付首穎 夏苗苗 張祎凝 劉川，3 涂然 張大偉，3

（1. 天津科技大學(xué)，天津 300457；2. 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308；3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

核黃素又名維生素B2，是一種異咯嗪衍生物［1］。這種黃色晶體最早從乳清當(dāng)中分離，因其分子結(jié)構(gòu)中含有核糖醇基而被命名為核黃素［1-2］。核黃素屬于B 族維生素家族，其在哺乳動物生長發(fā)育過程中起著重要的作用［3］。因而核黃素在飼料行業(yè)、食品醫(yī)藥行業(yè)中都著有廣泛的應(yīng)用［4］。微生物發(fā)酵法是現(xiàn)在最主要的核黃素生產(chǎn)方法［5］。高產(chǎn)菌株的獲取從初期的誘變篩選和簡單代謝工程改造［6-9］，發(fā)展到結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)與基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組學(xué)等方法進(jìn)行全面解析［10-11］。歷經(jīng)近70 年的發(fā)展，工業(yè)菌株的產(chǎn)量與轉(zhuǎn)化率均不斷提高，逐步替代了傳統(tǒng)的 化學(xué)合成法和化學(xué)半合成法，成為了微生物發(fā)酵法替代化學(xué)合成法生產(chǎn)復(fù)雜有機(jī)分子的典型范例［12］。

雖然理性改造的技術(shù)手段不斷豐富，但是以誘變-篩選為首的非理性改造在突破代謝瓶頸與尋找新的突變位點(diǎn)等方面仍具有不可替代的作用［13-17］。此外，隨著流式細(xì)胞儀［18-19］、液滴微流控［20-21］、自動化育種篩選等高通量設(shè)備的應(yīng)用，篩選的效率也大幅提升。和其他大多數(shù)代謝產(chǎn)物不同，核黃素作為一種天然的黃綠色熒光物質(zhì)，具有和綠色熒光蛋白類似的發(fā)射光［22-23］，這種得天獨(dú)厚的條件為以熒光篩選高產(chǎn)菌株提供了方便。然而利用高通量篩選技術(shù)進(jìn)行核黃素高產(chǎn)菌株篩選的工作直到最近才有所報道。Chen 等［24］利用液滴微流控對一株產(chǎn)核黃素的乳酸菌的隨機(jī)突變庫進(jìn)行篩選，菌株的核黃素產(chǎn)量從1.51 mg/L 提升到2.81 mg/L。Wagner 等［25］在對解脂耶氏酵母進(jìn)行誘變-篩選研究中則發(fā)現(xiàn)使用流式細(xì)胞篩選得到的高產(chǎn)菌其胞內(nèi)核黃素產(chǎn)量較高，而使用液滴微流控篩選到的菌株其胞外核黃素產(chǎn)量較高。然而兩篇文獻(xiàn)中所用出發(fā)菌株的核黃素產(chǎn)量都比較低，對于產(chǎn)量較高的工業(yè)菌株尚未建立合適的高通量篩選方法。因此本文評價了流式細(xì)胞分選，液滴微流控分選，96 孔板篩選等方法在核黃素工業(yè)菌株篩選中的適用性，建立了利用96 孔板靜置培養(yǎng)-熒光檢測篩選核黃素工業(yè)菌株的方法，并應(yīng)用該方法提高了工業(yè)菌株核黃素的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 R1，P1 均為實(shí)驗(yàn)室保藏的核黃素生產(chǎn)菌株；S1 為實(shí)驗(yàn)室保藏的核黃素生產(chǎn)工業(yè)菌株；1#、2#和3#為本研究所得菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母抽提物5 g/L、氯化鈉10 g/L；

YP 發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿干粉（0.5%）、蔗糖（1%）、硫酸鎂（0.5%）、酵母抽提物（0.5%）、磷酸氫二鉀（0.3%）、磷酸二氫鉀（0.2%），滅菌前用NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.2。

1.2 方法

1.2.1 核黃素不同濃度標(biāo)品熒光強(qiáng)度的測定 配置10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L、70 mg/L、80 mg/L 的核黃素標(biāo)準(zhǔn)品水溶液，分別取100 μL 于Costar 黑色底透酶標(biāo)板中，測定激發(fā)光473 nm，發(fā)射光520 nm 下的熒光值，繪制核黃素不同濃度標(biāo)品與熒光強(qiáng)度的關(guān)系曲線。

1.2.2 流式細(xì)胞分析 挑取活化36h的R1、P1 新鮮的單菌落，分別接種至LB 固體試管斜面培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)36 h。分別用接種環(huán)刮取斜面上的所有菌苔于1.5 mL 發(fā)酵液中，混勻，取500 μL 菌液接種至含有100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL 三角瓶中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)。分別將發(fā)酵液13 000 r/min，離心1 min，棄上清，用1 mL 1×PBS 稀釋重懸，使重懸后細(xì)胞的OD600=1，然后取50 μL 重懸后菌液到990 μL 1×PBS 中，混勻后去進(jìn)行流式分析，檢測R1、P1 的細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。

1.2.3 液滴微流控分選 挑取活化36h的R1、P1新鮮單菌落，分別接種于含有40 mL LB 培養(yǎng)液的250 mL 三角瓶中，37℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h。分別將種子液4 000 r/min 離心8 min，棄上清。然后用40 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基重懸菌體沉淀，得到種子懸液。將種子懸液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，使接種后發(fā)酵液的OD600=0.1。然后用液滴微流控進(jìn)行液滴包埋。包埋后液滴置于37℃靜置培養(yǎng)。篩選液滴微流控激發(fā)波長473 nm，發(fā)射波長520 nm 下，熒光信號最高的1%個液滴，每管收集2 000 個液滴左右。將收集到的液滴涂布LB 固體培養(yǎng)基平板，37℃倒置培 養(yǎng)36 h。

1.2.4 96 深孔板靜置和振蕩培養(yǎng) 挑取突變庫單菌落接種于含有500 μL LB 液體培養(yǎng)基的96 孔板中，37℃、800 r/min、80%濕度、培養(yǎng)18 h。轉(zhuǎn)接27 μL種子液于含有473 μL 發(fā)酵培養(yǎng)基的96 深孔板中，同一來源的種子液分別接入靜置和振蕩培養(yǎng)的96 孔板中。靜置培養(yǎng)的孔板放置于37℃培養(yǎng)箱中，振蕩培養(yǎng)的孔板置于孔板搖床中，37℃、800 r/min、80%濕度培養(yǎng)。

1.2.5 發(fā)酵液中核黃素濃度的分光光度檢測和熒光檢測 核黃素濃度的分光光度檢測法如下：取適量體積的發(fā)酵液，用0.01 mol/L NaOH 堿溶20 min 后，10 000 r/min，離心10 min，取上清測定444 nm 下的吸光度。根據(jù)公式：產(chǎn)量（mg/L）=（稀釋倍數(shù)×吸光度）/0.0321計算核黃素產(chǎn)量。

核黃素濃度的熒光檢測法如下：取100 μL 發(fā)酵液，測定其在激發(fā)光473 nm，發(fā)射光520 nm 下的熒光強(qiáng)度。

1.2.6 菌種保藏方法 取樣后在孔板中加入終濃度20%的甘油，混勻。將孔板凍存于-20℃，以備進(jìn)行下一輪篩選。

1.2.7 96 孔板靜置培養(yǎng)復(fù)篩 取3 μL 孔板初篩得到的高熒光菌株凍存液，點(diǎn)于LB 固體平板上，37℃培養(yǎng)24h后，挑取單菌落于含有500 μL LB 液體培養(yǎng)基的96 孔板中，37℃、800 r/min、80%濕度、培養(yǎng)18 h。轉(zhuǎn)接27 μL 種子液于含有473 μL 發(fā)酵培養(yǎng)基的96 深孔板中。放置于37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24h后，進(jìn)行熒光檢測。

1.2.8 搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證 取3 μL 經(jīng)96 孔板靜置復(fù)篩驗(yàn)證后，熒光最高的4 株菌及S1 的初篩凍存液，點(diǎn)于LB 固體平板上，37℃靜置培養(yǎng)36 h。分別用接種環(huán)刮取斜面上的所有菌苔于1.5 mL 發(fā)酵液中，混勻，取500 μL 菌液接種至含有100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL 三角瓶中，37℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)，用分光光度法測定12 h、24h和36h的核黃素產(chǎn)量。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞分選與液滴微流控分選在核黃素高產(chǎn)菌株選育的應(yīng)用

使用1.2.5 中熒光檢測法，測試液滴微流控和流式細(xì)胞儀檢測核黃素的可行性，在0-80 mg/L 的濃度范圍內(nèi)，核黃素水溶液的熒光強(qiáng)度與核黃素濃度呈正相關(guān)（圖1-A），表明通過熒光信號可以對核黃素濃度進(jìn)行定量。同時測定參數(shù)滿足流式細(xì)胞儀和液滴微流控細(xì)胞分選儀的檢測要求，故可用于核黃素含量的檢測。

對來源于同一工業(yè)菌株的R1 與P1 進(jìn)行了搖瓶發(fā)酵，使用分光光度法測定核黃素產(chǎn)量。發(fā)酵36 h后，P1 的產(chǎn)量明顯低于R1（圖1-B）。為評價流式細(xì)胞儀和液滴微流控對不同核黃素產(chǎn)量菌株的區(qū)分能力，收集R1 與P1 的發(fā)酵液細(xì)胞，對其進(jìn)行流式分析發(fā)現(xiàn)，36h時，R1 和P1 的平均熒光強(qiáng)度分別為82.08 a.u.和106.01 a.u.（圖1-C），表明流式細(xì)胞儀無法衡量菌株產(chǎn)量的高低。此外，將12h發(fā)酵液的上清包埋到微液滴中進(jìn)行檢測，R1 上清PMT 值為1 400 mV，P1 上清PMT 值為1 200 mV（圖1-D）。故液滴微流控技術(shù)可對胞外核黃素產(chǎn)量的高低進(jìn)行區(qū)分，與實(shí)際測得產(chǎn)量結(jié)果呈正相關(guān)。

為探究液滴微流控篩選高產(chǎn)菌株的可能性，按

1.2.3 所述方法將R1 和P1 使用液滴微流控系統(tǒng)進(jìn)行包埋。在培養(yǎng)18 h、24h和36h時使用熒光顯微鏡對液滴進(jìn)行觀察。如圖2 中所示，在上述3 個時間點(diǎn)，R1 與P1 的液滴熒光均有差異，其中液滴培養(yǎng)24 h時差異最為顯著。使用液滴微流控分選儀收集了每個時間點(diǎn)熒光值前1%的2 000 個液滴，將其涂布在LB 平板上，R1 與P1 在不同培養(yǎng)時間點(diǎn)均只長出1-2個單菌落，極低的細(xì)胞成活率阻礙了液滴微流控對高產(chǎn)菌株的篩選。同時進(jìn)一步優(yōu)化種子液培養(yǎng)時間、液滴分選電壓以及發(fā)酵培養(yǎng)基的糖濃度均未能提高細(xì)胞的成活率。因此，液滴微流控雖然能區(qū)分出不同產(chǎn)量的核黃素工程菌株，但不適用于目標(biāo)菌株的分選。后續(xù)研究中我們建立了通量相對較低的96 孔板篩選方法，用于高產(chǎn)菌株的篩選。

2.2 96孔板篩選核黃素高產(chǎn)菌株方法的建立

為了建立最優(yōu)的96 孔板篩選方法，將熒光檢測/分光光度檢測，振蕩培養(yǎng)/靜置培養(yǎng)兩組條件進(jìn)行了組合分析。組合后的篩選操作流程如圖3 所示。

圖1 熒光與核黃素濃度的關(guān)系及流式細(xì)胞分析與液滴微流控分析結(jié)果

圖2 R1 和P1 液滴核黃素?zé)晒庑盘枅D

圖3 96 孔板篩選示意圖

96 孔板振蕩培養(yǎng)條件下，18 h-36h時分光光度法測定的R1 的核黃素產(chǎn)量均高于P1（圖4-A）；24h后的熒光強(qiáng)度不能正確反應(yīng)產(chǎn)量高低趨勢（圖4-B），熒光檢測不能對菌株產(chǎn)量進(jìn)行有效區(qū)分。96孔板靜置培養(yǎng)條件下，18 h-36h時，分光光度法測定的R1 和P1 的核黃素產(chǎn)量差異不顯著（圖4-C）；18 h、24 h、36h時R1 的平均熒光強(qiáng)度均高于P1（圖4-D），熒光檢測法則可明顯區(qū)分菌株產(chǎn)量高低。因此，96 孔板振蕩培養(yǎng)-分光光度法和96 孔板靜置培養(yǎng)-熒光法均可實(shí)現(xiàn)核黃素不同產(chǎn)量菌株的區(qū)分。如圖3 所示，靜置-熒光法檢測流程更加簡便，故是一種更優(yōu)的篩選方法。

2.3 96孔板靜置培養(yǎng)-熒光檢測法篩選核黃素高產(chǎn)菌株

使用96 孔板靜置培養(yǎng)-熒光檢測法對工業(yè)菌株S1 突變體庫進(jìn)行篩選。首先對S1 的突變體庫在LB 平板上進(jìn)行初篩。在之前的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，單菌落過小的個體發(fā)酵后產(chǎn)量明顯低于平均水平。因此，依據(jù)菌落直徑大于0.5 mm 的原則，在約3 500 個菌落中挑選了約1 300 個菌落進(jìn)行初篩，初篩結(jié)果如圖5-A 所示。將初篩選得到的菌株按熒光強(qiáng)度排序，選取熒光強(qiáng)度前12%的菌株進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩結(jié)果與初篩的趨勢相似，從復(fù)篩得到的菌株中選取熒光相對較高的3 株菌（1#、2#、3#）進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)1#、2#、3#相對出發(fā)菌S1 核黃素產(chǎn)量均有提高，36h時產(chǎn)量分別為2.3 g/L、2.4 g/L、2.53 g/L（圖5-B），較出發(fā)菌分別提高了4.5%、9%和15%，說明96 孔板靜置培養(yǎng)-熒光檢測法可以用于高產(chǎn)核黃素工業(yè)枯草芽孢桿菌的篩選。

圖4 96 孔板振蕩和靜置培養(yǎng)

3 討論

核黃素作為經(jīng)典的生物發(fā)酵產(chǎn)品，已有許多關(guān)于菌株非理性改造與理性改造的研究［26-27］，然而與篩選方法相關(guān)的研究卻比較少，這可能是由于直接通過觀察單菌落的顏色即可粗略評價產(chǎn)量高低［28］。近年來隨著流式細(xì)胞分選，液滴微流控分選等方法的發(fā)展，國外已經(jīng)有一些關(guān)于核黃素菌株高通量篩選方法的研究［24-25］。然而這些研究的出發(fā)菌株的核黃素產(chǎn)量并不高，因而有必要開發(fā)針對高產(chǎn)菌株的篩選方法。在本研究中，我們首先評價了超高通量的流式細(xì)胞篩選和液滴微流控篩選兩種方法在核黃素高產(chǎn)工業(yè)菌株篩選中的應(yīng)用。我們發(fā)現(xiàn)，正如文獻(xiàn)中推測的，核黃素由于具有胞外分泌的特性，因而其高產(chǎn)菌株的胞內(nèi)核黃素含量并不一定高［25］。這就造成了使用流式細(xì)胞檢測不能正確評價總產(chǎn)量的高低。而液滴微流控相當(dāng)于一個微反應(yīng)器，細(xì)胞生產(chǎn)的核黃素全部封閉在液滴中。因而可以將液滴的熒光高低等同于核黃素產(chǎn)量的高低。遺憾的是，在該研究中，我們并沒有使用液滴微流控成功分選到足夠數(shù)量的細(xì)胞。由于一些未知原因，經(jīng)過分選的細(xì)胞成活率非常低。我們推測這可能與分選時的脈沖電壓，培養(yǎng)基的組分以及核黃素生產(chǎn)菌本身的自溶現(xiàn)象有關(guān)。對于液滴微流控分選成活率低的問題，我們測試了實(shí)驗(yàn)室保藏的其他核黃素生產(chǎn)菌株，其中一些菌株的成活率可以滿足分選的需要。雖然這些菌株的核黃素產(chǎn)量低于S1、R1 等高產(chǎn)菌株，但可以利用其作為底盤菌株篩選對產(chǎn)量有提升作用的核黃素代謝途徑酶的突變體，利用代謝工程可以將突變體整合到高產(chǎn)菌株中以提高核黃素產(chǎn)量。研究并解決相關(guān)問題，將成為高通量篩選核黃素高產(chǎn)工業(yè)菌株方法的突破，將更有推廣應(yīng)用的價值。而流式細(xì)胞分選的研究也并非沒有實(shí)際意義。由于現(xiàn)在核黃素外排的分子機(jī)制還不清楚，因此檢測胞內(nèi)核黃素的變化可以了解其外排的情況，篩選胞內(nèi)核黃素含量變化的菌株，也可以幫助尋找相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

圖5 96 孔板靜置初篩、復(fù)篩及搖瓶驗(yàn)證

本文通過對孔板培養(yǎng)方式與核黃素檢測方法的比較，建立了孔板靜置培養(yǎng)-熒光檢測篩選方法。發(fā)酵培養(yǎng)基中含有對檢測造成干擾的不溶顆粒、細(xì)胞以及色素物質(zhì)，并且部分核黃素會以顆粒形式存在于發(fā)酵液中，因此使用分光光度法對發(fā)酵液進(jìn)行檢測前需用稀堿溶解，然后離心取上清進(jìn)行檢測。不但流程繁瑣，而且需要孔板離心機(jī)，操作相對復(fù)雜。使用熒光進(jìn)行檢測時，由于核黃素的熒光具有特異性，培養(yǎng)基中的其他成分不會對其進(jìn)行干擾，因此可以直接進(jìn)行測定，步驟簡單、快速。并且靜置培養(yǎng)可以作為液滴培養(yǎng)的預(yù)試驗(yàn)方法，為后期液滴微流控方法的建立提供參考。從S1 出發(fā)，通過該方法進(jìn)行一輪的篩選，突變體中產(chǎn)量最高的菌株產(chǎn)量達(dá)到2.53 g/L。實(shí)驗(yàn)室中保藏的菌株R1，為從S1 出發(fā)，通過大量平板篩選，搖瓶驗(yàn)證，在3 年中篩選得到的產(chǎn)量最高的菌株。使用S1 作為出發(fā)菌株進(jìn)行孔板篩選，同時對比了平板篩選和孔板篩選的效率。然而與流式細(xì)胞篩選和液滴微流控篩選相比較，其通量有差距，但在現(xiàn)有的流式分選與液滴微流控分選不適用于目標(biāo)菌株的條件下，可通過多輪的篩選實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。

4 結(jié)論

本研究考察了不同的篩選技術(shù)，如流式細(xì)胞分選、液滴微流控、96 孔板靜置及振蕩培養(yǎng)，在核黃素菌株篩選方面的效果。流式細(xì)胞儀不能實(shí)現(xiàn)高低產(chǎn)菌的區(qū)分；液滴微流控可以對高低產(chǎn)菌株進(jìn)行區(qū)分，但現(xiàn)有方法不適用于菌株分選。因此我們建立了96 孔板篩選方法，靜置培養(yǎng)-熒光檢測法可以實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)菌株與低產(chǎn)菌株的區(qū)分，且該方法簡便、快速、具有較好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。利用靜置培養(yǎng)-熒光檢測法從工業(yè)菌突變體庫中篩選到了核黃素產(chǎn)量提高的菌株，證明了該方法具有實(shí)際應(yīng)用意義。