羅勁松，閔運江，陳 玉，閆欠欠，吳唐娟

(1.安徽林業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，安徽 合肥 230031；2.皖西學院 生物與制藥工程學院，安徽 六安 237012)

據(jù)有關(guān)研究報道，到21世紀初我國受污染耕地面積達2000萬公頃，約占我國耕地面積的20%，每年因土壤污染而糧食減產(chǎn)超千萬噸[1-2]，給我國造成巨額經(jīng)濟損失。

土壤重金屬污染已成為當今全球共同面臨的嚴峻問題。而利用植物修復(fù)重金屬污染土壤，成為解決這一難題的重要技術(shù)手段之一。因植物修復(fù)重金屬污染土壤效果好、成本低、易于管理等[3-6]，已經(jīng)成為生態(tài)學研究熱點之一。

鹽膚木(RhuschinensisMill)也稱五倍子樹，是漆樹科鹽膚木屬分布極其廣泛的常見落葉灌木或小喬木[7](P299-300)，可作中藥及工業(yè)染料的原料等，其果實可榨油[8-10]。該植物喜光，對土壤和氣候的適應(yīng)性強，具有種植成本低、易于大規(guī)模種植、抗逆性強，為礦山等污染廢棄地的常見先鋒植物之一[11-13]。鹽膚木對重金屬的耐受性和富集能力研究，可為尋找重金屬污染土壤修復(fù)植物，尤其是超富集植物提供重要借鑒。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

植物材料粉碎機；馬弗爐(SRTS-6-13型)；原子吸收分光光度計(WFX-110型)；水浴鍋；超凈工作臺；電子秤；分析天平；通風櫥；塑料花盆；等。

1.2 材料和試劑

1.2.1 實驗材料

鹽膚木(RhuschinensisMill)種子：網(wǎng)上選購(由江蘇宿遷華豐種業(yè)公司提供)。

河沙培養(yǎng)基：取潔凈的河沙，過2 mm篩去除大粒石塊等雜質(zhì)，再用流水淘洗至河沙表面水流不再渾濁，再用去離子水洗2～3次，最后置于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌1 h，烘干后冷卻備用。

1.2.2 主要試劑

Pb(NO3)2，CdCl2，K2Cr2O7，KMnO4，氯化汞，高氯酸，硝酸，赤霉酸，復(fù)合肥，去離子水，等。

1.3 實驗方法

1.3.1 鹽膚木種子的預(yù)處理步驟[14]

取鹽膚木種子，用自來水浸種，除去漂浮的不飽滿的不健康種子，再用40 ℃左右的無菌水搓洗種子3次。

將洗好的種子置于5 g/L的 KMnO4溶液中浸1 h，自來水沖洗種子表面附著的高錳酸鉀。

加入500 mg/L的赤霉素于45 ℃恒溫水浴鍋中浸泡24 h后洗凈，常溫無菌水浸泡24 h。

在無菌操作臺上，將處理好的種子于已鋪有1 cm厚細沙(已滅菌)的帶孔塑料托盤中(所有的托盤均用KMnO4溶液擦拭1～2遍)，種子上面蓋上濕紗布，紗布上再鋪一層濕細沙。

保持細沙濕潤狀態(tài)并放在常溫下培養(yǎng)至發(fā)芽，胚根伸出種皮2～3 mm時可用于播種至各實驗組花盆內(nèi)的土壤中。

1.3.2 不同濃度梯度的重金屬污染土壤的配制

配制含重金屬污染土壤的方法：每盆裝5 kg滅菌的河沙，分別用Pb(NO3)2，CdCl2，K2Cr2O7等含重金屬鉛、鎘或鉻配制含重金屬土壤，以重金屬純含量計算的土壤含重金屬的量(mg/kg)。即準確稱取含3種重金屬的試劑，分別溶于2500 mL的水中，均勻拌入沙土內(nèi)，模擬重金屬污染土壤環(huán)境。

以不含重金屬的2500 mL水拌入沙土內(nèi)，作為對照組。

分組設(shè)置：每種重金屬1大組，每大組內(nèi)分5個梯度濃度和一個空白對照組，如表1，每個濃度梯度設(shè)三組平行。

表1 各組重金屬含量配置設(shè)置表/mg·kg-1

1.3.3 栽培實驗

標記花盆，每盆均勻植入20粒已萌發(fā)的鹽膚木種子于沙土表面，再覆蓋約1 cm厚的濕沙土，移至室外培養(yǎng)。常規(guī)管理，觀察各組種子萌發(fā)情況，并定期測量株高。

自播種之日起，第30天進行第一次株高的測量，以后每隔30天定期測量各實驗盆中鹽膚木苗的株高，計算每組每盆的平均株高。連續(xù)測定6次，得出各小組的平均株高增幅。

1.3.4 發(fā)芽率的測定

鹽膚木種子在含有重金屬的土壤中萌發(fā)需要一段適應(yīng)期，以萌發(fā)后幼苗出土作為基準，記錄發(fā)芽種子數(shù)。至各組發(fā)芽率不再變化為止，計算種子發(fā)芽率。

1.3.5 發(fā)芽完成時間的測定

每天觀察萌發(fā)出土后的鹽膚木幼苗數(shù)，每組以種子萌發(fā)出第一株幼苗開始計時，直至不再有新芽產(chǎn)生為止，記錄所需發(fā)芽時間長短(天數(shù))。

1.3.6 各組培養(yǎng)的鹽膚木根、莖和葉中重金屬含量的測定

1)材料收集與分類：待植株生長到秋季，將各組鹽膚木植株整株挖出，測量其最終株高，再洗凈，晾干。將每種重金屬的每個濃度組(三盆)按各自根、莖、葉不同器官分別處理樣品，各自烘干、稱量干重。分別粉碎，裝袋密封，置于干燥器中，備用。

2)樣品的預(yù)處理：精確稱取各組樣品粉末1.000 g，裝入已標記的潔凈瓷坩堝中，炭化至無煙，然后放入高溫灰化爐內(nèi)，550 ℃灼燒至灰白色。室溫冷卻，按國標方法[15-17]中的干法灰化方法處理灰分，過濾，除去不溶性物質(zhì)，定容至50 mL，即得各組植株的根、莖、葉樣品的重金屬含量測定液(樣液)。

3)火焰原子吸收條件的選擇：按照國標方法分別設(shè)置鉛、鎘和鉻的測定條件(見表2)

表2 鉛、鎘、鉻的火焰原子吸收工作條件

4)鉛標準曲線的繪制：按國標方法制備鉛的標準儲備液，并分別稀釋成梯度濃度為0.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mg/L，按上述鉛的測定條件，對各梯度濃度標準溶液進行火焰原子吸收吸光度測定，繪制鉛濃度(mg/L)對應(yīng)吸光度的標準曲線。

5)鎘和鉻標準曲線的繪制：按國標方法分別制備鎘和鉻的標準儲備液，并分別稀釋成梯度濃度為0.0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/L，按上述鎘和鉻的測定條件，測定各自的吸光度，分別繪制鎘和鉻的濃度(mg/L)—吸光度的標準曲線。

1.3.7 樣品中重金屬富集量(含量)和富集系數(shù)的測定

在上述各標準液測定的火焰原子吸收條件下，依次對各樣液進行吸光度測定，代入標準曲線的回歸方程，計算出各器官中重金屬的富集量(即鹽膚木各器官中重金屬占干重的量，mg/kg)和富集系數(shù)。

試樣中富集量和富集系數(shù)按下式進行計算：

各器官中金屬含量的計算結(jié)果取各濃度小組中三個平行樣同一器官中重金屬含量的平均值。

判斷是否為超富集植物的最重要標準是：富集系數(shù)≥1。即地上器官中重金屬含量高于地下根系中重金屬含量，為該重金屬的超富集植物[6，18-20]，反之則不是。

1.4 分析使用的相關(guān)軟件

采用SPSS及Microsoft Excel處理數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬脅迫對鹽膚木發(fā)芽率、發(fā)芽完成時間的影響

用上述方法中記錄的每種重金屬大組中各濃度組的鹽膚木的發(fā)芽率及發(fā)芽完成時間(天數(shù)d)，三個平行的簡單平均統(tǒng)計如表3。

由表3可知，各大組的對照組發(fā)芽率均達90%左右，而各重金屬處理組的情況分別是：Pb2+或Cd2+含量高于50 mg/kg及Cr6+含量高于5 mg/kg的土壤中，鹽膚木種子萌發(fā)率均低于對照組。但Cd2+含量低于25 mg/kg的各組萌發(fā)率與對照組差異不顯著。

同時，所有處理組發(fā)芽時間跨度均長于對照組；且各重金屬大組內(nèi)都是發(fā)芽時間隨土壤重金屬含量的漸次增高而相應(yīng)延長。

表3 不同濃度三種重金屬脅迫下鹽膚木的發(fā)芽率(G)及發(fā)芽完成時間(T)

注：1.同一金屬組內(nèi)各濃度間比較；G、T分別代表鹽膚木的發(fā)芽率和發(fā)芽完成時間(天數(shù))；2.各組C0- C5表示重金屬含量見表1。

由此可見，土壤中重金屬鉛、鎘和鉻對鹽膚木種子的萌發(fā)均有程度不等的抑制作用。

2.2 重金屬脅迫對鹽膚木苗期生長(株高增幅)的影響

表4 不同濃度三種重金屬脅迫下鹽膚木平均每株株高總增幅

注：1.同表3注釋2；2.同一重金屬組比較，字母不同的表示二者在5%水平下，差異顯著。

由表4可見，重金屬Pb2+、Cd2+和Cr6+對鹽膚木幼苗期生長(株高增幅)的影響效果不同，具體表現(xiàn)是：

1)鉛組：土壤中鉛在50～800 mg/kg內(nèi)，各處理組平均株高增幅都顯著小于對照組；但在50～400 mg/kg范圍內(nèi)，各組平均株高總增幅差異不顯著；不過，800 mg/kg時平均株高總增幅比400 mg/kg以下的各組顯著減小(p<0.05)。

說明土壤含50 mg/kg以上的重金屬鉛對鹽膚木生長抑制作用顯著，尤其是800 mg/kg以上的土壤重金屬鉛對鹽膚木幼苗期生長抑制效果更顯著。

2)鎘組：土壤中含Cd2+在5～100 mg/kg范圍內(nèi)，各處理組平均株高增幅都顯著小于對照組；但在5～50 mg/kg范圍內(nèi)，各組平均株高總增幅差異不顯著；不過，75～100 mg/kg時平均株高總增幅比50 mg/kg以下的各組顯著減小(p<0.05)。

說明土壤含5 mg/kg以上的重金屬鎘對鹽膚木生長抑制作用亦顯著，尤其是75 mg/kg以上的土壤重金屬鎘對鹽膚木幼苗期生長抑制效果更顯著(p<0.05)。

3)鉻組：土壤中含Cr6+在5～100 mg/kg范圍內(nèi)，各處理組平均株高增幅都顯著小于對照組；并且，各處理組株高平均增幅隨土壤Cr6+含量增高而降低，且差異顯著(p<0.05)。

2.3 不同濃度3種重金屬脅迫下鹽膚木各器官的重金屬富集量和富集系數(shù)

2.3.1 鉛、鎘和鉻3種重金屬標準液的標準曲線

按表2中火焰原子吸收測定各重金屬的條件，分別測定的各重金屬標準溶液，繪制標準曲線如圖1—圖3。

圖1 Pb2+的標準工作曲線

圖2 Cd2+的標準工作曲線

圖3 Cr6+的標準工作曲線

2.3.2 各組樣品中3種重金屬的富集量和富集系數(shù)測定結(jié)果

按上述每種重金屬標準溶液的火焰原子吸收測定的條件，分別測定的各重金屬組樣液的每一濃度組的測定值(三盆各自測定值的簡單平均值)，計算莖和葉的富集系數(shù)，如表5。

由表5可見，鹽膚木植株的根莖葉等不同器官對Pb2+、Cd2+和Cr6+的富集量和富集系數(shù)既相似，又有所不同，具體特征如下：

1)鉛組：土壤含重金屬Pb2+在50～800 mg/kg的范圍內(nèi)，各處理組的鹽膚木根莖葉等器官中重金屬鉛的含量(富集量)均高于對照組；且隨土壤重金屬鉛含量的增高而鹽膚木根莖葉三種器官中鉛的富集量也相應(yīng)地增高；而且，當土壤中鉛含量為800 mg/kg時，鹽膚木的根中Pb2+的富集量高達2378.93 mg/kg；且各Pb2+處理組的鹽膚木根中鉛含量均顯著高于對應(yīng)的土壤中鉛的濃度。然而，鹽膚木的莖和葉對鉛的富集系數(shù)均<1。

說明鹽膚木對土壤中重金屬鉛有較強的富力能力，但達不到超富集水平，也就是說，鹽膚木不是鉛的超富集植物[6]。

2)鎘組：土壤含重金屬Cd2+在5～100 mg/kg的范圍內(nèi)，各處理組的鹽膚木根莖葉等器官中重金屬鎘的富集量均高于對照組；且隨土壤重金屬鎘含量的增高而鹽膚木根莖葉三種器官中鎘的富集量也相應(yīng)地增高。但鹽膚木的莖和葉對鎘的富集系數(shù)也都<1。

說明鹽膚木對土壤中重金屬鎘也有一定的富力能力，但達不到超富集水平，也就是說，鹽膚木也不是鎘的超富集植物[6]。

3)鉻組：土壤含重金屬Cr6+在5～100 mg/kg的范圍內(nèi)，各處理組的鹽膚木根莖葉等器官中重金屬鉻的富集量均高于對照組；且隨土壤重金屬鉻含量的增高而鹽膚木根莖葉三種器官中鉻的富集量也相應(yīng)地增高；Cr6+含量為100 mg/kg時，鹽膚木的根中Cr6+的富集量可達110.62 mg/kg，而鹽膚木幼苗的莖中Cr6+的富集量達298.33 mg/kg，均顯著高于土壤中Cr6+的含量。同時，Cr6+的各濃度組中，鹽膚木的莖對鉻的富集系數(shù)都>1(為2.06～3.52)，但是其葉對鉻的富集系數(shù)在各濃度組均<1。

說明鹽膚木對土壤中重金屬鉻具有較強的富力能力，按鹽膚木地上器官莖對鉻的富集系數(shù)來看，達到超富集水平，也就是說，初步可以說鹽膚木是重金屬鉻的超富集植物[6]。

表5 不同濃度三種重金屬脅迫對鹽膚木根、莖、葉重金屬富集的影響

注：表中數(shù)據(jù)為實驗實際測定值，其中個別數(shù)值出現(xiàn)偏差，可能是實驗偶然誤差所致。

鹽膚木對Cr6+富集效果很強，富集系數(shù)達2.06～3.52，顯著大于1，顯示鹽膚木不僅可以超量吸收Cr6+，而且可以從地下向地上莖部有效輸送[13]。

3 討論

3.1 鹽膚木對3種重金屬耐性大小的問題

實驗進行的前期，在摸索濃度梯度設(shè)置的過程中，將3種重金屬的濃度都設(shè)在0～800 mg/kg范圍內(nèi)，Pb2+組鹽膚木發(fā)芽率明顯高于Cd2+和Cr6+兩組。在200 mg/kg以上時，Cd2+和Cr6+兩組發(fā)芽率不到10%，且出芽幼苗在生長不到5 d，就出現(xiàn)幼苗褪綠，葉脈組織呈醬紫色，莖部萎縮，根部變細發(fā)軟，根與莖之間部分還出現(xiàn)了黑色灼燒段等受害現(xiàn)象。說明鹽膚木對三種重金屬耐受性最大的是鉛。通過降低濃度梯度，使重金屬Cd2+和Cr6+的濃度梯度為0～100 mg/kg。鹽膚木對Cd2+的耐受性高于Cr6+。

綜上分析，鹽膚木對3種重金屬的耐受性大小為：鉛>鎘>鉻。在0～800 mg/kg范圍內(nèi)鹽膚木對金屬鉛雖有吸收，但達不到超富集水平。其可能原因是：濃度梯度設(shè)置較大，對鹽膚木根部造成損傷，其原因可能是Pb2+抑制了根細胞分裂，從而抑制了鹽膚木的生長，也抑制了地上器官對Pb2+的吸收[20]。

3.2 鹽膚木是否是重金屬超富集植物的問題

由以上研究結(jié)果可見，在實驗設(shè)置的Pb2+和Cd2+各濃度組，鹽膚木的地上器官莖和葉的富集系數(shù)都小于1，說明鹽膚木既不是鉛的超富集植物，也不是鎘的超富集植物。

而重金屬Cr6+的各處理組中，鹽膚木地上器官莖的富集系數(shù)都大于2。表明鹽膚木莖對這種重金屬鉻有超強的富集能力。陳晶等的研究報道，鹽膚木在低濃度重金屬鉻脅迫下其丙二醛、脯氨酸含量增加，SOD活性和CAT活性也隨之升高[13]，這一研究結(jié)論，可能解釋了鹽膚木對重金屬鉻等的耐受性較強的部分原因。

因此，鹽膚木植株對重金屬鉛、鎘尤其是鉻的富集能力，尤其對鹽膚木是否是鉻的超富集植物問題，值得進一步深入研究。