趙永霞，周禮紅 *，謝 健，王博語(yǔ)

（1.茅臺(tái)學(xué)院 釀酒工程系，貴州 仁懷 564507；2.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.遵義醫(yī)學(xué)院遺傳教研室，貴州 遵義 563000）

光是自然界中影響生物體發(fā)育和生理過(guò)程的重要信號(hào)，對(duì)真菌的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝產(chǎn)物合成有很大影響[1]。據(jù)研究報(bào)道，光變化會(huì)促使真菌重新編程其1/5的基因來(lái)改變生長(zhǎng)發(fā)育模式，還能對(duì)無(wú)性或有性發(fā)育進(jìn)行選擇或?qū)Υx產(chǎn)物進(jìn)行重調(diào)[2-4]。如光能夠促進(jìn)構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）偏向有性發(fā)育，抑制無(wú)性發(fā)育。不同波長(zhǎng)和不同顏色的光對(duì)絲狀真菌有著不同的調(diào)控模式，紅光抑制頭絨泡菌（Physarum polycephalum）的光碎片化，而遠(yuǎn)紅光則促進(jìn)它的光碎片化[5]。綠僵菌（Metarhizium robertsii）在紅光照射下產(chǎn)生的分生孢子對(duì)逆境的耐受最差，而藍(lán)光和白光照射下，孢子對(duì)逆境的耐受較好[6]。

紅曲霉是中國(guó)傳統(tǒng)藥食兼用菌種，可代謝產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于釀酒、制藥等領(lǐng)域，其生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝等也同樣受到光的調(diào)控。MIYAKE T等[7]研究發(fā)現(xiàn)，叢毛紅曲霉（Monascus pilosus）經(jīng)不同波長(zhǎng)光照處理后，其菌絲的長(zhǎng)短、疏密，無(wú)性孢子的形成量及有性孢子的萌發(fā)都發(fā)生相應(yīng)的改變；BüHLER R M M等[8-9]研究表明，紅光可以促進(jìn)紅曲霉生長(zhǎng)發(fā)育和色素產(chǎn)生；CHEN D等[10]研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光和照射時(shí)長(zhǎng)都會(huì)影響紅曲霉不同色素的合成。藍(lán)光[11]抑制紅曲霉中桔霉素的合成，白光[12]和藍(lán)光[13]對(duì)紅曲霉的生長(zhǎng)發(fā)育和次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的影響與培養(yǎng)基中的氮源密切相關(guān)。氮源代謝還受到晝夜節(jié)律的調(diào)控[14]，藍(lán)光可以增強(qiáng)硝酸還原酶的部分亞基活性誘導(dǎo)菌絲向有性發(fā)育分化，說(shuō)明光反應(yīng)和氮代謝之間存在聯(lián)系[15]。岳倩倩等[16]研究發(fā)現(xiàn)，銨鹽可以促進(jìn)紅曲霉的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝，同時(shí)，培養(yǎng)基的氮源和pH值也會(huì)影響安卡紅曲霉（Monascus anka）的不同色素積累[17]，6-呋喃氨基嘌呤（6-fur-turylaminopurine）可以提高紅色素的產(chǎn)量、色素的光穩(wěn)定性和發(fā)酵液色澤[18]；SHI K等[17]研究發(fā)現(xiàn)，硫酸銨為氮源時(shí)，Monascus anka胞內(nèi)色素主要是紅色素，但當(dāng)以蛋白胨為氮源時(shí)，胞內(nèi)色素主要是黃色素。更換為雞毛蛋白胨，則有利于紫色紅曲霉（Monascus purpureus）所有色素的合成和積累[19]。因此，氮源對(duì)紅曲霉的的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝也有重要的影響，而且和光調(diào)控存在相關(guān)性。

光和氮源對(duì)真菌的發(fā)育和代謝都有著重要的調(diào)控作用，兩者之間也存在密切聯(lián)系，但目前結(jié)合雙因素對(duì)紅曲霉的協(xié)同調(diào)控研究還不全面，為探究安卡紅曲霉（Monascus anka）GZU4577中光調(diào)控與氮源代謝的關(guān)系，本研究采用紅光與不同無(wú)機(jī)氮源相結(jié)合的方法，通過(guò)菌落觀察、生長(zhǎng)測(cè)量、分生孢子和閉囊殼合成數(shù)量檢測(cè)以及色價(jià)的測(cè)定，研究紅光和氮源對(duì)Monascus ankaGZU4577的調(diào)控情況，為后續(xù)深入研究光與氮源協(xié)同調(diào)控途徑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

安卡紅曲霉（Monascus anka）GZU4577：本實(shí)驗(yàn)室分離保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

沙氏瓊脂改良培養(yǎng)基：麥芽糖5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，酵母膏5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然，121 ℃高壓滅菌25 min。

無(wú)氮源察氏（Czapek）培養(yǎng)基：K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蔗糖30 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121 ℃高壓滅菌25 min。

調(diào)控培養(yǎng)基：向無(wú)氮源Czapek培養(yǎng)基中分別添加NH4NO310 g/L、NH4Cl 10 g/L、NaNO310 g/L作為氮源。

1.1.3 化學(xué)試劑

NH4NO3、NH4Cl、NaNO3（均為分析純）：重慶北碚精細(xì)化工廠；K2HPO4、KCl、MgSO4、FeSO4（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；麥芽糖、蛋白胨、葡萄糖、酵母膏（均為生化試劑）：上海盛思生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；DH-360A恒溫培養(yǎng)箱：天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠；Motic1300光學(xué)顯微鏡：陜西麥迪奧醫(yī)藥科技有限公司；YX280B高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；115 cm/28 W單色光源燈管：日本日立公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

以無(wú)氮源Czapek培養(yǎng)基作為對(duì)照（CK），將安卡紅曲霉GZU4577接種于沙氏瓊脂改良培養(yǎng)基，30 ℃條件下培養(yǎng)16 h，用無(wú)菌水洗下孢子，轉(zhuǎn)入帶有玻璃珠的無(wú)菌三角瓶中，振蕩，充分打散孢子，三層擦鏡紙過(guò)濾，經(jīng)孢子計(jì)數(shù)，制成終濃度為1×106CFU/mL的均一孢子懸液。取10 μL孢子懸液分別接種于無(wú)氮源察氏培養(yǎng)基和調(diào)控培養(yǎng)基中心（每組重復(fù)3次），分別置于紅光（波長(zhǎng)690～700 nm）（光照強(qiáng)度為449.94 Lux）、黑暗條件下，28 ℃連續(xù)培養(yǎng)9 d。

1.3.2 形態(tài)觀察

每隔24 h拍照，觀察菌落形態(tài)、隆起度及變色時(shí)間，采用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落直徑，采用光學(xué)顯微鏡觀察氣生菌絲、孢子及邊緣菌絲的變化。

1.3.3 色素提取及測(cè)定方法

將培養(yǎng)好的安卡紅曲霉GZU4577烘干，測(cè)定干質(zhì)量，研碎，置于帶塞試管中，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，避光浸提5 h，獲得色素粗提物。稀釋一定倍數(shù)后，置于酶標(biāo)儀中，分別在波長(zhǎng)510 nm、465 nm、410 nm處測(cè)定其吸光度值。其中以波長(zhǎng)510 nm處的吸光度值代表紅色素，465 nm處的吸光度值代表橙色素，410 nm處的吸光度值代表黃色素。根據(jù)吸光度值計(jì)算色價(jià)，其計(jì)算公式如下：

1.3.4 孢子數(shù)計(jì)數(shù)方法

安卡紅曲霉GZU4577培養(yǎng)9 d后，采用內(nèi)徑為10 mm的打孔器在菌落上均勻打孔，置于含有玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)，加入10 mL 0.2%Tween80溶液，漩渦振蕩洗孢子，采用顯微鏡計(jì)數(shù)閉囊殼，四層擦鏡紙過(guò)濾后，采用血球計(jì)數(shù)板對(duì)分生孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)[20]。

1.3.5 分析方法

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，使用SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；采用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅光結(jié)合不同無(wú)機(jī)氮源對(duì)安卡紅曲霉GZU4577生長(zhǎng)的影響

紅光結(jié)合不同無(wú)機(jī)氮源對(duì)安卡紅曲霉GZU4577生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖1、圖2及表1。

圖1 紅光結(jié)合不同無(wú)機(jī)氮源對(duì)安卡紅曲霉GZU4577菌落形態(tài)的影響Fig.1 Effect of red light combined with different inorganic nitrogen sources on colony morphology of Monascus anka GZU4577

圖2 紅光結(jié)合不同無(wú)機(jī)氮源對(duì)安卡紅曲霉GZU4577菌落直徑的影響Fig.2 Effect of red light combined with different inorganic nitrogen sources on Monascus anka GZU4577 colony diameter

表1 紅光結(jié)合不同無(wú)機(jī)氮源對(duì)安卡紅曲霉GZU4577菌落形態(tài)（28 ℃培養(yǎng)9 d）特征的影響Table1 Effect of red light combined with different inorganic nitrogen sources on Monascus anka GZU4577 colony morphology(culture at 28 ℃for 9 d)

由圖1、圖2及表1可知，與黑暗條件相比，當(dāng)無(wú)氮源添加時(shí)，在生長(zhǎng)前期（4 d），紅光照射使氣生菌絲較黑暗條件下濃密，隆起度略高，但在生長(zhǎng)后期（9 d），紅光照射下菌落較小，氣生菌絲隆起度較低，氣生菌絲稠密程度一致，只是邊緣菌絲略稀薄，氣生菌絲均為淡粉色。當(dāng)培養(yǎng)4 d時(shí)，紅光條件下菌落直徑顯著＞黑暗條件下的菌落直徑（P＜0.05），但隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，菌落直徑之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明在無(wú)氮源添加的情況下，紅光不能促進(jìn)或者抑制菌落的徑向生長(zhǎng)，該結(jié)果與MIYAKE T等[7]研究結(jié)論一致，紅光對(duì)菌落大小沒(méi)有顯著影響。當(dāng)添加不同無(wú)機(jī)氮源后，紅光的影響規(guī)律發(fā)生變化。當(dāng)以NaNO3為唯一氮源時(shí)，紅光顯著抑制菌落的徑向生長(zhǎng)（P＜0.05），培養(yǎng)至9 d時(shí)，菌落直徑為15.8 mm，幾乎沒(méi)有氣生菌絲，菌苔稀薄，變色時(shí)間晚（4 d），說(shuō)明NaNO3的存在使紅光抑制菌落的生長(zhǎng)。當(dāng)以NH4Cl為唯一氮源時(shí)，紅光條件下的菌落形態(tài)顏色深紅，而黑暗條件下菌落顏色呈橙色，菌落的氣生菌絲及隆起度與黑暗條件下相近。菌落的徑向生長(zhǎng)在黑暗條件下略顯優(yōu)勢(shì)，但是差異不顯著（P＞0.05），菌株邊緣規(guī)則，菌落平坦，氣生菌絲生長(zhǎng)良好，變色時(shí)間短（2 d）。當(dāng)以NH4NO3為唯一氮源時(shí)，黑暗條件下的氣生菌絲非常茂盛，紅光條件下菌落的氣生菌絲遜色于黑暗條件，隆起度也較低。且黑暗條件下菌落邊緣呈放射性扇形，而紅光條件下菌落呈規(guī)則圓形。紅光照射下菌落的顏色呈暗紅，而黑暗條件下菌落的顏色更偏橙黃色。培養(yǎng)初期（5 d和6 d）黑暗條件顯著促進(jìn)菌落的徑向生長(zhǎng)（P＜0.05），但是在生長(zhǎng)后期（7 d和8 d）紅光和黑暗條件下菌落直徑無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.2 紅光結(jié)合不同無(wú)機(jī)氮源對(duì)安卡紅曲霉GZU4577分生孢子和閉囊殼的影響

紅光結(jié)合不同無(wú)機(jī)氮源對(duì)安卡紅曲霉GZU4577分生孢子和閉囊殼的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，在無(wú)氮源添加時(shí)，紅光照射條件下，分生孢子和閉囊殼生成量分別為22.53×106CFU/mL、1.39×103CFU/mL；黑暗條件下，分生孢子生成量只有6.57×106CFU/mL，且未檢測(cè)到閉囊殼，說(shuō)明紅光能促進(jìn)安卡紅曲霉GZU4577分生孢子及閉囊殼的生成，有利于安卡紅曲霉GZU4577分別進(jìn)入無(wú)性生殖和有性生殖。添加無(wú)機(jī)氮源后，紅光對(duì)安卡紅曲霉GZU4577的分生孢子和閉囊殼的影響發(fā)生改變，當(dāng)以NaNO3為唯一氮源時(shí)，在紅光條件下，安卡紅曲霉GZU4577的閉囊殼和分生孢子的數(shù)量均顯著低于黑暗條件（P＜0.05），說(shuō)明NO3-的存在下，紅光抑制安卡紅曲霉GZU4577的分生孢子及閉囊殼的生成。當(dāng)以NH4Cl為唯一氮源時(shí)，在紅光條件下，安卡紅曲霉GZU4577的閉囊殼數(shù)量顯著低于黑暗條件（P＜0.05），而分生孢子的生成量卻顯著高于黑暗條件（P＜0.05），說(shuō)明NH4+的存在使得紅光促進(jìn)了安卡紅曲霉GZU4577的無(wú)性發(fā)育，抑制有性發(fā)育。當(dāng)以NH4NO3為唯一氮源時(shí)，在紅光條件下，安卡紅曲霉GZU4577的閉囊殼和分生孢子量顯著低于黑暗條件（P＜0.05），說(shuō)明NH4+和NO3-同時(shí)存在使得紅光抑制安卡紅曲霉GZU4577的分生孢子和閉囊殼的生成。因此，在一定量無(wú)機(jī)氮源存在情況下，黑暗有利于閉囊殼的形成，促使安卡紅曲霉GZU4577進(jìn)入有性生殖，與據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的黑暗有助于構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）進(jìn)入有性繁殖[15]的結(jié)論一致。

圖3 紅光結(jié)合不同無(wú)機(jī)氮源對(duì)安卡紅曲霉GZU4577分生孢子和閉囊殼量的影響Fig.3 Effect of red light combined with different inorganic nitrogen sources on conidia and cleistothecia of Monascus anka GZU4577

2.3 紅光結(jié)合不同無(wú)機(jī)氮源對(duì)安卡紅曲霉GZU4577產(chǎn)色素的影響

紅曲色素是紅曲霉非常重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有多種生理活性[21]，選擇最佳的色素合成條件具有重要意義。紅光結(jié)合不同無(wú)機(jī)氮源對(duì)安卡紅曲霉GZU4577產(chǎn)色素的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，在無(wú)氮源添加時(shí)，各色素色價(jià)非常低，且紅光與黑暗對(duì)色素的積累量沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）；添加無(wú)機(jī)氮源后，無(wú)機(jī)氮源不同，紅光對(duì)合成色素的影響不同。當(dāng)以NaNO3為唯一氮源時(shí)，各色素色價(jià)非常低，且紅光與黑暗對(duì)色素的積累量沒(méi)有顯著影響（P＞0.05），但黃色素色價(jià)顯著高于無(wú)NaNO3添加的條件，說(shuō)明NaNO3可能對(duì)黃色素的合成有特殊促進(jìn)作用。當(dāng)以NH4Cl為唯一氮源時(shí)，紅光條件下紅色素（125.33 U/g）、橙色素（112.86 U/g）、黃色素（200.66 U/g）的色價(jià)均顯著低于黑暗條件下各色素色價(jià)（P＜0.05），說(shuō)明NH4Cl存在時(shí)使得紅光抑制色素的合成。當(dāng)以NH4NO3為唯一氮源時(shí)，紅光條件下紅色素（98.99 U/g）、黃色素（149.69 U/g）、橙色素（87.18 U/g）的色價(jià)顯著低于黑暗條件下（P＜0.05）。以NH4Cl為唯一氮源時(shí)，各色素的色價(jià)顯著高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05），相比于NaNO3和NH4NO3，NH4Cl是色素合成的最佳氮源。結(jié)果顯示，紅光對(duì)色素的色價(jià)的影響與是否氮源充足和氮源種類相關(guān)。

圖4 紅光結(jié)合不同無(wú)機(jī)氮源對(duì)安卡紅曲霉GZU4577產(chǎn)色素的影響Fig.4 Effect of red light combined with different inorganic nitrogen sources on pigment production by Monascus anka GZU4577

3 結(jié)論

基于無(wú)氮源察氏培養(yǎng)基，在無(wú)氮源添加條件下，紅光照射對(duì)安卡紅曲霉（Monascus anka）GZU4577徑向生長(zhǎng)和各色素的色價(jià)無(wú)顯著影響（P＞0.05），但顯著促進(jìn)了分生孢子和閉囊殼的生成（P＜0.05）；添加無(wú)機(jī)氮源后，紅光對(duì)安卡紅曲霉GZU4577的影響機(jī)制發(fā)生改變：添加NaNO3后，紅光照射顯著抑制安卡紅曲霉GZU4577的徑向生長(zhǎng)和分生孢子、閉囊殼的生成（P＜0.05），但對(duì)各色素色價(jià)無(wú)顯著影響（P＞0.05）。添加NH4Cl后，紅光只抑制安卡紅曲霉GZU4577的閉囊殼的生成和各色素的色價(jià)（P＜0.05）。添加NH4NO3后，紅光顯著抑制了安卡紅曲霉GZU4577的閉囊殼和分生孢子、紅色素和黃色素的生成（P＜0.05）。因此，紅光對(duì)安卡紅曲霉GZU4577的調(diào)控與培養(yǎng)基中的氮源存在與否以及氮源種類相關(guān)，該研究為安卡紅曲霉GZU4577光調(diào)控研究提供了參考，為光信號(hào)與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)紅曲霉生長(zhǎng)代謝的調(diào)控機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。