鐘彩 潘梅森 彭春富 胡常樂(lè)

摘? ?要：和傳統(tǒng)成像技術(shù)相比較，相位顯微成像應(yīng)用期間省略了染色環(huán)節(jié)，并且能實(shí)現(xiàn)無(wú)損傷性操作，成像結(jié)果可以數(shù)量化，近年來(lái)在生物細(xì)胞學(xué)科領(lǐng)域中有較廣泛應(yīng)用。很多學(xué)者陸續(xù)提出較先進(jìn)的定量相位成像技術(shù)和光波干涉原理存在一定相關(guān)性。文章首先闡述了相移干涉顯微成像基本原理及典型的相位恢復(fù)方法;其次提出新型微分相位提取法;最后對(duì)顯微鏡下細(xì)胞圖像進(jìn)行預(yù)處理，并以此方法作出模擬及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，目的是闡述相位梯度用于辨識(shí)細(xì)胞類(lèi)別及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的可行性。

關(guān)鍵詞：干涉顯微細(xì)胞;相位快速恢復(fù);成像技術(shù);圖像處理

顯微技術(shù)是研究細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)行為的主要手段，過(guò)往生命科學(xué)研究中長(zhǎng)期沿用傳統(tǒng)顯微鏡，適用性偏低的問(wèn)題逐漸暴露出來(lái)，成像技術(shù)及方法噬待作出創(chuàng)新。Zernike在20世紀(jì)40年代初期首次提出相位成像技術(shù)的概念，成功把樣品位相結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)型為光結(jié)構(gòu)改變，明顯提升了相位物體的可辨識(shí)度[1]。伴隨研究深度的拓展，更多人員認(rèn)識(shí)到定位測(cè)量相位分布情況的必要性。

1? ? 相移干涉顯微成像

1.1? 相移干涉原理

針對(duì)干涉顯微的運(yùn)行機(jī)制，可以從光波干涉和顯微拓展兩個(gè)方面予以分析。通過(guò)收集明暗相間的干涉圖像，在適宜算法的支撐下處理干涉圖像，獲取和被測(cè)物體相位信息相關(guān)的資料，實(shí)現(xiàn)相位目標(biāo)。當(dāng)下可供選擇的干涉相位相位技術(shù)并不唯一，其中，平面光波在兩相干涉光波中應(yīng)用較為廣泛。

相移干涉被定義為由差異性的相移量引入至物光臂或參考臂，為采獲相應(yīng)對(duì)相移干涉圖形創(chuàng)造便利，然后基于被采獲圖樣，有效分離其內(nèi)儲(chǔ)中待測(cè)物體的相位排布狀況。過(guò)往的相移干涉一般會(huì)把不同的常數(shù)相移按照一定次序引入至參考光，進(jìn)而獲得存在多種改變的干渉圖樣?？杉俣ㄔ谟涗浧矫嫔蠀⒖脊獾膹?fù)振幅是[2]：

（1）

在式（1）中，n代表晌數(shù)序列，δn代表第n幀的相移量，綜合分析后，可用式（2）表示經(jīng)物光波與參考光波相干涉后的強(qiáng)度：

（2）

式（2）是相移干涉的基本表達(dá)式。

1.2? 相移干涉下的典型相位恢復(fù)方法

（1）最小二乘法：是相移干涉內(nèi)重現(xiàn)相位信息的常用方法之一，能較為便利地測(cè)得干涉圖樣內(nèi)的一些未知參數(shù)，并確保求得的參數(shù)數(shù)值和真實(shí)值之間誤差平方和最小。

（2）代數(shù)運(yùn)算解析法：在相移干涉中，通常要求采獲的干涉圖樣數(shù)目不低于3個(gè)，才可以從根本上保證相位信息的重現(xiàn)效果。對(duì)以上操作決策進(jìn)行分析可知，主要由于在相移已知時(shí)，其干涉強(qiáng)度涉及了3個(gè)未知數(shù)，即：I0（x， y），γ（x， y）與φ（x， y），三步與四步相移干涉應(yīng)用范圍較廣。

（3）主分量分析方法：屬于數(shù)學(xué)學(xué)科領(lǐng)域中的一種降維統(tǒng)計(jì)方法，利用一個(gè)正交變換把一個(gè)已知有關(guān)變量轉(zhuǎn)型為不相關(guān)的變量。

2? ? 新型微分相位恢復(fù)方法

2.1? 基本理念

傳統(tǒng)微分相位恢復(fù)法能在離軸式干涉顯微內(nèi)快捷、高效地提取定量相位信息，得力于在定量成像系統(tǒng)內(nèi)調(diào)整條紋周期短于成像系統(tǒng)的衍射極限，可以不計(jì)入樣品臨近區(qū)中誘導(dǎo)的相位改變，即有<

針對(duì)以上情況，本文提出了一種新型相位恢復(fù)法，與某種條件之間持有較高的契合度，在整體、輕微離軸干涉領(lǐng)域中均表現(xiàn)出較高適用性，具體使用時(shí)只需要測(cè)算出干涉圖樣的干涉項(xiàng)、一階及二階偏導(dǎo)便能達(dá)到相位恢復(fù)。

2.2? 模擬微小球數(shù)值及驗(yàn)證方法

為強(qiáng)化計(jì)算的簡(jiǎn)潔性，設(shè)物光波與參考光波都是單位振幅的平面波。光源波長(zhǎng)設(shè)為632.8 nm，載波傾斜角是0.025 rad，該小球相位恢復(fù)的全過(guò)程如圖1所示，其中，圖1（a）是模擬的小球干涉，規(guī)格是512×512像素，觀察本土能發(fā)現(xiàn)一個(gè)圓形區(qū)，域該圓形輪廓相對(duì)應(yīng)的為小球沿軸向形成的投影。該區(qū)中干涉條紋存有較顯著的彎曲，囊括了小球振幅與相位信息[3]。圖1（b）是經(jīng)高通濾波處理后所分離出的干涉項(xiàng)。圖1（c）和圖1（b）依次是干涉圖的橫向一、二階偏導(dǎo)圖樣，依照主分量分析方法，能較快速獲得小球的相位分布，如圖1（e）所示。本文使用的小球是均質(zhì)體，相位和軸向厚度兩者存在線性關(guān)系，故而能直接由相位分布內(nèi)解耦厚度，如圖1（f）所示。歷經(jīng)系統(tǒng)測(cè)算后，模擬計(jì)算出的最大厚度值是4.007 1 μm，和理論值相比較偏差0.007 1。由此推測(cè)出以上方法應(yīng)用期間持有較高準(zhǔn)確度。

2.3? 相位梯度形態(tài)估算法

用數(shù)字圖像處理內(nèi)邊界檢測(cè)的思維去設(shè)定細(xì)胞的邊緣，進(jìn)而大致估算細(xì)胞的規(guī)格及形態(tài)。相位梯度對(duì)細(xì)胞邊緣及折射率改變表現(xiàn)出較高的敏感性，早已被相關(guān)學(xué)者所論證。對(duì)白細(xì)胞相位圖行橫向一階偏導(dǎo)運(yùn)算，獲得的結(jié)果如圖2所示。從宏觀層面上分析，圖2（a—b）呈現(xiàn)出的分別是一個(gè)同心球、偏心球模型，圖2（c）為一個(gè)外球內(nèi)含有兩個(gè)大小等同的偏心球模型[4]。能較好地呈現(xiàn)出細(xì)胞及細(xì)胞核的大小及空間方位，以上也和本研究所構(gòu)建的理論模型相匹配。故而，相位梯度能為解讀細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)與形態(tài)相關(guān)工作提供較合理的參考，但需闡述的是，不可以只是從單一方向的相位梯度就百分百確定細(xì)胞的形態(tài)等參數(shù)，主要是因?yàn)橄辔怀尸F(xiàn)的為生物細(xì)胞核周邊環(huán)境相對(duì)折射率差以及細(xì)胞厚度兩者乘積，而無(wú)法清晰呈現(xiàn)出各點(diǎn)對(duì)應(yīng)的具體情況。

3? ? 實(shí)驗(yàn)研究

3.1? 基于完全離軸干涉的均質(zhì)紅細(xì)胞

觀察基于衍射相位顯微采到的紅細(xì)胞干涉圖像可發(fā)現(xiàn)，背景橫直條紋密集化，條紋對(duì)應(yīng)的載波頻率也相對(duì)較大，如圖3（a）所示。橫直條紋處于水平向，因而可推測(cè)平面參考光于y向發(fā)生傾斜，此時(shí)采用新型微分法運(yùn)算時(shí)，需計(jì)算圖樣在y向上的一階和二階偏導(dǎo)。圖3呈現(xiàn)了紅細(xì)胞相位恢復(fù)的預(yù)算全過(guò)程。對(duì)比圖3（f）與圖3（g），發(fā)現(xiàn)兩者在分布上有一定相似之處，圖3（f）內(nèi)的噪聲較大，但該因素并不會(huì)影響整個(gè)輪廓，對(duì)其成因予以分析，主要由于采用的干涉圖絕非是試驗(yàn)期間獲得初始圖像。對(duì)該試驗(yàn)結(jié)果整體分析后，認(rèn)為該方法用于實(shí)踐中在準(zhǔn)確性、可執(zhí)行性方面占據(jù)優(yōu)勢(shì)[5]。

3.2? 基于微離軸干涉的皮膚癌細(xì)胞

微離軸干涉可以被看成是一種介于同軸干與離軸干涉之間的一類(lèi)干涉模式。通常情況下，在微離軸干涉中，需要采獲的相移干涉圖為兩幅，其目的是解除背景光強(qiáng)，隨即采用希爾伯特轉(zhuǎn)化兩個(gè)干涉圖樣的差，實(shí)現(xiàn)恢復(fù)整個(gè)相位。圖4是微離軸干涉成像系統(tǒng)采集到的一副干涉圖，采用本文所建設(shè)的新型相位恢復(fù)法提取圖4癌細(xì)胞持有的相位信息。以精確處理圖像的思想為支撐，消除背景光強(qiáng)干擾后，能較順利、精確的獲取到干涉項(xiàng)，而后測(cè)算干涉圖樣于y向的一、二階偏導(dǎo)，建所需的相位分布，如圖4（b）所示。圖4（c）是基于二步相移干涉下經(jīng)轉(zhuǎn)化而獲得的相位結(jié)果。比較圖4（b—c）兩個(gè)相位分布狀況，發(fā)現(xiàn)兩者之間并沒(méi)有顯著差異，結(jié)合Shaked在研究中論述的內(nèi)容，充分地證實(shí)該新型微積分用于細(xì)胞成像領(lǐng)域中的精確性、穩(wěn)靠性[6]。

4? ? 結(jié)語(yǔ)

Bhaduri提出的傳統(tǒng)微分相位恢復(fù)法在使用期間，僅會(huì)涉及微分運(yùn)算，具有運(yùn)算快速的優(yōu)勢(shì)，但對(duì)相位變化情況提出較嚴(yán)格的要求。為了提高顯微鏡下細(xì)胞圖像研究效果，基于傳統(tǒng)方法的相位余數(shù)，本文提出了一種新型微分相位恢復(fù)法，實(shí)驗(yàn)研究表明，該方法不僅在離軸干涉領(lǐng)域中表現(xiàn)出較高的適用性，還適合微離軸干涉，在生物細(xì)胞類(lèi)別辨識(shí)領(lǐng)域也有較大的推廣價(jià)值。經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，能得到更清晰的細(xì)胞圖像，有利于后續(xù)圖像的定位分割研究。

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Rapid phase recovery and image retention analysis of microcells

Zhong Cai， Pan Meisen， Peng Chunfu， Hu Changle

（Changde? Vocational? Technical? College， Changde 415000， China）

Abstract：Compared with the traditional imaging technology， the staining link is omitted during the application of phase microscopic imaging， and the damage-free operation can be realized， and the imaging results can be quantified， which has been widely used in the field of biological cell science in recent years. Many scholars have put forward more advanced quantitative phase imaging technology， many of which have some correlation with the principle of light wave interference. Firstly， the basic principle and typical phase recovery method of phase-shifting interference microscopy are introduced in this paper. Secondly， a new differential phase extraction method is proposed. Finally， it preprocesses the cell image under the microscope， and uses this method to make simulation and experimental verification. The feasibility of using phase gradients to identify cell types and internal structures is described.

Key words：intervention microcells; rapid phase recovery; imaging technology; image processing