其他必需氨基酸含量也不受飼料纈氨酸水平變化的影響(P＞0.05)。

2.4 飼料纈氨酸水平對花鱸肝臟轉(zhuǎn)氨酶活性的影響（見表6）

由表6可知，飼料纈氨酸水平影響了花鱸肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性，且這兩個轉(zhuǎn)氨酶活性均隨著飼料纈氨酸水平的升高呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，在纈氨酸水平為1.96%組出現(xiàn)最高值，顯著高于其他各處理組(P＜0.05)。

圖1 飼料中不同水平纈氨酸對花鱸特定生長率的影響

圖2 飼料中不同纈氨酸水平對飼料效率的影響

表4 飼料不同纈氨酸水平對花鱸體組成的影響（%）

表5 飼料不同水平纈氨酸對花鱸肌肉必需氨基酸組成的影響(%肌肉蛋白)

表6 飼料纈氨酸水平對花鱸肝臟轉(zhuǎn)氨酶活性的影響(U/g prot.)

3 討論

飼料中植物蛋白替代魚粉，通常會引起某一種或幾種必需氨基酸缺乏，因此，研究魚類氨基酸的適宜需求量，是獲得魚類最佳生長所需理想蛋白質(zhì)模型的基礎(chǔ)[9-10]，同時，也可以為商業(yè)飼料的配方設(shè)計提供指導(dǎo)。對于花鱸，目前已開展賴氨酸[11]、亮氨酸[8]、異亮氨酸[8]、纈氨酸[8]、組氨酸[8]、苯丙氨酸[12]、蘇氨酸[12-13]、色氨酸[14]等多種必需氨基酸需求研究，其中，纈氨酸的研究是基于8 g 的小規(guī)格苗種階段的研究，而對初重超過100 g的大規(guī)格養(yǎng)成階段缺乏研究，因此，為進一步完善花鱸的纈氨酸需求量，本試驗聚焦在初重為(182.33±1.08) g大規(guī)格花鱸的纈氨酸需求量研究。

生長結(jié)果表明，飼料中不同水平的纈氨酸影響了花鱸的末重、增重率、特定生長率、攝食率、飼料效率、蛋白質(zhì)效率和蛋白質(zhì)沉積率，這進一步說明研究大規(guī)格花鱸纈氨酸需求量對生長和飼料利用具有重要意義。本試驗以生長最具有代表性的指標特定生長率和飼料利用最具代表性的指標飼料效率分別進行二次曲線擬合，得到初重(182.33±1.08) g 的大規(guī)格花鱸纈氨酸最適需求量分別為2.17%飼料干物質(zhì)(5.14%飼料蛋白)和2.14%(5.07%飼料蛋白)，這一結(jié)果與同樣以特定生長率和飼料效率為評價指標得到8 g小規(guī)格花鱸纈氨酸的需求量2.11%飼料干物質(zhì)(5.02%飼料蛋白)的結(jié)果接近[8]。通常規(guī)格越大的魚類，如大黃魚(Pseudosciaena crocea)、斜帶石斑魚等對飼料蛋白質(zhì)的需求量越低[15-16]，同時，在團頭魴的研究上還發(fā)現(xiàn)，攝食同一配方飼料，規(guī)格越大，肌肉蛋白的必需氨基酸含量越低[6]，而氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，因此，理論上規(guī)格越大的魚類，對必需氨基酸的需求量越低，并且，這一理論在不同規(guī)格斜帶石斑魚賴氨酸和蛋氨酸需求量的研究中得到驗證[7]。但是，本試驗的研究結(jié)果卻與規(guī)格越大，必需氨基酸需求量越低的理論相矛盾，其可能的原因有兩點：其一，這一理論與魚的種類有關(guān)，例如，盡管賴氨酸在斜帶石斑魚上隨著初重規(guī)格增大而需求量降低，但在團頭魴上，卻發(fā)現(xiàn)賴氨酸需求量隨著初重規(guī)格增大而升高[17]；其二，與所研究的具體氨基酸有關(guān)，因為組成魚體蛋白質(zhì)的必需氨基酸有10 種，魚的規(guī)格越大，對飼料蛋白的需求量越低，不能代表每種氨基酸的需求量一定也跟著降低，如同一種花鱸，對纈氨酸需求量在不同規(guī)格之間接近，對異亮氨酸的需求量隨規(guī)格的增大而降低[8，14]，對組氨酸和亮氨酸需求量則隨著規(guī)格的增大升高[8，13-14]。這種因魚和必需氨基酸的種類不同，相應(yīng)的需求量在不同規(guī)格有明顯不同的結(jié)果，暗示在設(shè)計不同規(guī)格魚的飼料配方時，必需氨基酸需求量不能僅僅根據(jù)“規(guī)格越大，氨基酸需求量越低”來設(shè)計，而是需要依據(jù)每種魚對應(yīng)必需氨基酸的試驗結(jié)果進行合理的調(diào)整。

此外，本試驗還發(fā)現(xiàn)，末重、增重率、特定生長率和飼料效率均隨著飼料纈氨酸的增加呈先升高后降低的變化趨勢，其原因可能是支鏈氨基酸的亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸在魚體內(nèi)存在頡頏效應(yīng)，即支鏈氨基酸在腸道中的轉(zhuǎn)運吸收過程共用相同的轉(zhuǎn)運載體，這導(dǎo)致過量的纈氨酸會與其他支鏈氨基酸發(fā)生轉(zhuǎn)運載體的競爭性抑制，導(dǎo)致氨基酸吸收不平衡，降低對支鏈氨基酸的利用效率。同時，支鏈氨基酸在分解過程中，也會共用支鏈酮酸脫氫酶，導(dǎo)致過量的纈氨酸與其他支鏈氨基酸在氧化分解過程中對支鏈酮酸脫氫酶產(chǎn)生競爭性抑制[14，18-19]。除花鱸外，生長隨飼料纈氨酸的增加呈下降的趨勢在南亞野鯪(Labeo rohita,Hamilton)[20]、建鯉(Cyprinus carpio var. Jian)[21]、草魚[5，22]、大黃魚[8]等魚類上也發(fā)現(xiàn)。但團頭魴[4]、真鯛(Pagrus major)[23]、美國紅魚[3]、尼羅羅非魚[2]等魚類隨著飼料纈氨酸的增加呈現(xiàn)先升高后趨于平緩的趨勢，出現(xiàn)了不同的魚類生長結(jié)果隨飼料纈氨酸的增加呈現(xiàn)不同的響應(yīng)，可能的原因是不同魚類對飼料中過量纈氨酸引起的支鏈氨基酸頡頏作用耐受能力不同[24]。

支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）是組成哺乳動物肌肉蛋白的重要氨基酸，合計占肌肉蛋白的14%～18%[18]。在本試驗中，對肌肉支鏈氨基酸的測定也發(fā)現(xiàn)，花鱸的亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸占肌肉蛋白為11.76%～12.10%，盡管低于哺乳動物占肌肉蛋白的含量，但也是組成魚類肌肉的重要氨基酸。本試驗中，飼料纈氨酸含量的升高對肌肉纈氨酸的含量無顯著影響。同時，亮氨酸和異亮氨酸這兩個支鏈氨基酸在肌肉中的含量也沒有隨飼料纈氨酸的升高而產(chǎn)生差異，相似的結(jié)果在初重大約6.5 g 的尼羅羅非魚的纈氨酸需求量的研究上也發(fā)現(xiàn)[2]。但是在印度鯉魚(Catla catla)稚仔魚的研究中發(fā)現(xiàn)，魚體纈氨酸含量隨著飼料纈氨酸的升高呈先升高后降低的變化趨勢[25]，因此，猜測肌肉纈氨酸含量受飼料纈氨酸含量的影響可能與初始魚的大小有關(guān)。另外，Mai 等[11]認為肌肉賴氨酸含量變化可以作為花鱸飼料氨基酸需求量的評價指標，這一理論在紅鰭東方鲀的賴氨酸和蛋氨酸需求量的研究上得到驗證[26-27]，但是這一理論在花鱸纈氨酸需求量的研究，特別是大規(guī)格花鱸纈氨酸需求量上，并沒有得到進一步證明，這表明生長可能仍然是氨基酸需求量研究的重要指標，肌肉氨基酸含量變化只能是對生長結(jié)果的一種補充驗證。

谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶是氨基酸分解代謝中兩個重要的氨基酸分解代謝相關(guān)酶，谷草轉(zhuǎn)氨酶的作用是將天冬氨酸和α-酮戊二酸催化生成谷氨酸和草酰乙酸。谷丙轉(zhuǎn)氨酶的作用為將丙氨酸和α-酮戊二酸催化生成谷氨酸和丙酮酸[28-30]。在本試驗中發(fā)現(xiàn)，肝臟的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性均是隨著飼料纈氨酸含量的升高出現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，這與孫麗慧等[5]在草魚上發(fā)現(xiàn)的肝臟谷丙轉(zhuǎn)酶活性隨飼料纈氨酸含量的變化趨勢一致。由于谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化生成的草酰乙酸和丙酮酸可以進入三羧酸循環(huán)參與能量代謝，因此，谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶在適量纈氨酸處理組活性升高，可能既表明肝臟中轉(zhuǎn)氨基活性的增強，也表明肝臟中能量代謝的活性增強[27]，而這些代謝活性的增強，有利于花鱸的生長，因為出現(xiàn)這兩種轉(zhuǎn)氨酶活性隨飼料纈氨酸的變化與生長的變化結(jié)果一致。

4 結(jié)論

在本試驗條件下，初重為(182.33±1.08) g 的大規(guī)格花鱸，以特定生長率和飼料效率為評價指標，根據(jù)二次曲線擬合得出，花鱸對飼料中纈氨酸的適需求量為2.14%～2.17%飼料干物質(zhì)，占飼料蛋白5.07%～5.14%。