郭銀雪 葛平玉 馬娟 詹繼紅

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1腎內(nèi)科，貴州 貴陽 550001；2泌尿外科)

腎間質(zhì)纖維化是所有慢性腎臟疾病(CKD)進(jìn)行性發(fā)展的最終病理結(jié)果。全國(guó)多中心橫斷面研究顯示，我國(guó)成年人CKD的總患病率為10.8%〔1〕。而終末期腎衰竭發(fā)病率高、死亡率高，且花費(fèi)大量醫(yī)療資源〔2〕。因此，探討腎間質(zhì)纖維化的防治措施在臨床上有重要意義。研究顯示，應(yīng)用抗氧化劑能夠減輕梗阻性腎損傷和腎間質(zhì)纖維化〔3，4〕。刺梨是薔薇科植物，民間主要將其果實(shí)和根入藥。藥理研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗氧化、抗癌、提高免疫功能及抗衰老等重要藥理作用〔5〕，在眾多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究中均具有重要應(yīng)用。刺梨凍干粉飽含刺梨黃酮及維生素C，我們前期的臨床研究表明，刺梨凍干粉具有良好的抗腎纖維化效應(yīng)〔6〕。本研究擬通過氧化應(yīng)激指標(biāo)觀察刺梨凍干粉對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)(UUO)腎纖維化模型大鼠的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 50只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重140～160 g，由上海西普爾一必凱實(shí)驗(yàn)有限公司提供，合格證號(hào)：DA942C48-72F76A1E-466ABC83-FC6974。實(shí)驗(yàn)大鼠分籠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，設(shè)備使用證號(hào)：SCXK(滬)2013-0016，飼養(yǎng)于溫度25℃，12 h光照、45%～55%濕度的環(huán)境中，自由飲水，普通飼料進(jìn)食。大鼠納入實(shí)驗(yàn)研究后均先給予為期1 w的適應(yīng)性喂養(yǎng)。

1.2主要藥物及試劑 刺梨凍干粉〔購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)金刺梨(貴州)科技開發(fā)有限公司〕；氯沙坦鉀片(杭州默沙東制藥有限公司，批號(hào)：L037309)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。兔抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，TGF-βⅠ型受體(TGF-βRⅠ)多克隆抗體購(gòu)于武漢博士德生物公司。

1.3動(dòng)物造模、分組及給藥方法 將50只SD雄性大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，按隨機(jī)數(shù)據(jù)取出分為假手術(shù)組10只和手術(shù)組40只，手術(shù)組行UUO。術(shù)后第2天，手術(shù)組隨機(jī)分為模型組、SIRT1激動(dòng)劑組、刺梨中劑量組、氯沙坦鉀組，每組10只。于分組當(dāng)天，所有大鼠參照馬氏定理設(shè)定干預(yù)劑量。氯沙坦組給予氯沙坦10 mg/(kg·d)，濃度為20%；刺梨中劑量組給予3 g/(kg·d)，濃度為3%；SIRT1激動(dòng)劑組給予白藜蘆醇25 mg/d。模型組和假手術(shù)組均同時(shí)給予同等容積無菌生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)大鼠均每天干預(yù)1次，連續(xù)干預(yù)14 d。灌胃14 d后處死大鼠。UUO模型〔7〕的建立，以2%的戊巴比妥鈉0.6～0.8 ml行腹腔注射，大鼠麻醉后取右側(cè)臥位充分暴露左側(cè)腎區(qū)，局部備皮、消毒，行左側(cè)恥骨上切口，沿左腎下極尋找到左輸尿管，用4-0號(hào)絲線上下結(jié)扎兩處，然后從中剪斷輸尿管，分層縫合關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組除不結(jié)扎和剪斷輸尿管外，其他均與手術(shù)組手術(shù)過程一致。

1.4相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)及實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1腎組織的采集及制備 各組大鼠均于治療后第14天處死，迅速摘取梗阻側(cè)腎臟，予縱行切開，取一份于4%多聚甲醛中固定，做蘇木素-伊紅(HE)、Masson染色；一份組織放入凍存管，置于液氮中速凍后，于-80℃冰箱保存，用于腎組織MDA、SOD測(cè)定及腎組織TGF-β1及TGF-βR Ⅰ蛋白的表達(dá)。

1.4.2組織學(xué)觀察 石蠟組織切片行HE、Masson染色。HE染色觀察腎臟病理學(xué)改變。Masson染色半定量分析：隨機(jī)選取20個(gè)互不重疊高倍視野(×400)，計(jì)算腎間質(zhì)藍(lán)色著色占全片范圍。

1.4.3MDA及SOD測(cè)定 用預(yù)冷的0.85%生理鹽水裂解腎組織，制成10%和1%勻漿。按試劑盒說明書操作步驟，分別測(cè)定腎組織MDA含量及總SOD活性。

1.4.4免疫組織化學(xué)方法檢測(cè) TGF-β1及TGF-βRⅠ表達(dá)水平采用Envision System 二步法。石蠟包埋的切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫(H2O2)的甲醇溶液，抗原熱修復(fù)，正常兔血清封閉后，分別滴加兔抗TGF-β1多克隆抗體(1∶200)和TGF-βRⅠ多克隆抗體(1∶200)孵育過夜。滴加二抗，最后顯微鏡下控制二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染。同時(shí)采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果評(píng)估：TGF-β1及TGF-βRⅠ的表達(dá)采用半定量分析，即隨機(jī)選取20個(gè)互不重疊的高倍視野(×400)，采用IPP軟件計(jì)算腎皮質(zhì)陽性著色面積占一視野場(chǎng)面積的百分比。

1.4.5Western印跡檢測(cè) 腎臟組織加細(xì)胞裂解液勻漿破碎，將裂解物移至新的離心管中，取樣加入十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)混勻經(jīng)相關(guān)處理后離心去除不溶性沉淀，再次取樣使用SDS-PAGE分離，樣品行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗，4℃封閉過夜，加入二抗，室溫下?lián)u床上孵育1 h；顯影。用圖像分析軟件Gel-Pro Analyzer測(cè)定各組蛋白的相對(duì)光密度值和目的條帶及內(nèi)參GAPDH條帶的灰度比值，分別表示各蛋白的表達(dá)水平。

1.4.6Real-time PCR法 液氮中取50 g腎組織加入500 μl RLA 冰上勻漿，12 000 r/min 4℃離心5 min，取上清采用磁珠法RNA抽提試劑盒提取腎臟總RNA，核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA純度及含量，取2 μl RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件65℃ 5 min，42℃ 60 min，70℃ 5 min，合成cDNA，采用20 μl反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件95℃ 30 s 預(yù)變性；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物合成根據(jù)已發(fā)表的基因庫(kù)及參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，由上海里奇生物技術(shù)有限公司合成：GAPDH正義鏈：5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′，反義鏈：5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT(113 bp)-3′；Smad 2正義鏈：5′-GCCGCCCGAAGGGTAGAT-3′，反義鏈：5′-TTCTGTTCTCCACCACCTGC(164 bp)-3′；Smad3正義鏈：5′-CGATGTCCCCAGCACACAATAAC-3′，反義鏈：5′-TAGTAGGAGATGGAGCACCAAAAGG(82 bp)-3′；Smad7正義鏈：5′-GGTGCGTGGTGGCATACT-3′，反義鏈：5′-GCTGACTCTTGTTGTCCGAAT(144 bp)-3′；TGF-βR1正義鏈：5′-GCAATGGGCTTAGTATTCTGG-3′，反義鏈：5′-AAGGCAACTGGTAGTCTTCGTG(76 bp)-3′；TGF-β1正義鏈：5′-CATGGAGCTGGTGAAACGGAAG-3′，反義鏈：5′-GACTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC(74 bp)-3′。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1腎臟的病理改變 肉眼觀，假手術(shù)組雙側(cè)腎臟顏色紅潤(rùn)，中等大小，外有脂肪組織包裹，包膜完整；模型組右腎正常，左側(cè)梗阻腎腫脹，體積增大，呈囊狀，皮質(zhì)較薄，色暗紅。光鏡下，經(jīng)HE和Masson染色均顯示，UUO術(shù)后組織學(xué)表現(xiàn)為大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)纖維化。腎小管可見蛋白管型、紅細(xì)胞管型或是萎縮；部分區(qū)域腎小管擴(kuò)張，腎球囊周圍纖維化，部分腎小球發(fā)生玻璃樣變和纖維化。刺梨中劑量組、SIRT1激動(dòng)劑組及氯沙坦鉀組纖維化程度較模型組減輕(P<0.05)。見圖1、2，表1。

2.2各組腎組織SOD、MDA含量比較 與假手術(shù)組相比，模型組、氯沙坦鉀組、SIRT1 激動(dòng)劑組及刺梨中劑量組腎組織SOD表達(dá)顯著降低，MDA表達(dá)顯著升高(P<0.01)；氯沙坦鉀組、SIRT1 激動(dòng)劑組及刺梨中劑量組差異無顯著性(P>0.05)，但與模型組均有顯著差異(P<0.01)。見表1。

2.3各組免疫組化TGF-β1及TGF-βRⅠ表達(dá)比較 模型組、氯沙坦鉀組、SIRT1激動(dòng)劑組及刺梨中劑量組腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)TGF-β1及TGF-βRⅠ表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)；而刺梨中劑量組、SIRT1激動(dòng)劑組與氯沙坦鉀組差異無顯著性(P>0.05)，但均顯著低于模型組(P<0.01)。見表2和圖3、圖4。

圖1 各組腎臟組織結(jié)構(gòu)改變(HE，×400)

圖2 各組腎臟組織結(jié)構(gòu)改變(Masson，×400)

表1 各組膠原藍(lán)染面積與AIO面積之比及SOD、MDA水平比較

與假手術(shù)組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01；下表同

表2 各組TGF-β1及TGF-βRⅠ表達(dá)比較

圖3 各組TGF-β1免疫組化表達(dá)(×400)

圖4 各組TGF-βRⅠ免疫組化表達(dá)(×400)

2.4各組Smad2、Smad3、Smad7表達(dá)比較 模型組、氯沙坦鉀組、SIRT1 激動(dòng)劑組及刺梨中劑量組Smad2、Smad3表達(dá)顯著高于假手術(shù)組， Smad7顯著低于假手術(shù)組(P<0.01)；氯沙坦鉀組、SIRT1 激動(dòng)劑組及刺梨中劑量組差異無顯著性(P>0.05)，但與模型組均有顯著差異(P<0.01)。見表3，表4。

表3 各組Smad2、Smad3、Smad7 mRNA水平比較

表4 各組Smad2、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)比較

3 討 論

腎間質(zhì)纖維化是多種腎臟疾病發(fā)展至終末期腎衰竭的共同通路〔8〕。TGF-β是介導(dǎo)腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化關(guān)鍵的細(xì)胞因子。其作用包括趨化和活化炎性細(xì)胞，介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及刺激細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成及降低基質(zhì)金屬蛋白酶的活性和(或)增加蛋白酶抑制劑的合成來促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。系膜基質(zhì)的大量積聚是引起腎小球硬化，導(dǎo)致腎病患者出現(xiàn)腎衰竭的重要病理基礎(chǔ)，TGF-β1可促進(jìn)系膜基質(zhì)的合成與沉積，進(jìn)而加速腎小球硬化過程。Poncelet等〔9〕發(fā)現(xiàn)系膜細(xì)胞可表達(dá)Smad1、Smad2、Smad3、Smad4 和Smad7。

刺梨作為藥食兩用植物，具有較高的藥用價(jià)值?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，刺梨中含有豐富的刺梨黃酮、刺梨多糖等多種活性物質(zhì)，不僅可以延緩衰老，還可增強(qiáng)機(jī)體抵抗力、發(fā)揮抗炎、抗癌作用，且在腎纖維化患者中應(yīng)用還可增強(qiáng)腎小管和腎小球上皮細(xì)胞的自我修復(fù)功能〔10〕。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，應(yīng)用Masson觀察腎臟膠原表達(dá)，模型組較治療組膠原著色面積明顯增高；說明刺梨凍干粉能減少腎臟膠原表達(dá)。應(yīng)用刺梨凍干粉治療后，UUO大鼠腎組織SOD活性提高，MDA含量降低，提示刺梨凍干粉具有抗氧化應(yīng)激作用。同樣免疫組化及Western印跡也顯示刺梨凍干粉與氯沙坦鉀具有同等抗氧化應(yīng)激，抗腎纖維化的作用，而無毒副作用。

綜上，刺梨凍干粉可能是通過調(diào)節(jié)SOD、MDA活性，緩解氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞受損，達(dá)到有效改善腎臟纖維化。其機(jī)制可能是通過激活體內(nèi)SIRT1從而活化Smda7以下調(diào)TGFβⅠ、TGF-βRⅠ及Smda2、Smda3的表達(dá)。