周雅琳 張敏佳 劉偉 李雍 秦勇 許雅君

環(huán)境污染造成的不良妊娠結(jié)局包括宮內(nèi)生長發(fā)育受限、遲緩、早產(chǎn)、低出生體重，不僅會增加兒童期患病/死亡的風險，也會增加成人期某些疾病如高血壓、冠心病、糖尿病等的易感性[1]。孕期環(huán)境顆粒物暴露是引起不良妊娠結(jié)局的重要危險因素。人群流行病學研究發(fā)現(xiàn)孕期PM2.5(fine particulate matter, PM2.5)暴露與早產(chǎn)、新生兒低出生體重有關(guān)[2-3]；動物實驗研究也表明：孕鼠PM2.5暴露，引起早產(chǎn)以及子代出生體重下降[4]。大量研究認為氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)是母體PM2.5暴露引起不良妊娠結(jié)局的重要分子機制[5-7]。槲皮素廣泛存在于水果、蔬菜及一些中草藥中，是人類飲食中最主要的生物類黃酮，具有明顯的抗炎、抗氧化以及孕期安胎作用[8-10]。因此，槲皮素是否能夠通過拮抗氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)來改善母體PM2.5暴露引起的不良妊娠結(jié)局，相關(guān)研究仍較為缺乏。此外，盡管當前有許多研究探索孕期PM2.5暴露對妊娠結(jié)局的影響，但是，幾乎沒有研究探索孕期PM2.5暴露引起的不良妊娠結(jié)局，是否也會在子代中出現(xiàn)。因此，本研究通過建立跨代遺傳的動物模型，探索母體PM2.5暴露引起的不良妊娠結(jié)局是否會持續(xù)出現(xiàn)在子F2代中，同時探究槲皮素干預對母體PM2.5暴露引起的不良妊娠結(jié)局是否具有改善效應(yīng)。

材料與方法

一、材料

1. 實驗動物與分組：健康成年SPF級雌、雄性ICR小鼠，體重(30±2) g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2015-0015]。動物飼養(yǎng)在屏障環(huán)境，溫度(22±2)℃，相對濕度50%～60%，晝夜照明時間為12 h:12 h。實驗動物給予普通飼料喂養(yǎng)，正常飲水。

2.PM2.5采集與制備：采用TH-150C型號智能中流量(TSP)采樣器(天虹智能儀器表廠，武漢)進行PM2.5采集，采樣時間為2016年9月15日—2016年11月14日，采樣地點位于北京大學醫(yī)學部公共衛(wèi)生學院六層平臺，采樣高度為15 m (附近無高大建筑物阻擋)，采樣流量設(shè)置為0.1 m3/min，顆粒物采集于石英濾膜上。用滅菌手術(shù)剪將載有顆粒物的石英濾膜剪成3 cm×4 cm大小，加入超純水，水浴超聲震蕩20 min，加冰保持水溫在20 °C以下，重復3次，收集洗脫液，并用6層滅菌紗布過濾。真空冷凍干燥后，用無菌PBS配制成不同濃度貯備液，-20℃避光保存。空白對照組的滴注液直接用干凈的濾膜進行上述洗脫操作。

二、方法

1.實驗操作：健康性成熟雌雄ICR小鼠按1∶1于黃昏時(18:00)合籠交配，第二天早上(7:00)檢查陰栓，見陰栓即為受孕即為F0代孕鼠，當天定為妊娠第0天(GD0)，已確定懷孕的雌鼠單籠飼養(yǎng)，并喂繁殖期飼料，每天觀察雌鼠有無嗜睡、煩躁、行動不便、陰道流血等異常情況出現(xiàn)。將孕鼠隨機分為3組，空白對照組(12只)、PM2.5 (15 mg/kg) 染毒組(15只)、PM2.5+槲皮素干預組 (100 mg/kg)。實驗期間動物自由飲水和進食。PM2.5染毒組、PM2.5+槲皮素干預組劑量的確定是根據(jù)本實驗室前期研究結(jié)果確定[10]。

2. PM2.5染毒：各組F0代孕鼠分別于GD3、GD6、GD9、GD12、GD15上午，及產(chǎn)后5 d(LD5)、LD10、LD15在3%異氟烷短效氣體麻醉下進行氣管滴注：空白對照組給與1 mL/kg干凈石英濾膜洗脫液滴注，PM2.5染毒組、PM2.5+槲皮素干預組按照1 mL/kg的體積滴注15 mg/kg PM2.5溶液

3. 灌胃：槲皮素(購自sigma公司，純度≥95%)，以0.15%羧甲基纖維素鈉為分散系。F0代母鼠在孕期、哺乳期每日灌胃?？瞻讓φ战M、PM2.5染毒組給予0.1%的羧甲基纖維素鈉水溶液灌胃，PM2.5+槲皮素干預組給與100mg/kg槲皮素灌胃。

4.跨代遺傳的動物模型建立

F0代孕鼠分娩得到F1代小鼠母乳喂養(yǎng)，分娩后第3天，將每窩仔鼠按照性別分別稱重并編號，根據(jù)仔鼠體重，利用隨機數(shù)表法隨機選擇雌、雄仔鼠各3只，其余處死；于產(chǎn)后21 d離乳，雌雄分籠飼養(yǎng)。各實驗組F1代在7～8周齡性成熟后進行組內(nèi)交配傳代：各實驗組每窩仔鼠中隨機選擇1雌1雄進行1∶1交配合籠，得到F1代孕鼠；F1代孕鼠分娩后得到F2代，按照如上操作，各實驗組F2代雌雄小鼠進行組內(nèi)交配得到F3代。由此建立組內(nèi)交配的跨代遺傳模型。傳代過程中避免同窩交配和近親繁殖(如圖1)。

5.實驗動物相關(guān)指標監(jiān)測：每隔6 d監(jiān)測母鼠孕期體重變化和攝食量，計算食物利用率，母鼠孕期食物利用率(%) =母鼠孕期體重變化值(g) / 母鼠孕期攝食量(g)×100%；記錄各實驗組孕鼠分娩情況包括妊娠時間、產(chǎn)仔數(shù)、性別比、活產(chǎn)、死胎以及子代小鼠出生體重。

結(jié) 果

一、F0～F2代孕鼠孕期體重、食物利用率

各實驗組F0～F2代孕鼠孕期體重變化以及食物利用率如圖2所示：各實驗組F0～F2代孕鼠孕期體重及食物利用率的組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各實驗組F0～F2代孕鼠妊娠時間、產(chǎn)仔數(shù)、性別比結(jié)果如表1、2、3所示：各實驗組F0～F2代孕鼠妊娠時間、產(chǎn)仔數(shù)、性別比以及活產(chǎn)數(shù)、死胎數(shù)的組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 內(nèi)交配跨代遺傳模型Fig.1 Transgenerational models generated by intra-group matingF0-C:F0 pregnant mice in control group;F0-A:F0 pregnant mice in PM2.5 group; F0-H:F0 pregnant mice in PM2.5+qucertein intervention group. F0 pregnant mice gave birth to F1offspring. F1-C:F1 offspring in control group; F1-A:F1 offspring in PM2.5 group; F1-H:F1 offspring in PM2.5+qucertein intervention group. F1 males were mated to F1 females within each group to obtain F2 offspring. F2-C:F2 offspring in control group; F2-A:F2 offspring in PM2.5 group; F2-H:F2 offspring in PM2.5+qucertein intervention group. Similarly, F2 males were mated to F2 females within each group to produce F3 offspring. F3-C:F3 offspring in control group; F3-A:F3 offspring in PM2.5 group; F3-H:F3 offspring in PM2.5+qucertein intervention group

圖2 F0-F1代孕鼠孕期體重及食物利用率Fig.2 The body weight and foodutilization rate of F0～F2 pregnant mice during gestationA:the body weight of F0 pregnant mice during gestation; B:the food utilization rate of F0 pregnant mice during gestation; C:the body weight of F1 pregnant mice during gestation; D:the food utilization rate of F1 pregnant mice during gestation; E:the body weight of F2 pregnant mice during gestation; F:the food utilization rate of F2 pregnant mice during gestation.

二、F1～F3代小鼠出生體重

各實驗組F1～F3代小鼠出生體重如圖3所示：與空白對照組相比，PM2.5染毒組F1～F2代小鼠出生體重下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.008,P=0.039)；按性別分組后， 與空白對照組相比，PM2.5染毒組F1～F2代雄性仔鼠的出生體重下降(P<0.001,P=0.038)，而PM2.5染毒組F1～F2代雌性小鼠出生體重雖有所下降，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與空白對照相比，PM2.5染毒組F3代小鼠出生體重組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。經(jīng)槲皮素干預后，F(xiàn)1～F3代小鼠出生體重有所增加，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 F0代妊娠結(jié)局Table 1 Pregnany outcomes of F0 generation

F0-C:F0 pregnant mice in control group;F0-A:F0 pregnant mice in PM2.5 group; F0-H:F0 pregnant mice in PM2.5+qucertein intervention group.

表2 F1代妊娠結(jié)局Table 2 Pregnany outcomes of F1 generation

F1-C:F1 offspring in control group;F1-A:F1 offspring in PM2.5 group; F1-H:F1 offspring in PM2.5+qucertein intervention group.

表3 F2代妊娠結(jié)局Table 3 Pregnany outcomes of F3 generation

F2-C:F2 offspring in control group;F2-A:F2 offspring in PM2.5 group; F2-H:F2 offspring in PM2.5+qucertein intervention group.

圖3 F1-F3代仔鼠出生體重Fig.3 The birth weight of F1-F3 offspringA:the birth weight of F1 offspring, F1 female offspring and F1 male offspring; B:the birth weight of F2 offspring, F2 female offspring and F2 male offspring; C:the birth weight of F3 offspring, F3 female offspring and F3 male offspring; * PM2.5 vs. Control, P<0.05.

討 論

在本研究中，通過建立小鼠跨代遺傳模型，探究母體PM2.5暴露引起的不良妊娠結(jié)局是否會持續(xù)出現(xiàn)在F2代中以及槲皮素的干預作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，母體PM2.5暴露引起F1～F2代小鼠出生體重下降，并且具有性別特異性，只在雄性小鼠中出現(xiàn)，本實驗劑量下槲皮素干預可以在一定程度上改善母體PM2.5暴露引起的低出生體重，這種改善效應(yīng)隨著代際的傳遞而減弱。然而，母體PM2.5暴露對其他相關(guān)妊娠結(jié)局如母鼠孕期體重、妊娠時間、產(chǎn)仔數(shù)、性別比、活產(chǎn)數(shù)以及死胎數(shù)沒有影響，也未發(fā)現(xiàn)槲皮素的改善效應(yīng)。

孕期環(huán)境不良因素的刺激往往造成子代出生體重的異常。本研究發(fā)現(xiàn)母體PM2.5暴露引起F1代小鼠出生體重降低，按性別劃分后，PM2.5染毒組F1代雄性仔鼠出生體重下降，而雌性仔鼠的出生體重無顯著改變，這提示：母體PM2.5暴露引起F1代小鼠出生體重降低，并且這種效應(yīng)存在性別特異性，雄性小鼠更加易感，這也與當前許多研究結(jié)論是一致的[2, 11-14]；在組內(nèi)交配的跨代遺傳模型中，我們在F2代小鼠中發(fā)現(xiàn)了與F1代相同的低出生體重的異常表型，以及這種不良表型的性別特異性。直至F3代，不論是否按照性別分組，母體PM2.5暴露引起的低出生體重的表型不復存在。當前有研究認為，表觀遺傳修飾改變是環(huán)境因素誘導的不良妊娠結(jié)局的重要的分子機制之一[15]。Panasevich等對挪威面裂人群隊列的研究發(fā)現(xiàn)，孕期吸煙或二手煙暴露的母親，子代出生后，全基因組甲基化水平發(fā)生改變，其中有一部分基因與胎盤以及胚胎的生長發(fā)育相關(guān)[16]。而當與胎盤及胚胎的生長發(fā)育相關(guān)的基因表觀遺傳修飾的改變發(fā)生在生殖系細胞中時，母體PM2.5暴露引起的不良妊娠結(jié)局是可能在代際間進行傳遞的。然而，在本研究中，發(fā)現(xiàn)低出生體重的異常表型并沒有持續(xù)出現(xiàn)在F3代，可能是因為，表觀遺傳修飾引起的異常表型在子代間傳遞的分子機制十分復雜，自然選擇在該過程中也發(fā)揮重要的作用[17]，為保證機體更好的適應(yīng)環(huán)境，有些異常表型會隨著代際而逐漸消失[18]，即出現(xiàn)本研究中母體PM2.5暴露致子代低出生體重隨著代際的傳遞而減弱的現(xiàn)象。

除了子代小鼠出生體重外，本研究并沒有發(fā)現(xiàn)母體PM2.5暴露對其他妊娠結(jié)局指標如孕期體重、妊娠時間、產(chǎn)仔數(shù)、性別比、活產(chǎn)數(shù)和死胎數(shù)的影響。當前已有研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露引起體重增加，是肥胖發(fā)生的危險因素。然而，研究沒有發(fā)現(xiàn)母體PM2.5暴露對孕期體重的影響，在跨代遺傳的模型中，PM2.5染毒組F1～F2代孕鼠孕期體重也無顯著變化。這與本課題組張敏佳的研究結(jié)果是相一致的，在其研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，孕期PM2.5暴露對母體孕期體重以及孕期凈增重均無顯著的影響。而在Yi的研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠孕期PM2.5暴露引起體重增長程度降低[19]。此外，人群流行病學研究發(fā)現(xiàn)，孕期環(huán)境PM2.5暴露會增加早產(chǎn)的風險[20-21]；動物實驗結(jié)果表明，母體孕期PM2.5暴露縮短妊娠時間[22]、降低雄/雌性別比、增加死胎數(shù)等[23]，然而本研究并沒有發(fā)現(xiàn)F0代孕鼠PM2.5暴露對妊娠時間、性別比、產(chǎn)仔數(shù)、死產(chǎn)、死胎數(shù)的影響。而PM2.5染毒組F1～F2代孕鼠以上妊娠結(jié)局指標也無明顯改變。這些研究結(jié)論的差異可能與選擇的研究對象、PM2.5染毒劑量、組成成分有關(guān)。這也提示，仍然需要更多的人群以及動物實驗研究來進一步探究孕期PM2.5暴露對孕期體重、妊娠時間、產(chǎn)仔數(shù)、性別比、活產(chǎn)數(shù)和死胎數(shù)的影響。槲皮素通過母體吸收很容易通過胎盤，可能會直接(經(jīng)胎盤傳遞)或間接(槲皮素對胎盤的影響)影響胚胎的生長發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，盡管差異沒有統(tǒng)計學意義，孕期PM2.5暴露的F0代孕鼠給與100 mg/kg的槲皮素干預，能夠改善F1代的出生體重，但這種改善效應(yīng)隨著代際的傳遞而減弱。已知孕期本身就是一個氧化應(yīng)激、免疫應(yīng)答水平增加的一個狀態(tài)，而親代環(huán)境顆粒物的暴露可能會加劇氧化應(yīng)激造成的損傷。母體氧化損傷以及炎癥水平增加，會引起胎盤發(fā)育異常，導致胎兒生長發(fā)育受限，出現(xiàn)低出生體重[21, 24]。而槲皮素具有極強的抗炎和抗氧化的作用，因此，可以認為，槲皮素改善子代小鼠第出生體重可能與其抗炎和抗氧化作用有關(guān)。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)槲皮素(100 mg/kg)干預后，母鼠血清中氧化應(yīng)激產(chǎn)物以及炎癥水平有所下降，胎鼠身長及體重增加[10]。而這種改善效應(yīng)在代際間的減弱則可能是因為，槲皮素雖然可以改善氧化應(yīng)激和炎癥損傷，但是無法拮抗孕期PM2.5暴露引起的生長發(fā)育相關(guān)基因的表觀遺傳修飾的改變。

母體PM2.5暴露引起的子代低出生體重效應(yīng)會傳遞至F2代，并隨著代際減弱，而不會影響到F3代；并且這種效應(yīng)具有性別特異性，只在雄性小鼠中出現(xiàn)；本實驗劑量的槲皮素干預，可以在一定程度上改善子代的低出生體重，但這種改善作用也會隨著代際的傳遞而逐漸減弱。