徐 珺,董 恒,劉星云,宣秋希,侯曉林

(北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京100026)

巴爾吡爾( Ionized Alkali Mineral Complex，IAMC)是一種復(fù)合堿性負(fù)離子群，是巴爾麥?zhǔn)系暮诵某煞諿1,2]。巴爾麥?zhǔn)鲜且环N具有活化增效生理作用的復(fù)合堿性負(fù)離子群及微生態(tài)制劑，具有活化組織細(xì)胞、促進(jìn)生長、調(diào)節(jié)胃腸道、提高免疫性能的功效，臨床上常用作為生物飼料添加劑使用[3-5]。作者通過研究巴爾吡爾對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大腸桿菌(Escherichiacoli)的殺菌效果，探索巴爾吡爾體外殺菌作用，為該產(chǎn)品的推廣使用提供科學(xué)依據(jù)。巴爾麥?zhǔn)鲜遣捎妹绹鴮＠图?xì)胞代謝技術(shù)而生產(chǎn)的一種多功能堿性陽離子免疫增強(qiáng)劑，于2013年在中國獲得發(fā)明專利[6]。其核心物質(zhì)巴爾吡爾是一種國際上普遍應(yīng)用的飼料添加劑，其主要成分是活性礦物質(zhì)、強(qiáng)效電解質(zhì)、復(fù)合還原糖以及益生素等，可以維持動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境的弱堿性、增強(qiáng)動(dòng)物細(xì)胞代謝、促進(jìn)動(dòng)物消化吸收、增強(qiáng)免疫細(xì)胞的吞噬功能、提高機(jī)體非特異性免疫功能[7,8]。研究表明，巴爾吡爾對(duì)畜禽體外細(xì)菌具有良好的抑制作用，可以改善畜禽生長性能，提高畜禽的經(jīng)濟(jì)效益[1]；在飼料中添加巴爾吡爾可以提高奶牛的采食量和產(chǎn)奶量，有助于緩解奶牛熱應(yīng)激[9]；在仔豬飼料中添加巴爾麥?zhǔn)峡梢蕴岣弑Ｓ胸i的消化能力，改善免疫功能，提高仔豬育成率[10]。目前，大部分文獻(xiàn)主要研究巴爾吡爾作為飼料添加劑使用，在其抗菌方面的研究尚有空白，因此，巴爾吡爾的抗菌作用有待進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

巴爾吡爾溶液(批號(hào)為20180603)，由北京金娜爾生物技術(shù)有限公司提供。新潔爾滅消毒劑(批號(hào)為20180102)，由山東安捷高科消毒科技有限公司提供。滅菌生理鹽水(批號(hào)為20180211)，由石家莊四藥有限公司提供。

金黃色葡萄球菌ATCC 29213和大腸桿菌ATCC 25922由北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系實(shí)驗(yàn)室保存提供。

MH瓊脂培養(yǎng)基、MH肉湯培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)PCA培養(yǎng)基，均由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.2 方 法

復(fù)蘇凍存管中保存的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。用接種環(huán)蘸取適量菌液，采用三線畫法涂布在MH和LB瓊脂板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行過夜培養(yǎng)。從平板上挑選出一株形狀圓潤、邊緣規(guī)整的菌落，用潔凈的接種環(huán)進(jìn)行挑菌并分別接種到MH肉湯和LB 肉湯中，振蕩試管，使金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均勻地分散在培養(yǎng)基中[11]。將試管放置在37 ℃的搖床上培養(yǎng)16～18 h，4 ℃保存，作為試驗(yàn)菌種以待備用。

試驗(yàn)前對(duì)菌液進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。從試管中吸取1 mL菌液放到1.5 mL的EP管中3 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，保留菌體。向EP管中加入1 mL生理鹽水并用移液槍進(jìn)行混懸，使細(xì)菌均勻分布。采用倍比稀釋法，將菌液稀釋106倍，從稀釋過的菌液中吸取20 μL滴在瓊脂板上，每個(gè)瓊脂板滴4滴，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，8 h左右進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)[12]，公式：含菌數(shù)CFU/mL=兩滴菌液含菌量的平均數(shù)×5×稀釋倍數(shù)。

菌懸液濃度為(107～108) CFU/mL。實(shí)驗(yàn)前用無菌生理鹽水將菌液稀釋至該濃度，4 ℃保存，作為驗(yàn)菌液以備待用。

殺菌試驗(yàn)共使用3個(gè)濃度梯度的巴爾吡爾藥液。按照巴爾吡爾藥液說明書，用無菌生理鹽水按1∶2、1∶3和1∶4的比例進(jìn)行稀釋得到3倍、4倍和5倍稀釋液。空白對(duì)照使用生理鹽水，陰性對(duì)照選用新潔爾滅,按照說明書進(jìn)行稀釋使用。

向無菌試管內(nèi)分別加入0.5 mL菌懸液、0.5 mL不同濃度的巴爾吡爾溶液(空白對(duì)照為生理鹽水，陰性對(duì)照為新潔爾滅)，立即混勻。在藥物分別作用5 min和10 min時(shí)，取 0.1 mL樣液用生理鹽水稀釋106倍，吸取稀釋的菌液20 μL涂布MH瓊脂培養(yǎng)基和LB瓊脂培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20～24 h進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

巴爾吡爾對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的殺菌結(jié)果，見表1。由表1可知巴爾吡爾對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有殺滅作用，其中原液和稀釋3倍的巴爾吡爾的殺菌效果最好。由表2可知，不同濃度的巴爾吡爾作用不同時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌殺菌作用不同，巴爾吡爾對(duì)金黃色葡萄球菌均有殺菌作用，原液和稀釋3倍的巴爾吡爾液體對(duì)大腸桿菌有較好的殺菌作用，在藥物作用10 min時(shí)，無細(xì)菌生長，巴爾吡爾對(duì)金黃色葡萄球菌的殺滅效果達(dá)到99%。

表1 活菌計(jì)數(shù)法體外殺菌試驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of bactericidal test in vitro by viable organism counting method

試驗(yàn)藥物Drug菌株Strain金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus大腸桿菌Escherichia col原液stock solution--藥物稀釋3倍drug dilution 3 times--藥物稀釋4倍drug dilution 4 times-+藥物稀釋5倍drug dilution 5 times-+空白對(duì)照Blank control++陰性對(duì)照Negative control--

注：+號(hào)表示細(xì)菌生長，-號(hào)表示細(xì)菌不生長

不同稀釋倍數(shù)的巴爾吡爾對(duì)同一株菌的殺菌作用不同。由平板計(jì)數(shù)法測得隨著稀釋倍數(shù)增加，巴爾吡爾殺菌作用下降。其中原液的殺菌效果最好，殺菌率為100%，另外稀釋3倍的巴爾吡爾與原液殺菌作用相差不大，殺菌率高達(dá)99.9%。分析原因，巴爾吡爾稀釋倍數(shù)增加殺菌率降低可能因?yàn)橄♂尯笤旱膒H值下降、堿性離子濃度降低。同一稀釋倍數(shù)的巴爾吡爾作用不同時(shí)間對(duì)同一株菌的殺菌作用不同。巴爾吡爾對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有殺菌作用，但作用時(shí)間長比作用時(shí)間短的殺菌作用明顯，表現(xiàn)為作用10 min的殺菌率高達(dá)100%，作用5 min的殺菌率低至86%。分析原因，可能和巴爾吡爾釋放與細(xì)菌或病毒結(jié)合的電子的穩(wěn)定性有一定關(guān)系。

表2 不同濃度巴爾吡爾作用不同時(shí)間體外殺菌率Tab.2 In vitro bactericidal rate of different concentrations of balpil at different time

3 討 論

大量臨床試驗(yàn)表明，將巴爾麥?zhǔn)? 巴爾吡爾) 作為飼料添加劑使用，對(duì)畜禽具有很好的降低腹瀉率、減少死胎率、提高飼料的利用率、促進(jìn)生長、增加經(jīng)濟(jì)效益的作用，具備廣泛應(yīng)用的臨床價(jià)值[13,14]。有資料表明，巴爾吡爾是一種堿性復(fù)合物，可以與氫離子結(jié)合，從而使各種營養(yǎng)物質(zhì)溶解，同時(shí)也可以促進(jìn)底物與消化酶結(jié)合，促進(jìn)飼料吸收，增加營養(yǎng)的利用率；巴爾吡爾進(jìn)入體內(nèi)后通過釋放電子與細(xì)菌和病毒結(jié)合，改變其DNA、RNA的結(jié)構(gòu)，使機(jī)體免受細(xì)菌和病毒的侵襲，提高畜禽對(duì)病原菌的抵抗力。因此，巴爾吡爾常備用作消毒藥物[15]；另外，巴爾吡爾含有多種元素和益生菌，這些元素在堿性溶液環(huán)境中保持離子狀態(tài)和水溶性，從而維持動(dòng)物內(nèi)環(huán)境的弱堿性，堿性離子可以增加骨髓細(xì)胞的數(shù)量，增加細(xì)胞的吞噬功能，提高機(jī)體的非特異性免疫功能，而益生菌可以改變畜禽胃腸道內(nèi)的微生物菌群，減少致病菌數(shù)量，增強(qiáng)胃腸道消化、吸收功能，能夠作為抗生素有效替代的微生態(tài)制劑使用[14,16]。巴爾吡爾對(duì)常見病原菌是殺菌機(jī)制是：巴爾吡爾富含Si、Ag、Ti、Au、Zn、Fe等堿性離子，可以釋放大量電子與細(xì)菌結(jié)合，從而減弱細(xì)菌的活性，實(shí)現(xiàn)殺菌的效果。張哲[1]等采用杯碟法和二倍稀釋法研究巴爾吡爾對(duì)8種畜禽常見病原菌均有較好的抑制和殺滅作用，發(fā)現(xiàn)巴爾吡爾對(duì)馬腺疫鏈球菌和無乳鏈球菌抑菌效果最好，其最小抑菌濃度(MIC)為 1∶20，對(duì)對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、豬傷寒沙門氏菌、魏氏梭菌和停乳鏈球菌也有很好的抑制效果，其最小抑菌濃度均為1∶10。