劉一朵 ， 于國(guó)際 ， 張 碩 ， 梁正敏 ， 孫星雅 ， 趙德明 ， 周向梅

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 北京 大興 102629)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全球新增約50萬(wàn)利福平耐藥結(jié)核病病例(其中78%為耐多藥結(jié)核病)[1]。牛結(jié)核病是一種由牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis,M.bovis)引起的人獸共患病，在很多發(fā)展中國(guó)家，其仍是人類健康的巨大威脅之一。而已有共識(shí)認(rèn)為卡介苗(Bacilli-calmette-guerin,BCG)對(duì)于兒童抗結(jié)核具有有效的保護(hù)作用，但隨著年齡的增長(zhǎng)保護(hù)效果逐漸減弱乃至消失[2]。因此，亟需開(kāi)發(fā)新型抗結(jié)核藥物或者有效的疫苗策略。

牛防御素5(Bovine neutrophils β-defensins 5,BNBD5)為一種牛源β-防御素類抗菌肽，已證實(shí)其在體外有直接抗分枝桿菌活性，本實(shí)驗(yàn)室前期已成功構(gòu)建表達(dá)重組蛋白BNBD5的畢赤酵母菌株[3]。聚乳酸-羥基乙酸(Poly lactic-co-glycolicacid,PLGA)作為一種由乳酸和乙醇酸共聚而成的無(wú)刺激、無(wú)毒的高分子聚合物，不僅生物相容性好，而且可在體內(nèi)降解，是一種綠色高分子材料[4]。

本試驗(yàn)將獲得的牛防御素5作為模型藥物，以PLGA為載體材料，制備牛防御素5-聚乳酸-羥基乙酸緩釋微球(BNBD5-PLGA)，進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)觀察其對(duì)BCG免疫小鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 已插入重組質(zhì)粒mBNBD5-pPIC9K的畢赤酵母菌株GS115、NTSE-2(牛分枝桿菌M.bovis)菌以及BCG，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家動(dòng)物海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室保存；7～8周齡的SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑與材料 PLGA(美國(guó)Sigma公司)；鼠抗6×His·tag單克隆抗體和羊抗鼠單克隆抗體(Solarbio公司)；ELISA試劑盒(Neobioscience公司)；二氯甲烷、乙酸乙酯、聚乙烯醇；抗酸染色試劑盒(Solarbio公司)；7H9、7H11 Middiebrook系列培養(yǎng)基和OADC增菌液(BD Biosciences公司)。

1.2 方法

1.2.1 重組蛋白牛防御素5(BNBD5)純化表達(dá)及鑒定 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已建立的方法，表達(dá)和純化重組蛋白BNBD5[3]。鑒定蛋白BNBD5，進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳，并進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，將凝膠轉(zhuǎn)到PVDF膜上，后于5%脫脂奶粉室溫下孵育1 h，洗滌，鼠抗6×His·tag單克隆抗體4 ℃搖床孵育過(guò)夜，羊抗鼠單克隆抗體37 ℃孵育1 h，洗滌后曝光采集圖像。

1.2.2 BNBD5-PLGA微球的制備 稱取0.163 g PLGA，溶于4.5 mL乙酸乙酯，振蕩混勻直至完全溶解，向其中加入0.5 mL蛋白溶液；將上一步制得的溶液在冰浴條件下超聲乳化制備初乳，超聲條件為40 W， 4 min，工作2 s，停止3 s；制備預(yù)復(fù)乳，將初乳倒入10 mL的1%PVA溶液中，冰浴條件下超聲乳化，超聲條件為40 W，6 min，工作2 s,停止3 s;將制得的預(yù)復(fù)乳倒入10 mL的0.5%PVA溶液中，制得復(fù)乳；室溫?cái)嚢? h，揮發(fā)油相；離心，蒸餾水洗滌2次， 4 ℃保存隔天即用或真空冷凍干燥機(jī)干燥得微球粉末。

1.2.3 小鼠免疫 將SPF級(jí)小鼠隨機(jī)分為5組，分別為正常對(duì)照組(8只)、BCG免疫組(8只)、BCG+BNBD5組(8只)、BCG+BNBD5-PLGA組(8只)和攻毒組(5只)。除正常對(duì)照組和攻毒組外，其余組對(duì)小鼠用1×106CFU的BCG進(jìn)行皮下接種。接種4周后，BCG+BNBD5組和BCG+BNBD5-PLGA組滴鼻BNBD5(300 μg/只)或BNBD5-PLGA(300 μg/只)，而正常對(duì)照組與攻毒組滴鼻100 μL PBS，連續(xù)3次，每次間隔2周，最后一次滴鼻后4周，每組剖殺3只小鼠(攻毒組除外)，取肺泡灌洗液和血清。

1.2.4 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子及抗體 剖殺小鼠，取肺泡灌洗液，取血分離血清，-80 ℃保存。按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中TNF-α、IL-1β、IL-10、抗體IgG水平和肺泡灌洗液IgA水平。

1.2.5 小鼠攻毒 最后一次滴鼻給藥后4周，除正常對(duì)照組外，其他組剩余小鼠滴鼻感染牛分枝桿菌M.bovis，攻毒劑量為1 000 CFU/只，攻毒后觀察小鼠狀態(tài)并記錄體重，3周后剖殺小鼠，取肺臟、肝臟、脾臟。

1.2.6 病理學(xué)觀察及載菌量檢測(cè) 小鼠剖殺后，取完整肺臟稱重，剪下右肺以進(jìn)行載菌量檢測(cè)，剪下小片左肺于福爾馬林溶液中保存固定，進(jìn)行石蠟切片制作以及蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色，并且按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行抗酸染色。載菌量檢測(cè)方法：將取下的小鼠右肺放于1 mL的PBS中研磨，研磨均勻后用PBS稀釋103倍，取50 μL于7H10培養(yǎng)基中涂布均勻，培養(yǎng)2～3周觀察菌落生長(zhǎng)情況并計(jì)數(shù)。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ± SEM)表示，在分析差異時(shí)，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異完全顯著(P<0.01)，***表示差異極顯著(P<0.001)，****表示差異極其顯著(P<0.000 1)。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白牛防御素5(BNBD5)的鑒定 將純化獲得的目的蛋白牛防御素5(含有His-tag標(biāo)簽)分別進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色和Western Blot檢測(cè)，其中Western Blot檢測(cè)使用的一抗為鼠抗6×His·tag單克隆抗體。結(jié)果顯示，純化透析后的重組蛋白BNBD5顯示與目的蛋白大小一致的蛋白條帶，純度較高(圖1A)；Western Blot檢測(cè)重組蛋白樣品有單一條帶(圖1B)。

2.2 BNBD5-PLGA微球制備 在掃描電鏡下觀察微球形貌并放入Zeta Potential檢測(cè)儀中，運(yùn)用Malvern Instrument軟件分析數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示：冷凍干燥得到的白色微球粉末松散，制備的微球大部分圓滑規(guī)整，尺寸均為均一，粘連性低，符合預(yù)期(圖2A)；納米粒度儀測(cè)得的微球Zeta電位為-41.9 mV，說(shuō)明制備的微球較為穩(wěn)定，平均粒徑約為207.9 nm，粒徑集中在247 nm左右，多分散系數(shù)(PDI)為0.225，表明制備的微球分散性良好、粒徑集中(圖2B)。

圖1 重組蛋白BNBD5的Tricine-SDS-PAGE分析及Western Blot分析

2.3 小鼠免疫后血清中細(xì)胞因子和抗體水平 通過(guò)ELISA方法檢測(cè)，分析末次滴鼻給藥后4周小鼠血清細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和抗體IgG水平以及肺泡灌洗液IgA水平。

細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)BCG+BNBD5-PLGA組小鼠血清中TNF-α水平顯著高于BCG免疫組和BCG+BNBD5組(P<0.001，圖3A)；(2)BCG+BNBD5組和BCG+BNBD5-PLGA組IL-1β水平顯著高于BCG組(P<0.05，P<0.01)，而B(niǎo)CG+BNBD5組較BCG+BNBD5-PLGA組又有明顯提高(P<0.05，圖3B)；(3)除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠血清中IL-10水平均有顯著性降低(P<0.001)，但BCG免疫組、BCG+BNBD5組和BCG+BNBD5-PLGA組間無(wú)明顯差異(圖3C)。

抗體檢測(cè)結(jié)果顯示：(1)BCG免疫組、BCG+BNBD5組和BCG+BNBD5-PLGA組抗體IgG水平高于正常對(duì)照組，BCG+BNBD5組和BCG+BNBD5-PLGA組略高于BCG免疫組(圖3D)；(2)與BCG免疫組對(duì)比，BCG+BNBD5組和BCG+BNBD5-PLGA組小鼠肺泡灌洗液IgA水平有顯著性提高，其中BCG+BNBD5-PLGA組又顯著高于BCG+BNBD5組(P<0.01，圖3E)。

結(jié)果顯示，牛防御素5及牛防御素5-PLGA納米微球可以增強(qiáng)小鼠先天性免疫，BCG+BNDB5組和BCG+BNDB5-PLGA微球組小鼠血清中非特異性細(xì)胞因子(TNF-α和IL-1β)水平和抗體IgA水平顯著提高。

2.4 攻毒后各組小鼠的體重變化和肺臟指數(shù) 末次接種微球后4周攻毒剩余小鼠，觀察小鼠狀態(tài)，記錄體重并在3周后剖殺小鼠，取臟器。

結(jié)果顯示：(1)與攻毒組相比，處理組體重減輕比率顯著低，而與BCG免疫組比較，BCG+BNBD5-PLGA組體重減輕比率更少(圖4A)；(2)雖然BCG+BNBD5-PLGA組和BCG+BNBD 5組肺臟指數(shù)略低于BCG免疫組，但組間無(wú)顯著差異(圖4B)。

2.5 肺臟載菌量及病理組織學(xué)觀察 H.E.染色觀察：攻毒組小鼠左肺形成嚴(yán)重的炎性灶和組織損傷，處理組小鼠左肺病變程度均有所減輕(見(jiàn)封三彩版圖5A)；抗酸染色觀察：攻毒組病變組織內(nèi)可發(fā)現(xiàn)大量紅染的分枝桿菌，與BCG免疫組相比，BCG+BNBD5組和BCG+BNBD5-PLGA組病變部位紅染的細(xì)菌有所減少，且分枝桿菌被局限在炎性灶內(nèi)，減少了細(xì)菌向周?chē)鷶U(kuò)散(見(jiàn)封三彩版圖5B)；載菌量結(jié)果顯示：BCG+BNBD5組和BCG+BNBD5-PLGA組與BCG免疫組相比左肺載菌量有所減少，但不顯著(見(jiàn)封三彩版圖5C)。

圖2 BNBD5-PLGA微球表征

圖3 小鼠接種PLGA微球后不同細(xì)胞因子和抗體水平

圖4 感染后小鼠體重變化及肺臟指數(shù)

3 討論

牛防御素5是一種牛源β-防御素，屬于陽(yáng)離子型抗菌肽。β-防御素一般含有6個(gè)半胱氨酸和3個(gè)二硫鍵，二硫鍵的存在使得防御素不易被酶水解，這也是其抑菌活性強(qiáng)于其他抗菌肽的原因之一[5]。牛源防御素類抗菌肽在體內(nèi)的分布廣泛，本試驗(yàn)所使用的BNBD5可分布于氣管、肺泡的中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞等[6]。

抗菌肽的非特異性多效作用機(jī)制和獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)作用優(yōu)于傳統(tǒng)抗生素，激發(fā)了醫(yī)藥市場(chǎng)的興趣。目前已有多種抗菌肽在結(jié)核防治方面的方法研究：Khara等[7]合成了α-螺旋肽，證實(shí)其與利福平聯(lián)用具有良好的抗結(jié)核分枝桿菌作用；Rekha等[8]發(fā)現(xiàn)苯基丁酸酯(PBA)可以誘導(dǎo)促炎型抗菌肽LL-37分泌，從而促進(jìn)殺傷胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌；Silva等[9]將抗菌肽LLKKK18包在納米凝膠中用于結(jié)核治療，效果良好。

但也有發(fā)現(xiàn)，外源性抗菌肽給藥有以下缺點(diǎn)：口服或全身給藥后快速降解甚至可能產(chǎn)生毒性、體液穩(wěn)定性低、在高濃度下可能存在不良副作用(腫瘤，血管增生等)、化學(xué)合成成本高等[10]。通過(guò)PLGA載體緩釋給藥，可以保護(hù)抗菌肽不被快速降解，并且由于PLGA納米顆粒良好的靶向性，抗菌肽可以向特定器官持續(xù)不斷的遞送,提高療效[11]。已有研究發(fā)現(xiàn)，PLGA與蛋白類抗原制備的顆粒疫苗可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的黏膜免疫[12]。

現(xiàn)在普遍認(rèn)為，機(jī)體抗結(jié)核感染時(shí)的特異性免疫應(yīng)答以細(xì)胞免疫為主，多種細(xì)胞因子參與，體液免疫為輔，但這不能全面反映體內(nèi)免疫應(yīng)答的復(fù)雜性。TNF-α是一種前炎癥細(xì)胞因子，可參與巨噬細(xì)胞活化、增強(qiáng)吞噬作用，參與肉芽腫形成，從而在感染中發(fā)揮作用[13]。已有研究表明，PLGA載體材料可引起小鼠體內(nèi)TNF-α表達(dá)水平上升[14]。IL-1β是單核巨噬細(xì)胞分泌的一種促炎細(xì)胞因子，可與抗原協(xié)同作用，刺激多種不同的間質(zhì)細(xì)胞釋放蛋白水解酶[13]。

IgG是機(jī)體特異性免疫分泌的主要抗體，IgA是機(jī)體黏膜免疫分泌的主要抗體。氣管黏膜組織是結(jié)核桿菌通過(guò)氣溶膠傳播入侵機(jī)體和定居的第一場(chǎng)所，因此黏膜免疫對(duì)于抗結(jié)核感染具有重要意義。

本試驗(yàn)所表達(dá)的重組蛋白BNBD5和制備的微球BNBD5-PLGA通過(guò)滴鼻給藥的方式在氣管黏膜上皮能發(fā)揮非特異性免疫誘導(dǎo)作用，促進(jìn)細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β以及抗體IgA的表達(dá)。納米載藥顆粒由于其更易被宿主抗原遞呈細(xì)胞(Antigen present cell，APC)攝取的特性能增強(qiáng)免疫應(yīng)答[15]，這也與本試驗(yàn)結(jié)果相符，微球BCG+BNBD5-PLGA組相比蛋白BCG+BNBD5組能更有效的誘導(dǎo)黏膜免疫，促進(jìn)分泌抗體IgA。