曹雙雙 陳世超 解丹 梁義娟

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤之一[1]，是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的上皮源性惡性腫瘤，近年來(lái)其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡也逐漸呈現(xiàn)年輕化。有研究表明，某些microRNA(miRNA)與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展具有一定相關(guān)性。如研究發(fā)現(xiàn)miRNA-139-5p在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)的miRNA-139-5p通過(guò)靶向基因HOXA10抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移能力[2]。還有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-34a，miRNA-424和miRNA-513直接調(diào)控基因MMSET來(lái)削弱子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲和球形形成能力進(jìn)而抑制子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和疾病進(jìn)展過(guò)程，并證明miRNA-34a，miRNA-424和miRNA-513的表達(dá)降低與子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后較差密切相關(guān)[3]。本研究通過(guò)檢測(cè)miRNA-182 和miRNA-152在早期子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)情況，探究二者在子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展過(guò)程中扮演的角色，以期對(duì)其早期篩查、診斷和臨床治療提供新方向，為實(shí)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌的分子靶向治療奠定基礎(chǔ)。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：選取2018年3月至2018年8月在河北大學(xué)附屬醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的早期子宮內(nèi)膜癌患者和因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)的患者各40例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均由本院首次診治；(2)早期子宮內(nèi)膜癌患者均經(jīng)病理確診；(3)子宮肌瘤患者均經(jīng)病理除外子宮內(nèi)膜病變；(4)術(shù)前未經(jīng)放療、化療、激素及生物治療；(5)患者無(wú)嚴(yán)重肝腎功能損害或多器官功能損害，無(wú)自身免疫性疾病及血液系統(tǒng)疾病，未合并其他類(lèi)型惡性腫瘤，并能耐受手術(shù)者；(6)所有患者均有本院明確的病理結(jié)果；(7)臨床資料完整，術(shù)中收集組織標(biāo)本；(8)經(jīng)告知同意，并愿意配合、簽署知情同意書(shū)。

2.方法：分別于術(shù)中切取子宮內(nèi)膜癌腫瘤組織和正常子宮內(nèi)膜組織。所有組織均在子宮離體30分鐘內(nèi)切取并迅速放入液氮中，立即轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。所有?shí)驗(yàn)組標(biāo)本均經(jīng)本院病理科同一醫(yī)師術(shù)后病理結(jié)果確診為早期子宮內(nèi)膜癌，對(duì)照組術(shù)后病理提示子宮肌瘤，并均除外子宮內(nèi)膜病變。

3.實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)：用Lysis/Binding buffer試劑盒(Invitrogen公司)提取早期子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織的總RNA，每一步均嚴(yán)格參照說(shuō)明書(shū)的詳細(xì)步驟進(jìn)行。酶標(biāo)儀測(cè)定所提取的總RNA的濃度以及純度，并使用移液槍取1ug·ml-1RNA，進(jìn)行加尾及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。利用miDETECT A TrackTM miRNA qRT-PCR Kit試劑盒(With ROXI)(廣州銳博生物科技有限公司)以cDNA作為模板，使用miRNA-182、miRNA-152和對(duì)照S5引物配制PCR反應(yīng)體系:2×qPCR Mix 17.5 μl；2.0 μmol·L-1引物0.5 μl； cDNA 2.0 μl；輕輕混勻后離心，放入熒光定量PCR儀(Life Technologies公司的7300 Real-Time PCR System)中。設(shè)置反應(yīng)條件為:95℃ 預(yù)變性10 min; 95℃ 變性2 s，60℃ 30 s退火/延伸，循環(huán)40次；最后運(yùn)行溶解曲線(xiàn)程序。miRNA-152和miRNA-182所有引物及內(nèi)參S5均由廣州銳博生物科技有限公司合成。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT進(jìn)行分析，其中，ΔCT = CT目的基因-CT對(duì)照基因；ΔΔCT=ΔCT實(shí)驗(yàn)樣本-ΔCT對(duì)照樣本。

結(jié)果

1.研究對(duì)象一般特征

研究對(duì)象為2018年3月—2018年8月河北省保定市及周邊地區(qū)的經(jīng)病理確診的早期子宮內(nèi)膜癌患者，年齡49～58歲，平均(52.5±2.18)歲。經(jīng)病理除外子宮內(nèi)膜病變的子宮肌瘤患者，年齡49～55歲，平均(51.65±1.73)歲。兩組患者年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：

(1)miRNA-182在早期子宮內(nèi)膜癌組織中和正常子宮內(nèi)膜組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.5499±0.4808)和(0.7767±0.4072)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1。

(2)miRNA-152在早期子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.5010±0.2363)和(0.9037±0.2304)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2。

A:正常子宮內(nèi)膜組織 B:早期子宮內(nèi)膜癌組織圖1 子宮內(nèi)膜組織中miRNA-182相對(duì)表達(dá)情況

A:正常子宮內(nèi)膜組織 B:早期子宮內(nèi)膜癌組織圖2 子宮內(nèi)膜組織中miRNA-152相對(duì)表達(dá)情況

討論

子宮內(nèi)膜癌作為最常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害著廣大女性的生命健康，其疾病的發(fā)展是一個(gè)累積遺傳和表觀遺傳學(xué)改變的多步驟的過(guò)程。其發(fā)病率逐年升高，有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率在北美及歐洲等發(fā)達(dá)國(guó)家排名第4[4]，在中國(guó)僅落后于宮頸癌居第2位。其居高不下的發(fā)病率及發(fā)病人群逐漸年輕化的特點(diǎn)還同時(shí)帶來(lái)了一系列的社會(huì)問(wèn)題，如許多年輕患者以及她們的家庭有強(qiáng)烈的生育愿望，那么傳統(tǒng)的治療手段即手術(shù)治療對(duì)于這部分患者將不能作為首選治療方案。因此探尋子宮內(nèi)膜癌新的診療手段成為了當(dāng)下亟需解決的問(wèn)題。近年來(lái)，分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究不斷深入并取得了一定的進(jìn)展，miRNA重要的生物學(xué)功能逐漸被研究和證實(shí)，miRNA與惡性腫瘤千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系也逐漸被認(rèn)知和重視。miRNA是在進(jìn)化過(guò)程中能夠達(dá)到高度保守的非編碼的微小RNA，其長(zhǎng)度約為19～22個(gè)核苷酸，基因的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后的加工這幾個(gè)過(guò)程，而miRNA可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平后的基因表達(dá)的調(diào)控，因此相較于某些蛋白，它們更能夠從根本上調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而影響一系列的生命活動(dòng)。miRNA的種子序列以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式結(jié)合其對(duì)應(yīng)靶基因信使RNA(mRNA)的3′端非翻譯區(qū)，干擾靶基因mRNA翻譯過(guò)程的正常進(jìn)行，甚至可以使靶基因mRNA降解，從而激活或沉默靶基因[5]。miRNA可以通過(guò)影響細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化及細(xì)胞凋亡等生物學(xué)行為進(jìn)而調(diào)控機(jī)體的各種生理功能，其表達(dá)異常現(xiàn)已證實(shí)與多種人類(lèi)疾病相關(guān)，其與惡性腫瘤的演變過(guò)程關(guān)系密切[6-8]，這也已經(jīng)成為學(xué)者們關(guān)注和研究的熱點(diǎn)。miRNA-182和miRNA-152是近來(lái)較受關(guān)注的miRNA，研究證明與多種腫瘤關(guān)系密切。

miRNA-182定位于人7號(hào)染色體[9]。研究證實(shí)miRNA-182參與肝癌[10-11]、肺癌[12]、前列腺癌[13]、宮頸癌[14]、腎癌[15]等多種惡性腫瘤的疾病演變過(guò)程。miRNA-182在子宮內(nèi)膜癌中的研究較少，有研究認(rèn)為miRNA-182是子宮內(nèi)膜癌的促癌基因。梁靜等[16]的miRNA基因芯片篩選結(jié)果顯示miRNA-182在子宮內(nèi)膜樣腺癌中表達(dá)明顯上調(diào)。還有研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，miRNA-182可干擾子宮內(nèi)膜癌腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程，并同時(shí)可提高其增殖活性，并證明對(duì)子宮內(nèi)膜癌腫瘤細(xì)胞的調(diào)控是通過(guò)靶向基因Foxo1實(shí)現(xiàn)的[17]。盡管已經(jīng)有一定的研究基礎(chǔ)，但這一結(jié)論還目前還缺乏大量的臨床組織學(xué)驗(yàn)證。

miRNA-152是miRNA-148/152家族的成員之一，它位于人類(lèi)的第17號(hào)染色體和小鼠的第11號(hào)染色體上[18]。miRNA-152目前已經(jīng)被證實(shí)在許多種惡性腫瘤如肝癌[19]、乳腺癌[20]、結(jié)直腸癌[21]、宮頸癌[22]、卵巢癌[23]及膀胱癌[24]中充當(dāng)抑癌因子，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。近年來(lái)，逐漸開(kāi)始有國(guó)內(nèi)外的學(xué)者對(duì)miRNA-152與子宮內(nèi)膜癌疾病發(fā)生和演變的相關(guān)性密切關(guān)注并展開(kāi)研究。這些主要研究集中在細(xì)胞水平，證明了miRNA-152通過(guò)不同調(diào)控通路影響子宮內(nèi)膜癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及分化等生物學(xué)功能。如有研究認(rèn)為，miRNA-152靶向基因WNT-1[25]和c-MET[26]調(diào)控子宮內(nèi)膜腫瘤細(xì)胞增殖水平。還有學(xué)者認(rèn)為miRNA-152-3p的表達(dá)受激素的調(diào)控，如孕酮可使miRNA-152-3p表達(dá)水平提高，進(jìn)而降低子宮內(nèi)膜癌上皮細(xì)胞的增殖活性，并進(jìn)一步提出CDC14A可能是miRNA-152-3p的靶蛋白[27]。Tsuruta等[28]研究表明miRNA-152的抑癌作用與DNA高甲基化有關(guān)，miRNA-152靶向DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferasel,DNMT1)，miRNA-152的表達(dá)活性被DNA高甲基化抑制，進(jìn)一步使子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖能力降低。還有學(xué)者在此基礎(chǔ)上研究發(fā)現(xiàn)組蛋白乙?；虳NA甲基化通過(guò)誘導(dǎo)miRNA-152高表達(dá)進(jìn)一步抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及分化等生物學(xué)行為，發(fā)揮其抑癌因子的作用[29]。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)miRNA-152可以使子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的G2/M期阻滯，干擾其正常的細(xì)胞增殖進(jìn)程，這一功能是通過(guò)靶向CDC25B實(shí)現(xiàn)的[30]。

在此基礎(chǔ)之上，本課題在組織學(xué)水平開(kāi)展研究，研究結(jié)果顯示miRNA-182子宮內(nèi)膜癌組織標(biāo)本中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常內(nèi)膜組，提示在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和疾病進(jìn)展過(guò)程中扮演促癌因子的角色。miRNA-152在早期子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平相較于對(duì)照組正常子宮內(nèi)膜組織明顯降低，證明了miRNA-152是子宮內(nèi)膜癌的腫瘤抑癌因子，在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生和疾病進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮不可或缺的關(guān)鍵作用。

子宮內(nèi)膜癌發(fā)病原因至今并沒(méi)有完全明確，發(fā)病率也存在著較為明顯的種族差異和地域差異。目前普遍認(rèn)為遺傳、吸煙、肥胖、高血壓、糖尿病及激素治療等是其發(fā)病的高危因素，但其導(dǎo)致癌癥發(fā)生和進(jìn)展的具體分子機(jī)制未明。近來(lái)有國(guó)外學(xué)者研究證明增加適當(dāng)?shù)捏w育鍛煉活動(dòng)可以提高子宮內(nèi)膜癌患者的生活質(zhì)量[31]。本研究結(jié)果顯示，在觀察組早期子宮內(nèi)膜癌組織中，相較于對(duì)照組子宮內(nèi)膜組織miRNA-182和miRNA-152呈現(xiàn)出不同的表達(dá)水平，前者呈現(xiàn)高表達(dá)的狀態(tài)，而后者則表達(dá)降低。推測(cè)子宮內(nèi)膜癌的疾病發(fā)生和演變過(guò)程與miRNA-182和miRNA-152的表達(dá)失常有直接關(guān)系，二者可能通過(guò)某些或簡(jiǎn)單或復(fù)雜的調(diào)控通路對(duì)子宮內(nèi)膜癌腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能造成一定的影響，進(jìn)而促進(jìn)或抑制子宮內(nèi)膜癌疾病的發(fā)生和演變過(guò)程。其有望成為子宮內(nèi)膜癌篩查、診斷、判斷預(yù)后以及治療后隨訪(fǎng)的分子生物標(biāo)志物，并為子宮內(nèi)膜癌的分子靶向治療提供理論基礎(chǔ)。但目前二者的研究主要集中在分子水平，缺乏大量的臨床組織學(xué)驗(yàn)證，且本研究時(shí)間較短、樣本量較小，并僅僅取材于早期腫瘤組織，故其是否與子宮內(nèi)膜癌的疾病進(jìn)展、腫瘤分型、病理分級(jí)以及其他臨床病理參數(shù)相關(guān)仍不清楚，是否影響子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后也并不能確定，需要我們進(jìn)一步加大樣本量繼續(xù)深入研究和隨訪(fǎng)。