范三紅，李穎星，白寶清

（1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006；2.山西大學特色植物資源研究與利用山西重點實驗室，山西 太原 030006）

清香型白酒獨特的固態(tài)多微釀造及固態(tài)蒸餾工藝賦予了其豐富的呈香呈味物質(zhì)和生物活性成分[1-2]。高級醇[3]是白酒中重要的呈香物質(zhì)，主要由釀酒酵母在釀造的主發(fā)酵時間段生成，它能夠增加白酒的協(xié)調(diào)感和飽滿感，賦予白酒特殊的香氣，給人愉悅的感覺，若濃度過高，則有令人不快的雜異味，并且飲用后容易“上頭”，危害人體的健康[4]。正丙醇、2-甲基-1-丙醇（異丁醇）、3-甲基-1-丁醇（異戊醇）和β-苯乙醇占白酒高級醇總量的70%～80%[5]。

一般測定酒類中揮發(fā)性香氣成分的方法是基于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）來實現(xiàn)[6-8]。孫嘯濤等[1]采用渦旋輔助液液微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法對67種白酒中四甲基吡嗪等物質(zhì)進行了檢測；吳繼源[8]采用氣相色譜內(nèi)標法測定白酒中乙酸乙酯含量；趙東瑞等[9-10]應(yīng)用固相微萃取法、液液萃取法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析手段對芝麻香型白酒中含硫化合物進行定性分析。

目前關(guān)于白酒中高級醇的文獻較少，由于白酒中的高級醇的含量很低，因此在色譜測定之前需要對其進行萃取和濃縮處理[10-13]。張倩等[14]應(yīng)用液液萃取法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜-嗅聞聯(lián)用儀分析2種芝麻香型白酒中香氣活性成分；倪偉等[6]采用分散液液微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用的方法檢測了幾種市售葡萄酒中的主要高級醇；李建民等[15]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用研究酒醅中該酵母麩曲的不同添加比例對陶融型原酒中高級醇含量的影響；張雪雪等[16]采用氣相色譜內(nèi)標法對二鍋頭等酒中甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇等物質(zhì)進行了定量；唐暉慧等[17]采用分散液液微萃取結(jié)合氣相色譜-火焰光度檢測器法測定芝麻香型白酒中3-甲硫基丙醇的含量。

本實驗建立了渦旋輔助分散液液微萃取-氣相色譜法（dispersive liquid-liquid microextraction-gas chromatography，DLLME-GC）測定清香型白酒中高級醇的方法，對白酒樣中分散液液微萃取條件進行了優(yōu)化[18]，并測定其在6種不同酒精度清香型白酒中的含量，以期為研究清香型白酒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6種市售清香型白酒酒樣（編號為Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5、Y-6）：（酒精度分別為18%vol、42%vol、42%vol、53%vol、53%vol、53%vol）；正丙醇（純度99.7%）、異丁醇（純度99.0%）、異戊醇（純度99.0%）、2,3-丁二醇（純度98.0%）、β-苯乙醇（純度99.0%）、乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯乙烯、三氯甲烷、四氯乙烯、二氯甲烷、溴苯（均為分析純）：北京百靈威科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2010氣相色譜儀：島津企業(yè)管理（中國）有限公司；Vortex-6渦旋混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；AL204電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TG16A-W高速離心機：上海金鵬分析儀器有限公司；PB-10酸度計：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 模擬酒樣、標準溶液、標準工作液的配制

模擬酒樣：準確移取900 μL正丙醇、異丁醇、異戊醇、2,3-丁二醇，200 μLβ-苯乙醇標準品溶液，用體積分數(shù)為15%的乙醇溶液定容至500 mL，配制模擬酒樣。

標準溶液：準確移取100 μL正丙醇、異丁醇、異戊醇、2,3-丁二醇標準品溶液，20 μLβ-苯乙醇溶液于容量瓶中，分別用體積分數(shù)為15%的乙醇溶液定容至100 mL，使正丙醇、異丁醇、異戊醇、2,3-丁二醇體積分數(shù)為0.1%，β-苯乙醇體積分數(shù)為0.02%，4 ℃冰箱存儲備用。

標準工作液：取適量標準溶液用體積分數(shù)為15%的乙醇溶液逐級稀釋，得到正丙醇、異丁醇質(zhì)量濃度為1.00～40.00 mg/L、異戊醇質(zhì)量濃度為1.00～150.00 mg/L、2,3-丁二醇質(zhì)量濃度為1.25～50.00 mg/L、β-苯乙醇質(zhì)量濃度為0.25～10.00 mg/L的標準品溶液。

1.3.2 酒樣前處理

將100 μL分散劑、60 μL萃取劑置于1.5 mL離心管中混合均勻。用微量注射器將混合有機相快速注入1 100 μL置于1.5 mL離心管的模擬酒樣中。旋渦振蕩器振30 s，7 000 r/min離心4 min。將下層有機相吸出，進行氣相色譜分析。

1.3.3 Plackett-Burman 試驗

Plackett-Burman試驗設(shè)計在單因素試驗基礎(chǔ)上，以正丙醇的測定峰面積（Y）為響應(yīng)值，從萃取劑體積（X1）、分散劑體積（X2）、萃取時間（X3）、酒精度（X4）、NaCl質(zhì)量濃度（X5）、pH值（X6）中篩選出影響分散液液微萃取效率顯著的因素[20-21]。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)Plackett-Burman 試驗結(jié)果，選取萃取時間（A）、NaCl質(zhì)量濃度（B）、分散劑體積（C）3個因素設(shè)計響應(yīng)面試驗，對萃取條件進行優(yōu)化。

1.3.5 氣相色譜條件

色譜柱：SGEAC-20毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純度氮氣（N2），流速1.10 mL/min；分流比10∶1，進樣量1μL，尾吹氣30mL/min，氫氣40 mL/min，空氣400 mL/min，進樣口溫度230 ℃，檢測器溫度230 ℃，升溫程序為起始溫度40 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升溫至230 ℃，保持3 min，總分析時間43 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 分散液液微萃取條件優(yōu)化

2.1.1 酒樣酒精度的選擇

由于試驗中萃取劑的用量比較少，市售白酒酒樣的酒精度普遍較高，導致萃取溶劑在酒樣中有一定溶解，并且隨酒精度的增加溶解量也明顯增加，當酒精度＞50%vol時，萃取劑與酒樣完全互溶。考察酒精度分別為5%vol、10%vol、15%vol、20%vol對分散液液微萃取效果的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同酒精度對分散液液微萃取效率的影響Fig.1 Effect of different alcohol contents on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

由圖1可知，正丙醇的萃取效率在各個酒精度下沒有明顯變化；當酒精度在5%vol～15%vol時，異丁醇、異戊醇和β-苯乙醇萃取效率明顯增加；當酒精度在15%vol～20%vol時，β-苯乙醇萃取效率顯著降低，異丁醇和異戊醇的萃取效率也有所下降；2,3-丁二醇萃取效率遠小于其余的醇類；當酒精度增加至20%vol時，2,3-丁二醇萃取效率無明顯提高。因此，選擇酒樣的酒精度為15%vol。

2.1.2 酒樣pH值的選擇

考察pH值分別3.5、4.5、5.5、6.5、7.5對分散液液微萃取效率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同pH值對分散液液微萃取效率的影響Fig.2 Effect of different pH values on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

由圖2可知，當pH值為3.5時，正丙醇、2,3-丁二醇、β-苯乙醇的萃取效果較差，異丁醇和異戊醇有一定的富集效果；當pH值在3.5～5.5時，正丙醇、異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇的萃取效率有顯著增加；當pH值在5.5～7.5時，異丁醇、異戊醇萃取效率顯著減少，正丙醇和β-苯乙醇的萃取效率也有所下降，2,3-丁二醇無明顯變化。因此，選擇酒樣的pH值為5.5。

2.1.3 萃取劑的選擇

萃取溶劑在萃取過程中有非常重要的作用，直接影響著對目標物的萃取效率[5]。分別考察二氯甲烷、三氯乙烯、四氯乙烯、溴苯和三氯甲烷對分散液液微萃取效果的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同萃取劑對分散液液微萃取效率的影響Fig.3 Effect of different extractants on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

由圖3可知，四氯乙烯和溴苯對5種高級醇的萃取效果都比較差，二氯甲烷作為萃取劑對5種高級醇的萃取效率均最高。因此，選擇二氯甲烷為萃取溶劑。

2.1.4 萃取劑體積的選擇

考察二氯甲烷體積分別為40 μL、50 μL、60 μL、70 μL、80 μL、90 μL對分散液液微萃取效率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同萃取劑體積對分散液液微萃取效率的影響Fig.4 Effect of different extractant volumes on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

由圖4可知，當二氯甲烷體積為40～50 μL時，5種高級醇萃取率都很低；當二氯甲烷體積為60 μL時，正丙醇、異戊醇、β-苯乙醇萃取效率顯著增加，異丁醇和2,3-丁二醇的萃取率也有所增加；當二氯甲烷體積＞60 μL時，5種高級醇萃取效率都明顯變小。因此，選擇萃取劑體積為60 μL。

2.1.5 分散劑的選擇

合適的分散劑有助于目標化合物的萃取和濃縮?？疾旆稚┮译?、丙酮、乙酸乙酯、甲醇對分散液液微萃取效率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 不同分散劑對分散液液微萃取效率的影響Fig.5 Effect of different dispersants on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

由圖5可知，綜合5種醇的萃取情況，丙酮作為分散劑的萃取效率更好。因此，選擇丙酮作為分散劑。

2.1.6 分散劑體積的選擇

考察分散劑體積分別為40 μL、60 μL、80 μL、100 μL、120 μL對分散液液微萃取效率的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 不同分散劑體積對分散液液微萃取效率的影響Fig.6 Effect of different dispersant volumes on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

由圖6可知，當分散溶劑體積在40～100 μL時，正丙醇、異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇的萃取效率顯著增加；當分散劑體積＞100 μL時，異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇的萃取效率降低，正丙醇萃取效果無明顯變化，2,3-丁二醇萃取情況無明顯差異。因此，分散劑體積選擇100 μL。

2.1.7 NaCl質(zhì)量濃度的選擇

鹽的加入可以改變水溶液的離子強度和溶質(zhì)的溶解度，考察NaCl溶液質(zhì)量濃度分別為0、0.04 g/mL、0.07 g/mL、0.10 g/mL、0.13 g/mL、0.16 g/mL、0.19 g/mL對分散液液微萃取效率的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 不同NaCl質(zhì)量濃度對分散液液微萃取效率的影響Fig.7 Effect of different NaCl mass concentrations on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

由圖7可知，5種高級醇的萃取效率在質(zhì)量濃度為0.19 g/mL時最高。當質(zhì)量濃度為0.21 g/mL時離心管底部有NaCl固體不溶物，溶液達到飽和。因此，鹽濃度選擇0.19g/mL。

2.1.8 萃取時間的選擇

考察萃取時間分別為10 s、20 s、30 s、40 s、50 s對分散液液微萃取效率的影響，結(jié)果見圖8。

由圖8可知，異戊醇和β-苯乙醇在萃取時間為30 s時萃取效果最好；異丁醇在萃取時間為20 s時萃取效率最高，但與萃取時間為30 s時萃取效果沒有顯著差異；當萃取時間＞30 s時，正丙醇、2,3-丁二醇萃取效率沒有顯著變化。因此，萃取時間選擇30 s。

圖8 不同萃取時間對分散液液微萃取效率的影響Fig.8 Effects of different extraction time on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

2.2 Plackett-Burman試驗結(jié)果及分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以正丙醇的峰面積（Y）為響應(yīng)值進行Plackett-Burman試驗設(shè)計，每個因素設(shè)計了高（1）、低（-1）2個水平，對萃取劑體積（X1）、分散劑體積（X2）、萃取時間（X3）、酒精度（X4）、NaCl質(zhì)量濃度（X5）、pH值（X6）進行顯著性考察。隨機選擇正丙醇為例以闡明其過程和結(jié)果分析，結(jié)果見表1，Plackett-Burman試驗各因素主效應(yīng)分析見表2。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1 Design and results of Plackett-Burman experiments

由表2可知，萃取劑體積、萃取時間兩個因素影響顯著（P＜0.05），NaCl質(zhì)量濃度因素P=0.077 4，影響也較大，因此確定出對分散液液微萃取效果影響最顯著的因素為萃取劑體積、萃取時間和NaCl質(zhì)量濃度，選取這3個因素進行響應(yīng)面優(yōu)化。分散劑體積、酒精度和pH值選取單因素試驗最優(yōu)水平，即分散劑體積100 μL、酒精度15%vol、pH值5.5。

表2 Plackett-Burman試驗各因素效應(yīng)分析Table 2 Main effects analysis of each factors of Plackett-Burman experiments

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果及分析

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，選取萃取劑體積（A）、NaCl質(zhì)量濃度（B）和萃取時間（C）為自變量，正丙醇的測定峰面積（Y）為響應(yīng)值進行Box-Behnken試驗。利用Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計試驗，設(shè)計方案及結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。正丙醇基于響應(yīng)值與變量繪制的二次回歸模型如下[19-20]：

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments

使用相同的方法，根據(jù)響應(yīng)值與變量的關(guān)系，繪制其余四種高級醇的二次回歸模型如下：

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，模型的P值＜0.001，表明試驗誤差很小，模型具有較高的統(tǒng)計學意義，適用于數(shù)據(jù)分析；失擬項P值=0.530 4＞0.05，沒有統(tǒng)計學意義，表明試驗誤差對模型沒有顯著影響?；貧w方程總決定系數(shù)R2=0.9980，表明該模型對實驗擬合度較好，可用該模型對實驗結(jié)果進行預測。方差分析的結(jié)果也顯示了一次項A、B和C，交互項AB和BC以及二次項A2、B2和C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。回歸模型可以反映正丙醇的測定峰面積與萃取劑體積，NaCl質(zhì)量濃度和萃取時間之間的關(guān)系。

由Design Expert 8.0.6軟件繪制各因素交互作用的響應(yīng)面及等高線，結(jié)果見圖9。由圖9可知，萃取劑體積50～70 μL、NaCl質(zhì)量濃度0.18～0.20 g/mL范圍內(nèi)，萃取率先增大后減??；萃取劑體積50～70 μL、萃取時間20～40 min范圍內(nèi)，分散液液微萃取率先增大后減小；NaCl質(zhì)量濃度0.18～0.20 g/mL、萃取時間20～40 min時，分散液液微萃取率先增大后減小。通過對回歸模型的分析，可以確定分散液液微萃取的最佳條件為萃取劑二氯甲烷60 μL、NaCl質(zhì)量濃度0.19 g/mL、萃取時間30 s。在此最佳萃取條件下，正丙醇的測定峰面積為7.399×108。

圖9 各因素對分散液液萃取效率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.9 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

2.4 清香型白酒中高級醇檢測方法驗證

2.4.1 檢出限、定量限和標準曲線的考察結(jié)果

清香型白酒中5種高級醇線性范圍、標準曲線回歸方程方程、線性相關(guān)系數(shù)（R2）、檢測限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantitation，LOQ）。線性相關(guān)系數(shù)（R2）在線性范圍內(nèi)都＞0.99，線性關(guān)系良好。將信噪比＞3確定為檢出限，信噪比＞10確定為定量限；檢出限（LOD）范圍為0.01～0.03 mg/L，定量限（LOQ）范圍為0.05～0.10 mg/L。

表5 5種高級醇的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 5 Linear regression equations,linear ranges,coefficients,detection limit and quantitation limit of 5 higher alcohols

2.4.2 精密度及加標回收率試驗結(jié)果

以市售清香型白酒Y-1為加標樣品，用蒸餾水稀釋至酒精度為15%vol。依照上述確定的最佳萃取條件，用模擬酒分別制備10 mg/L、30 mg/L、60 mg/L的正丙醇、異丁醇、異戊醇、2,3-丁二醇、β-苯乙醇混合標準溶液，按照酒樣前處理方法處理，連續(xù)進樣3 d，每個濃度進樣5針，計算回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）（n=5），結(jié)果見表6。由表6可知，日內(nèi)、日間精密度結(jié)果的RSD分別＜7%、＜8%，表明該檢測方法精密度良好。加標回收率在83.1%～108.3%之間，表明該方法準確度高。

表6 方法的精密度及加標回收率試驗結(jié)果Table 6 Results of precision and standard recovery rate tests of method

續(xù)表

2.5 實際酒樣檢測結(jié)果分析

對從市場購買的6種不同品牌的清香型白酒（用蒸餾水稀釋至酒精度為15%vol中正丙醇、異丁醇、異戊醇、2,3-丁二醇和β-苯乙醇的含量進行檢測。6種白酒的正丙醇、異丁醇、異戊醇、2,3-丁二醇和β-苯乙醇的含量分別為0.064～0.116 g/L、0.057～0.127 g/L、0.262～0.450 g/L、0.017～0.035 g/L和0.008～0.012 g/L。

表7 6種清香型白酒中5種高級醇含量的檢測結(jié)果Table 7 Determination results of 5 higher alcohols contents in 6 light-flavor Baijiu samples

3 結(jié)論

本實驗建立了一種基于DLLME與GC聯(lián)用分析清香型白酒中主要高級醇的新型分析方法。結(jié)果表明，6種白酒中的正丙醇和異丁醇在質(zhì)量濃度為1.00～40.00 mg/L、異戊醇在質(zhì)量濃度為1.00～150.00 mg/L、2,3-丁二醇在質(zhì)量濃度為1.25～50.00 mg/L和β-苯乙醇在質(zhì)量濃度為0.25～10.00 mg/L的范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系（R2＞0.99）；檢出限為0.01～0.03 mg/L，定量限為0.05～0.10 mg/L。日內(nèi)、日間精密度結(jié)果的RSD分別＜7%、＜8%，表明該檢測方法精密度良好；加標回收率在83.1%～108.3%之間，表明該方法準確度高。

對6種白酒分析表明，所有酒樣中均含有5種高級醇，正丙醇含量范圍為0.064～0.116 g/L，異丁醇含量范圍為0.057～0.127 g/L，異戊醇含量范圍為0.262～0.450 g/L，2,3-丁二醇含量范圍為0.017～0.035 g/L、β-苯乙醇含量范圍為0.008～0.012 g/L。該方法具有快速、簡便、低成本和環(huán)保等優(yōu)點，能夠滿足實踐中生產(chǎn)工藝的控制和成品質(zhì)量檢驗等實驗的需要。