勾啟螢，劉 寧，韓瑩琰，郝敬虹，劉超杰，范雙喜

(農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/植物生產(chǎn)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心/北京農(nóng)學(xué)院，北京102206)

葉綠素(Chl)是綠色植物葉綠體內(nèi)參與光合作用的重要色素，葉綠素含量是反映植物光合能力的一個(gè)重要指標(biāo)[2]。參與葉綠素合成與降解的物質(zhì)種類眾多，其中任意一個(gè)物質(zhì)表達(dá)量發(fā)生變化都有可能引起葉綠素最終合成含量的改變,終引起光合效率下降，產(chǎn)量減少[3]。葉綠素合成途徑(簡(jiǎn)略部分步驟)[4]：L-谷氨酰-tRNA→L-谷氨酰-1-半醛→5-ALA→PBG→羥甲基后膽色素原→尿卟啉III→糞卟啉原III→原卟啉IX→鎂原卟啉IX→葉綠素a→葉綠素b。

生菜，葉用萵苣的俗稱，菊科萵苣屬一年生或二年生草本作物，是現(xiàn)代人們經(jīng)常食用的葉菜之一[5]。有關(guān)不同銨硝比下對(duì)生菜葉綠素合成的影響的研究較少，就此通過(guò)研究不同銨硝比對(duì)生菜葉綠素合成前體與合成酶含量、葉綠素含量的影響，尋找適合生菜生長(zhǎng)的銨硝配比。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2018年4月至10月在北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院蔬菜生理生態(tài)實(shí)驗(yàn)室完成。以‘北散生1號(hào)’為試驗(yàn)品種，催芽后幼苗2～3片真葉后置于水培槽中加營(yíng)養(yǎng)液，定期測(cè)定觀察與測(cè)定營(yíng)養(yǎng)液情況，并添加水和營(yíng)養(yǎng)液至原濃度，4～5片真葉后添加不同銨硝比營(yíng)養(yǎng)液培育。每個(gè)處理16株，重復(fù)3次。在第8天取樣，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2 試驗(yàn)處理

1.3 測(cè)試方法

從生菜莖基部將地上部與地下部分開(kāi), 用吸水紙吸干植株水分, 電子天平分別稱量地上部和地下部鮮質(zhì)量, 將植株地上部和地下部分別置于105 ℃烘箱中殺青0.5 h，80 ℃烘干24 h至恒重[6]，計(jì)算全株含水量，根冠比等數(shù)據(jù)。

表1 水培營(yíng)養(yǎng)液各成分配比Tab.1 Distribution ratio of hydroponic nutrient solution

葉綠素含量的測(cè)定選用沈偉其的乙醇、丙酮、水混合液浸提法[7]。5-氨基酮戊酸(ALA)的含量,參考Richard的方法[8]；膽色素原(PBG)含量和尿卟啉原Ⅲ(Urogen Ⅲ)的含量,參考Bogorad的方法[9]；原卟啉IX( ProtoⅨ)和原葉綠素酸(Pchl)的含量,參考Hodgins的方法[10]。δ-氨基酮戊酸脫水酶 (ALAD)的活性，參考Mauzerall和Granick的方法[11]；尿卟啉原合成酶(UROS) 的活性,參考范軍和郭藹光的方法[12]；膽色素原脫氨酶(PBGD)的活性，參考Francesca Granata的方法[13]；原卟啉原氧化酶(PPO)的活性，參考薛金金等的方法[14]。

采用Excel 2014 軟件作圖，數(shù)據(jù)采用SPSS25.0軟件進(jìn)行新復(fù)極差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同銨硝比對(duì)生菜生長(zhǎng)的影響

由表2可看出，銨硝比為25∶75時(shí)地上部鮮質(zhì)量最大，銨硝比為75∶25最少，與其他處理間差異性顯著，其中銨硝比為75∶25較25∶75時(shí)的質(zhì)量少了13.4%，地下部鮮質(zhì)量與地上部鮮質(zhì)量的差異較相似，均為銨硝比為25∶75時(shí)質(zhì)量最大，差異為完全銨態(tài)氮配比與銨硝比為75∶25時(shí)的地下部鮮質(zhì)量間差異不顯著，與其他三個(gè)不同銨硝比處理間差異顯著，其中銨硝比為75∶25時(shí)生菜的質(zhì)量最小，較銨硝比為25∶75時(shí)少了62.9%；不同銨硝配比下的地下部干質(zhì)量為銨硝比為25∶75時(shí)最大， 75∶25與50∶50時(shí)最小，且與其余的處理差異顯著，銨硝比為75∶25時(shí)較25∶75時(shí)少了54.4%；地上部干質(zhì)量與全株干質(zhì)量均為銨硝比為25∶75時(shí)最大，銨硝比為50∶50時(shí)最小，且有顯著性差異；不同處理下全株鮮質(zhì)量，銨硝比為25∶75時(shí)最大，銨硝比為75∶25時(shí)最小，且有顯著性差異。相對(duì)含水量的差異與干鮮質(zhì)量的趨勢(shì)相反，銨硝比為25∶75時(shí)最少，50∶50時(shí)含水量最高，比銨硝比為25∶75時(shí)高了2.88個(gè)百分點(diǎn)，且差異顯著。不同銨硝比下根冠比的數(shù)值差異情況與干鮮質(zhì)量一致，其中銨硝比為25∶75時(shí)最大，銨硝比為75∶25最小，銨硝比為25∶75與75∶25處理間差異顯著，且所有處理間差異均顯著?？偟膩?lái)說(shuō)，銨硝比為25∶75時(shí)生菜的生長(zhǎng)狀況最佳，地上部與地下部的干鮮質(zhì)量均最大，且處理間有顯著性差異，其中，銨硝比為75∶25與銨硝比為50∶50時(shí)生菜的長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較差，較不適于生長(zhǎng)。

表2 不同銨硝比對(duì)生菜幼苗生長(zhǎng)的影響Tab.2 Effect of different nitrogen ratios on the growth of lettuce seedlings

2.2 不同銨硝比對(duì)生菜葉綠素含量的影響

從圖1可以看出，不同銨硝比下生菜的葉綠素a含量差異較大，其中全硝態(tài)氮處理時(shí)最多，全銨態(tài)氮處理時(shí)最少，完全硝態(tài)氮處理與完全銨態(tài)氮處理間有顯著性差異，全銨態(tài)氮處理較全硝態(tài)氮時(shí)少了54.76%，銨硝比為75∶25與50∶50處理間無(wú)顯著性差異。而葉綠素b不同銨硝配比下為銨硝比為75∶25時(shí)含量最高，銨硝比為25∶75時(shí)最少，且銨硝比為75∶25時(shí)與25∶75時(shí)有顯著性差異。葉綠素a/b的比值為全硝態(tài)氮處理下最高，且與其余處理間均有顯著性差異，全銨態(tài)氮處理最低，隨著硝態(tài)氮比例的增加比值變大(銨硝比為25∶75除外,較50∶50時(shí)少)，其中，全硝態(tài)氮比全銨態(tài)氮處理時(shí)高了一倍多。不同處理下生菜中的葉綠素總量為全硝態(tài)氮處理時(shí)最多，全銨態(tài)氮處理時(shí)最少；且兩個(gè)配比間有顯著性差異，與銨硝比為75∶25、50∶50間無(wú)顯著性差異?？偠灾~綠素總量與葉綠素a/b均為完全硝態(tài)氮處理最高，完全銨態(tài)氮處理最低，且2個(gè)處理間有顯著性差異。

圖1 不同銨硝比對(duì)生菜葉綠素a、b與總量的影響Fig.1 Effect of different nitrogen ratios on chlorophyll content of lettuce seedlings

2.3 不同銨硝比對(duì)葉綠素合成前體含量的影響

從圖2可以看出，銨硝比為25∶75時(shí)的5-ALA含量最多，完全硝態(tài)氮時(shí)的含量次之，銨硝比為75∶25時(shí)含量最少，較銨硝比為25∶75時(shí)少33.7% ，銨硝比為75∶25時(shí)與50∶50間無(wú)明顯差異。不同銨硝比配比下生菜的PBG含量的變化趨勢(shì)與5-ALA的相同，隨著硝銨比中硝態(tài)氮的增加PBG的含量隨之增加，銨硝比為25∶75時(shí)達(dá)到最高，完全硝態(tài)氮與完全銨態(tài)氮的處理間差異不顯著。除銨硝比為25∶75外，其他處理間的尿卟啉原III含量均無(wú)顯著性差異，隨著處理中NO3--N的增加尿卟啉原Ⅲ含量增加，至銨硝比為25∶75時(shí)含量最高，與其他處理間差異顯著。在不同處理下生菜中原卟啉IX(ProtoIX)的含量在完全硝態(tài)氮、完全銨態(tài)氮與銨硝比為75∶25時(shí)無(wú)顯著性差異，銨硝比為25∶75時(shí)含量最高，75∶25時(shí)含量最低。不同銨硝配比下原葉綠素酸含量在銨硝比為25∶75時(shí)最高，全銨態(tài)氮處理、50∶50與銨硝比為25∶75間無(wú)顯著性差異，銨硝比為75∶25時(shí)含量最少，與其他處理間差異顯著，其中，銨硝比為25∶75較75∶25時(shí)高了41.32%。由以上分析可知，在銨硝比為25∶75時(shí)，ALA、PBG、Urogen Ⅲ、ProtoⅨ、Pchl含量最高，銨硝比為75∶25時(shí)含量最少。

2.4 不同銨硝比對(duì)葉綠素合成前體關(guān)鍵酶活性的影響

從圖3可看出，不同銨硝比下ALAD的活性在銨硝比為25∶75時(shí)最高，50∶50時(shí)最低，銨硝比為50∶50較25∶75時(shí)少了43.10%，且銨硝比為25∶75時(shí)與其他處理間差異顯著，銨硝比為75∶25與50∶50處理間差異不顯著。PBGD活性在不同氮素形態(tài)下的活性差別與ALAD的趨勢(shì)相似，其中兩種酶活性趨勢(shì)的區(qū)別之處為銨硝比為75∶25與全硝態(tài)氮時(shí)的活性多少，銨硝比為75∶25與50∶50間無(wú)顯著性差異。UROS在不同處理下銨硝比為25∶75活性最大，全銨態(tài)氮處理、75∶25時(shí)較少。而PPO不同處理下的差別與其他三個(gè)酶活性均不同，不同銨硝比下全銨態(tài)氮處理的活性最大，與其他處理間差異顯著，從銨硝比為75∶25起隨著硝態(tài)氮比例的增加酶活性變大，其中銨硝比為75∶25最小，全銨態(tài)氮處理較75∶25時(shí)多了43.12%。總之，ALAD、PBGD、UROS、PPO均在銨硝比為25∶75時(shí)最高。

圖2 不同銨硝比對(duì)生菜葉綠素合成前體含量的影響Fig.2 Effect ofdifferent nitrogen ratios on chlorophyll synthesis precursor content of lettuce seedlings

圖3 不同銨硝比對(duì)生菜葉綠素合成前體關(guān)鍵酶活性的影響Fig.3 Effect ofdifferent nitrogen ratios on key enzymes activity in chlorophyll synthesis precursors of lettuce seedlings

3 討 論

不同氮素處理下的地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、地下部干質(zhì)量和全株鮮質(zhì)量均為銨硝比為25∶75時(shí)大，銨硝比為75∶25最??；地上部干質(zhì)量和全株干質(zhì)量均為銨硝比為25∶75時(shí)最大，50∶50最小，據(jù)全株干鮮質(zhì)量數(shù)據(jù)分析，干質(zhì)量比鮮質(zhì)量數(shù)據(jù)更具分析性。說(shuō)明在銨硝比為25∶75時(shí)的干物質(zhì)與鮮物質(zhì)積累最大，而銨硝比為75∶25時(shí)的鮮物質(zhì)積累較少，干物質(zhì)積累為銨硝比為50∶50時(shí)最少。相對(duì)含水量的數(shù)據(jù)趨勢(shì)與鮮質(zhì)量趨勢(shì)相反，銨硝比為25∶75時(shí)最少，銨硝比為75∶25最大，由此說(shuō)明，銨硝比為25∶75時(shí)物質(zhì)積累量高但含水量小，在生產(chǎn)要求生菜產(chǎn)量高時(shí)，銨硝比為25∶75處理較符合要求。不同處理下的根冠比的數(shù)據(jù)說(shuō)明銨硝比為25∶75的根系較發(fā)達(dá)，根際環(huán)境較適宜生菜旺盛生長(zhǎng)，綜合干鮮質(zhì)量可知在銨硝比為25∶75時(shí)生菜的生長(zhǎng)情況最好，而銨硝比為75∶25時(shí)最差。在王興萌等的研究中討論了毛竹實(shí)生苗在不同銨硝比情況下的生長(zhǎng)狀況，其結(jié)果為毛竹在銨硝比為25∶75時(shí)的地下部長(zhǎng)度與表面積等均為最優(yōu)，與本文結(jié)論相似[15]；在唐銘霞等的研究中表面全硝態(tài)氮處理時(shí)的干物質(zhì)積累與馬鈴薯塊莖的膨大最有利，與本文結(jié)論較有不同[16]。

在某些脅迫條件下，植物內(nèi)部會(huì)通過(guò)進(jìn)行自身生理調(diào)節(jié)來(lái)對(duì)抗不良條件，導(dǎo)致部分物質(zhì)含量的改變，通過(guò)研究這些物質(zhì)的變化以表明植物對(duì)于脅迫條件的反應(yīng)與環(huán)境的不良程度[17]，葉綠素含量是衡量每個(gè)植物光合作用與內(nèi)部生長(zhǎng)情況的方法[18]，而葉綠素a/b的比值能直接反映植物的光合情況[19]，也能反映葉綠素a向葉綠素b合成情況[20]。本研究中全硝態(tài)氮與銨硝比為75∶25時(shí)葉綠素總量多，葉綠素a/b為全硝態(tài)氮時(shí)最高，全銨態(tài)氮處理、75∶25、25∶75均較少，全硝態(tài)氮時(shí)的葉綠素a含量最高而葉綠素b較低，說(shuō)明在全硝態(tài)氮情況下生菜由葉綠素a向葉綠素b合成的過(guò)程受到抑制，而其他處理無(wú)明顯抑制作用；通過(guò)葉綠素總量可知銨硝比為75∶25和全硝態(tài)氮時(shí)光合作用情況最好，銨硝比為25∶75較差，綜合生長(zhǎng)指標(biāo)總的說(shuō)全硝態(tài)氮較適宜生菜生長(zhǎng)，而銨硝比為75∶25處理下葉綠素合成情況較好但生長(zhǎng)情況不佳，較不適宜生長(zhǎng)。而在梁娟等的研究結(jié)果為全硝態(tài)氮時(shí)與銨硝比為25∶75時(shí)葉綠素情況最好，與本研究結(jié)果略有不同[21]。

ALA的合成是葉綠素生物合成途徑的限速步驟，葉綠素合成途徑大致是從L-谷氨酰-tRNA經(jīng)過(guò)特定反應(yīng)生成中間物質(zhì)5-ALA，然后依次生成PBG、羥甲基后膽色素原、尿葉琳III、糞葉琳原III、原卟啉IX、鎂原卟啉IX，合成葉綠素a再由葉綠素a生成葉綠素b。其中，若任何一步的合成受到某些因素的影響，受阻部位之前的積累量就會(huì)升高，而之后的中間合成體的含量會(huì)降低[22]。ALA 是葉綠素和四吡咯環(huán)形成的直接前體，也是一個(gè)關(guān)鍵的中產(chǎn)物[21]。5-ALA的含量在銨硝比為25∶75時(shí)含量最高，在銨硝比為75∶25時(shí)含量最少，說(shuō)明在不同銨硝比下，葉綠素合成開(kāi)始時(shí)的限速物質(zhì)的含量已有較大差異，銨硝比為75∶25時(shí)處于不利狀態(tài)，重要限速物質(zhì)含量合成較少，會(huì)在一定程度上影響最終葉綠素的含量。

ALA合成之后就要開(kāi)始葉綠素分子卟啉骨架的構(gòu)建。ALA依次轉(zhuǎn)變?yōu)镻BG、羥甲基膽色原,而后異構(gòu)化形成環(huán)狀UrogenⅢ，卟啉環(huán)側(cè)鏈再進(jìn)一步脫羧生成CoprogenⅢ[23]。ALA經(jīng)過(guò)δ-氨基酮戊酸脫水酶(ALAD)催化合成為PBG，其中銨硝比為25∶75的ALAD活性最高，酶活性高有利于后續(xù)物質(zhì)的合成。PBG是卟啉環(huán)構(gòu)建的開(kāi)始，不同銨硝比下生菜PBG含量說(shuō)明在銨硝比為25∶75處理下合成最多，銨硝比為75∶25合成效果最不好，含量變化趨勢(shì)與5-ALA的相同,說(shuō)明了PBG的合成含量會(huì)受5-ALA含量與ALAD酶活性的影響,且不同氮素處理對(duì)5-ALA向PBG的合成過(guò)程影響差異不大。UrogenⅢ是四吡咯環(huán)形成的第一個(gè)卟啉中產(chǎn)物[22]。在UrogenⅢ的含量測(cè)定中，銨硝比為25∶75含量最多，而其余四組處理的含量無(wú)明顯差異，與ALA、PBG變化趨勢(shì)差異較大，由PBG向UrogenⅢ合成的過(guò)程中需要PBGD酶的作用，PBGD酶在銨硝比為25∶75時(shí)活性最高、銨硝比為50∶50最少，其他處理間差異不大，說(shuō)明不同氮素對(duì)PBG合成到UrogenⅢ的過(guò)程影響不同，與PBGD酶活性有關(guān)，而酶活性低時(shí)會(huì)影響后續(xù)前體物質(zhì)的合成[24]；處理銨硝比為75∶25、銨硝比為50∶50 UrogenⅢ的合成含量較多，而其他處理合成與銨硝比為75∶25、銨硝比為50∶50對(duì)比相對(duì)受阻全銨態(tài)氮處理與全硝態(tài)氮處理合成較銨硝比為25∶75相比也較為有利；合成過(guò)程需要UROS酶作用，而酶活性為銨硝比為25∶75最高，銨硝比為50∶50、全硝態(tài)氮處理次之，說(shuō)明在UrogenⅢ向ProtoⅨ合成的過(guò)程中UROS酶活性起較重要的作用。

不同處理下，銨硝比為25∶75時(shí)的ProtoⅨ含量最多，但與全銨態(tài)氮處理、全硝態(tài)氮處理間差異均不顯著，而銨硝比為75∶25、銨硝比為50∶50時(shí)的含量相對(duì)較少，與銨硝比為25∶75有顯著性差異，說(shuō)明從UrogenⅢ開(kāi)始到ProtoⅨ合成完成的過(guò)程中銨硝比為75∶25、銨硝比為50∶50時(shí)的合成較之前受阻，而全銨態(tài)氮處理與全硝態(tài)氮時(shí)不受太大影響。而ProtoⅨ作為葉綠素生物合成中較后的中間物質(zhì)，其含量對(duì)最終葉綠素的含量影響很大。由ProtoⅨ合成到原葉綠素酸酯的過(guò)程中需要合成許多中間產(chǎn)物，也需要很多關(guān)鍵酶，其中PPO就為其中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，而PPO酶活性為全銨態(tài)氮處理最大，而其趨勢(shì)與原葉綠素酸含量的有部分一致，說(shuō)明在合成過(guò)程中PPO起較重要的作用。

從以上分析可知，在銨硝比為25∶75時(shí)，物質(zhì)積累量高但含水量小，在生產(chǎn)要求生菜產(chǎn)量高時(shí)較符合要求；銨硝比為25∶75時(shí)的根系較發(fā)達(dá)，根際環(huán)境較適宜生菜旺盛生長(zhǎng)，生菜生長(zhǎng)情況最好，而銨硝比為75∶25時(shí)最差；而葉綠素總量與分量為全硝態(tài)氮處理下最適宜生長(zhǎng)，銨硝比為75∶25處理下葉綠素合成情況較好但生長(zhǎng)情況不佳，較不適宜生長(zhǎng)；銨硝比為75∶25葉綠素合成前體與關(guān)鍵酶含量最高，銨硝比為75∶25時(shí)含量最少?？偟膩?lái)說(shuō)，當(dāng)銨硝比為25∶75和全硝態(tài)氮時(shí)適宜生菜生長(zhǎng)，其中，銨硝比為25∶75最適宜，銨硝比為75∶25最不適宜生菜生長(zhǎng)。