彭侃霖 ， 伍 鋼 ， 吳青青 ， 王安平 ， 肖 鵬 ， 鄭文亞,2,3

(1.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院 ， 江西 宜春 336000 ; 2.江西省高等學(xué)校硒農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心 ， 江西 宜春 336000 ; 3.江西綠科農(nóng)牧科技有限公司 ， 江西 宜春 336000)

隨著國內(nèi)畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，朝著規(guī)模化、集約化邁進(jìn)，大規(guī)模的畜禽運(yùn)輸已必不可少，但運(yùn)輸中應(yīng)激反應(yīng)會導(dǎo)致動物生產(chǎn)性能降低，如母畜流產(chǎn)，產(chǎn)奶量下降，動物源性食品的口感下降，如產(chǎn)生白肌肉(PSE肉)、黑干肉(DFD肉)，嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)甚至可導(dǎo)致動物死亡，這些都會給養(yǎng)殖場帶來巨大的損失，因此降低運(yùn)輸過程中的應(yīng)激反應(yīng)已刻不容緩。

在動物運(yùn)輸過程中饑渴、高溫、噪聲會促進(jìn)多種應(yīng)激激素的分泌，降低機(jī)體免疫力，影響腎臟的功能。腎臟是水鹽代謝的中心，具有保水、清除代謝產(chǎn)物、維持電解質(zhì)平衡以及內(nèi)分泌功能，保證機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。運(yùn)輸過程中，腎臟生化反應(yīng)異常進(jìn)行，大量活性氧自由基通過氧化應(yīng)激作用損傷腎臟[1]，影響機(jī)體的代謝水平。

熱休克蛋白是動物體在應(yīng)激原刺激下產(chǎn)生的一類在機(jī)體廣泛分布且高度保守的蛋白質(zhì)，它可折疊、組裝、調(diào)節(jié)和降解蛋白質(zhì)，在對抗環(huán)境壓力方面發(fā)揮著重要的作用[2]。目前關(guān)于熱休克蛋白家族的研究重點(diǎn)集中在熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSP)27、70和90(HSP27、HSP70和HSP90)中，本試驗(yàn)以小鼠為實(shí)驗(yàn)動物，模擬運(yùn)輸應(yīng)激對腎臟的損傷，探究HSP27、HSP70和HSP90三種熱休克蛋白在小鼠腎臟的分布、表達(dá)量，為降低畜禽運(yùn)輸應(yīng)激提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 運(yùn)輸應(yīng)激模型的建立及處理方法 32只8～9周齡 的ICR雄鼠(購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司)，分為對照組和運(yùn)輸應(yīng)激組，每組各16只， 處理前禁食限水，對照組于25 ℃下不處理，運(yùn)輸應(yīng)激組則在35 ℃搖床160 r/min處理2 h，模擬夏季畜禽運(yùn)輸應(yīng)激。應(yīng)激處理結(jié)束后，處死小鼠，取小鼠腎臟，一部分于4%多聚甲醛中固定，另一部分迅速浸入液氮速凍待用[3]。

1.2 主要試劑 蘇木精、伊紅染液，均購自北京夢怡美生物科技有限公司；小鼠SP免疫組織化學(xué)檢測試劑盒及濃縮型DAB，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；一抗HSP27(ab79868)、HSP70(ab5439)、HSP90(ab13492)和羊抗鼠酶標(biāo)二抗(ab6789)，均購自Abcam公司；Mouse Anti-β-actin內(nèi)參蛋白(BM0627)、彩色預(yù)染蛋白Marker(AR1113)，均購自博士德生物工程有限公司；4×Protein loading buffer(AI11800A)，購自TaKaRa Bio公司；HRP-ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(A149691)，購自GE Healthcare公司。

1.3 病理學(xué)觀察 對在4%多聚甲醛溶液中放置48 h以上的組織塊流水沖洗24 h以上，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后制備石蠟組織切片，37 ℃過夜后對切片進(jìn)行H.E.染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟的病理學(xué)變化，做好記錄并及時拍照。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測 切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精、微波抗原修復(fù)后，根據(jù)小鼠SP免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進(jìn)行操作，HSP27、HSP70、HSP90分別按照1∶800、1∶400和1∶800比例進(jìn)行稀釋，陰性對照用PBS代替一抗。DAB顯色，蘇木精染核，經(jīng)過分化、返藍(lán)、脫水、透明、封片后進(jìn)行觀察和拍照，有黃色或者棕色出現(xiàn)視為有陽性反應(yīng)。

1.5 Western Blot檢測 取腎臟經(jīng)過研磨、蛋白裂解和抽提后制備蛋白提取液，采用BCA法測定總蛋白濃度，將對照組和運(yùn)輸應(yīng)激組的總蛋白濃度調(diào)節(jié)一致。上樣前制備好分離膠和濃縮膠，同時按比例往蛋白提取液中加入4×Protein loading buffer制成上樣蛋白液，95 ℃變性蛋白10 min，每組加樣孔按照對照組、運(yùn)輸應(yīng)激組順序上樣，每次上樣2組，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳1.5 h，取凝膠孵PVDF膜濕轉(zhuǎn)1 h，取膜用TBST漂洗后封閉2 h，將膜剪成適當(dāng)大小后TBST漂洗3次，10 min/次，分別加入一抗[HSP27(1∶5 000稀釋)、HSP70(1∶1 000稀釋)和HSP90(1∶1 000稀釋)]和內(nèi)參蛋白(1∶500稀釋)，在4 ℃垂直混合儀下孵育16～18 h，TBST漂洗3次， 10 min/次，二抗(1∶5 000稀釋)孵育2 h，TBST漂洗3次，10 min/次。最后將PVDF膜按照HRP-ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒的說明書用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Amersham Imager 600)進(jìn)行成像、拍照。

1.6 圖像與數(shù)據(jù)分析 用Image J軟件對采集的圖片進(jìn)行分析，將目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值記為測試值。用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果記為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，P<0.05表示差異顯著，P>0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)輸應(yīng)激小鼠腎臟的顯微病理變化 與對照組(見中插彩版圖1A)相比，運(yùn)輸應(yīng)激組腎小管管腔狹窄，結(jié)構(gòu)破壞，小管與小管之間的界限不清，部分小管之間發(fā)生融合，管狀結(jié)構(gòu)消失，上皮細(xì)胞發(fā)生彌漫性顆粒樣變性，細(xì)胞排列疏松，間隔增大，胞核腫大，染色質(zhì)濃縮、碎裂，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)大量細(xì)小顆粒乃至空泡化，管腔內(nèi)可見粉紅色物質(zhì)(見中插彩版圖1B)。腎間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤，血管充血，少量紅細(xì)胞滲出至組織中(見中插彩版圖1C)。

2.2 運(yùn)輸應(yīng)激對腎臟3種HSPs表達(dá)的影響 如中插彩版圖2A、2B所示，HSP27蛋白在運(yùn)輸應(yīng)激組腎小球系膜細(xì)胞、腎小囊壁層上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎間質(zhì)細(xì)胞有陽性反應(yīng)，主要在胞質(zhì)表達(dá)，對照組腎小囊壁層上皮細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞無表達(dá)，其他部位表達(dá)情況與運(yùn)輸應(yīng)激組相似。如中插彩版圖2C、2D所示，HSP70蛋白在對照組和運(yùn)輸應(yīng)激組腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中均有表達(dá)，運(yùn)輸應(yīng)激組在集合小管和遠(yuǎn)曲小管的表達(dá)明顯要強(qiáng)于對照組，血管內(nèi)皮細(xì)胞也有表達(dá)。見中插彩版圖2E、2F所示，HSP90在運(yùn)輸應(yīng)激組小鼠腎小球和腎小管無表達(dá)，而對照組腎小管有表達(dá)。

2.3 小鼠腎臟中3種HSPs在運(yùn)輸應(yīng)激中表達(dá)量的變化 如圖3所示，運(yùn)輸應(yīng)激組和對照組HSP27蛋白表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)；運(yùn)輸應(yīng)激組HSP70蛋白表達(dá)量明顯高于對照組(P<0.05)；與對照組相比，運(yùn)輸應(yīng)激組HSP90蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.05)。

圖3 小鼠腎臟中3種HSPs的表達(dá)量變化

3 討論

在運(yùn)輸畜禽過程中，封閉的車廂內(nèi)擁擠、濕熱，動物容易脫水，抗利尿激素分泌增加，腎小管對水、鈉的吸收增強(qiáng)，尿鈉減少，體內(nèi)代謝產(chǎn)物排出存在障礙，可能引起如代謝性酸中毒和氮質(zhì)血癥等疾病。此外運(yùn)輸過程中的高溫、擁擠、噪聲以及生活環(huán)境改變會促進(jìn)腎上腺糖皮質(zhì)激素大量分泌，機(jī)體血糖濃度應(yīng)激性升高。有研究報道,在高糖條件下培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞株HK-2中，存在自噬障礙[4-5]。在高糖條件下，腎小管上皮細(xì)胞線粒體發(fā)生病變[6]，異常增多的ROS會導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡[7-8]，而由于應(yīng)激使得機(jī)體天然的抗氧化劑如抗氧化酶T-SOD、CAT和GSH-Px損耗嚴(yán)重，細(xì)胞對抗ROS能力下降[9]，導(dǎo)致腎小管結(jié)構(gòu)被破壞[10]。本試驗(yàn)表明，模擬夏季畜禽運(yùn)輸應(yīng)激會造成小鼠腎小管上皮細(xì)胞變性和壞死，間質(zhì)充血和出血，淋巴細(xì)胞浸潤，影響腎臟水鹽代謝功能。

誘導(dǎo)型熱休克蛋白70作為HSP70家族中的重要一員，被證實(shí)在腎小管和集合管的上皮有表達(dá)[11]。HSP70可抑制轉(zhuǎn)化生長因子β，促使Smad2/3蛋白磷酸化并阻斷其核移位，降低腎小管上皮間充質(zhì)細(xì)胞異常轉(zhuǎn)化率，使腎小管間質(zhì)纖維化受到抑制[12-13]。在腎小管進(jìn)行原尿重吸收時，其髓質(zhì)部受到高滲環(huán)境脅迫，HSP70的表達(dá)量增加，增強(qiáng)了髓質(zhì)細(xì)胞對高濃度細(xì)胞外鹽的適應(yīng)力，降低細(xì)胞在環(huán)境壓力下發(fā)生變性甚至破壞的可能性[14-15]。此外，HSP70存在損傷抑制作用[16]，一方面HSP70可上調(diào)MEK/ERK信號通路，激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶磷酸化反應(yīng)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[17]；另一方面HSP70可抑制應(yīng)激激酶磷酸化，減少炎性細(xì)胞因子的合成，降低細(xì)胞凋亡[18]。這些研究充分說明，在對抗環(huán)境應(yīng)激脅迫、抑制細(xì)胞凋亡和維持細(xì)胞正常功能方面，HSP70扮演了不可或缺的角色。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HSP70在運(yùn)輸應(yīng)激組小鼠腎臟的表達(dá)要顯著高于對照組，這表明高水平的HSP70與機(jī)體維持正常水鹽平衡有關(guān)。

HSP90在腎臟中主要分布在腎小管遠(yuǎn)端和集合管髓質(zhì)段，通過協(xié)作機(jī)制逐步募集靶蛋白(如HSP70)并形成多伴侶復(fù)合物，這些復(fù)合物在應(yīng)激條件下可調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并防止未折疊蛋白聚集[19-20]。HSP90還與一些病理反應(yīng)有關(guān)，通過CD14/TLR2和CD14/TLR4受體復(fù)合物介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在模擬運(yùn)輸過程中，與對照組相比，HSP90在小鼠腎臟的表達(dá)明顯下降，這可能與高強(qiáng)度運(yùn)輸應(yīng)激下HSP90的抑制作用有關(guān)。此外，在本試驗(yàn)中運(yùn)輸應(yīng)激組和對照組HSP27的表達(dá)未出現(xiàn)顯著差異，具體的機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究。

運(yùn)輸應(yīng)激對小鼠腎臟特別是腎小管造成了較明顯的病理損傷，這對維持水鹽平衡具有消極影響，而HSP70表達(dá)上升，HSP90表達(dá)減弱，在一定程度上緩解這種影響，保持動物機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，降低運(yùn)輸應(yīng)激對動物生產(chǎn)性能的影響。