殷 茵 ， 趙永剛 ， 韓先杰

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 山東 青島 266109 ； 2. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心 ， 山東 青島 266032)

2019年3月，濰坊市某養(yǎng)豬場(chǎng)的斷奶仔豬出現(xiàn)高燒、神經(jīng)癥狀、呼吸促迫等癥狀，持續(xù)半月余，斷奶仔豬死亡率達(dá)30%。根據(jù)流行病學(xué)特點(diǎn)以及臨床癥狀和病理變化，通過(guò)細(xì)菌和病毒兩方面進(jìn)行了病原檢測(cè)，最終確診為豬流感病毒和李氏桿菌混合感染導(dǎo)致發(fā)病和死亡。報(bào)告如下。

1 臨床背景及剖檢癥狀

豬場(chǎng)自繁自養(yǎng)，在斷奶仔豬轉(zhuǎn)入保育舍的階段，群體出現(xiàn)高燒、呼吸促迫，以及后肢癱瘓、四肢呈現(xiàn)劃水樣等神經(jīng)癥狀，外觀可見流鼻液、耳尖等末梢處發(fā)紺、壞死，觸診可見腹股溝淋巴結(jié)腫脹。發(fā)病率可達(dá)50%以上，持續(xù)半月有余，死亡率約為30%。使用替米考星、強(qiáng)力霉素以及磺胺類藥物等均未見效。豬場(chǎng)常規(guī)免疫偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病、豬瘟疫苗。

剖檢病死豬可見：下頜淋巴結(jié)嚴(yán)重充血腫大，腹股溝淋巴結(jié)充血腫大，喉頭及氣管內(nèi)有黏液，心包積液，肺臟沿支氣管分布有肉變現(xiàn)象，肝臟發(fā)黃有出血斑，脾臟腫大，腎臟無(wú)明顯異常，膀胱積尿，腦膜充血。

2 主要材料

TSA、TSB培養(yǎng)基，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；病毒核酸提取試劑盒、Taq酶，均購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司；一步法RT-PCR試劑盒，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；T5 DNA 聚合酶，購(gòu)自北京擎科生物技術(shù)有限公司。

3 方法

3.1 細(xì)菌分離鑒定 按照生物安全無(wú)菌采集病死豬的肝臟組織于TSA平板劃線，置于37 ℃培養(yǎng)24 h。 取單個(gè)菌落使用16S rDNA通用引物[1]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 428 bp，產(chǎn)物送至青島擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，在線BLAST比對(duì)分析。

3.2 可疑病原的PCR和RT-PCR檢測(cè) 無(wú)菌采集病死豬的肺、肝、淋巴結(jié)等組織，研磨后取上清提取核酸，參照國(guó)標(biāo)方法分別進(jìn)行流感病毒(GB/T 27521-2011)、豬瘟病毒(GB/T 16551-2008)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(GB/T 18090-2008)的RT-PCR檢測(cè)和豬圓環(huán)病病毒(GB/T 21674-2008)、豬偽狂犬病病毒(農(nóng)業(yè)部1485號(hào)公告-2-2010)、豬肺炎支原體(GB/T 35909-2018)的PCR檢測(cè)。

3.3 流感病毒的亞型鑒定及遺傳進(jìn)化分析 使用A型流感病毒通用的全長(zhǎng)擴(kuò)增引物對(duì)組織中病毒的8個(gè)基因片段分別擴(kuò)增，產(chǎn)物送至青島擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，NCBI網(wǎng)站在線BLAST比對(duì)分析。在GenBank中下載參考序列，使用MEGA 7.0軟件對(duì)病毒的HA基因作遺傳進(jìn)化分析，用Clustal W方法比對(duì)，用Neighbor-Joining方法基于遺傳距離構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，Bootstrap值為1 000。使用DNA-STAR軟件翻譯和分析關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。

4 結(jié)果

4.1 細(xì)菌分離鑒定 利用TSA平板從病死豬的肝臟中分離得到一種較小、光滑、圓形菌落，鏡檢為革蘭陽(yáng)性小桿菌，直或微彎，多數(shù)呈“V”字形排列。16S rDNA測(cè)序結(jié)果拼接比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，其同源性最高的序列為產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌(序列號(hào)為FJ557241)，可確定分離菌為李氏桿菌。

4.2 可疑病原的PCR及RT-PCR檢測(cè) 參照國(guó)標(biāo)進(jìn)行流感病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的RT-PCR擴(kuò)增和豬圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病病毒、豬肺炎支原體的PCR擴(kuò)增,結(jié)果見圖1，可知僅流感病毒擴(kuò)增出與目的片段大小相符的229 bp的特異性條帶，其他均無(wú)特異性擴(kuò)增條帶，說(shuō)明病死豬有流感病毒的感染，但無(wú)其他病原感染。

圖1 可疑病原的PCR及RT-PCR檢測(cè)

4.3 流感病毒的亞型鑒定及遺傳進(jìn)化分析 經(jīng)NCBI網(wǎng)站在線BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)病毒的HA基因和NA基因分別與A/chicken/Ganzhou/GZ21/2015(H5N6)和A/Pavo cristatus/Jiangxi/JA1/2016(H5N6)同源性最高(同源性分別為98.24%和98.99%)，確定分離毒株為H5N6亞型流感病毒。由進(jìn)化樹分析可知，該病毒的HA基因?qū)儆?.3.4.4分支中的Group C(圖2)。裂解位點(diǎn)的氨基酸為RERRRKRGLF，由多個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸組成，符合高致病性流感病毒的特征。第225～228位受體結(jié)合位點(diǎn)為GQRG，具有結(jié)合禽類受體的特征。

圖2 流感病毒HA基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

5 討論

豬是流感病毒重要的中間宿主，在我國(guó)很多豬群中存在不同程度的流感病毒感染[2]。通常豬流感單獨(dú)發(fā)病時(shí)死亡率并不高，但是由于病毒侵襲機(jī)體后會(huì)損傷病豬的呼吸道，導(dǎo)致豬群的抵抗力降低，容易與其他病原諸如豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、鏈球菌、李氏桿菌等混合感染，也會(huì)增加育肥豬的料肉比，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前在豬群中發(fā)現(xiàn)的流感病毒有H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、H4N6、H5N1、H9N2等亞型[3-5]，其中H3亞型是存在于我國(guó)豬群中的優(yōu)勢(shì)亞型[6-7]，H5亞型感染的豬流感并不多見[8]。

一般來(lái)說(shuō)豬流感致死率并不高，但該豬場(chǎng)的哺乳仔豬病死率卻達(dá)到了30%，經(jīng)檢測(cè)確定為流感病毒與李氏桿菌混合感染，仔豬除肺炎外還并發(fā)了腦膜炎，表現(xiàn)為高燒、流鼻液、呼吸促迫以及共濟(jì)失調(diào)、后肢癱瘓等神經(jīng)癥狀；另一方面，經(jīng)HA基因裂解位點(diǎn)的分析發(fā)現(xiàn)，感染的H5N6亞型流感病毒為高致病性流感病毒株。此外，病理變化也具有一定的鑒定意義，豬感染流感病毒后肺臟的剖檢病變表現(xiàn)為沿氣管和支氣管的肉樣變，可與支原體所致的肺臟對(duì)稱性肉樣變加以鑒別。

本病例從發(fā)病仔豬檢測(cè)到的H5N6亞型流感病毒的HA基因?qū)儆?.3.4.4分支中的Group C，與我國(guó)禽類當(dāng)前流行的流感病毒屬于同一分支。裂解位點(diǎn)的氨基酸符合高致病性流感病毒的特征，受體結(jié)合位點(diǎn)具有結(jié)合禽類受體的特征，推測(cè)可能是由禽類宿主傳播到豬場(chǎng)。豬流感的意義不僅僅體現(xiàn)在養(yǎng)豬業(yè)的疫病防控上，我國(guó)目前還存在著相當(dāng)一部分的散養(yǎng)戶，部分地區(qū)為便于管理劃定了養(yǎng)殖小區(qū)，豬和家禽往往被集中在同一片區(qū)域，如此雖然便于糞污處理和飼養(yǎng)管理，卻增加了豬和家禽共患傳染病—流感的傳播風(fēng)險(xiǎn)。此前在豬群中也曾發(fā)現(xiàn)過(guò)H1N1、H5N1、H9N2、H6N6等幾種禽流感病毒亞型[9-11]，說(shuō)明這種豬禽混養(yǎng)的養(yǎng)殖模式可能會(huì)導(dǎo)致禽流感病毒從家禽傳播到豬或人類。豬體內(nèi)同時(shí)存在有人型的SA α-2,6 Gal受體和禽型的SA α-2,3 Gal受體，具有同時(shí)感染禽流感病毒和人流感病毒的能力，很早就有人認(rèn)識(shí)到豬在流感病毒跨宿主傳播過(guò)程中的“混合器”作用[12]。H5N6亞型流感病毒目前已經(jīng)獲得感染人的能力，且已導(dǎo)致多例患者死亡[13]，所以針對(duì)此類病原操作必須在符合生物安全條件的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。密切關(guān)注該病毒在豬群中的傳播和進(jìn)化情況具有深遠(yuǎn)的公共衛(wèi)生意義。