王超眾， 劉信奎， 張連成， 王萌萌， 董 巍

（1.齊齊哈爾市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，黑龍江 齊齊哈爾161005；2.齊齊哈爾市第一醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾161005；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

動物源性食品的質(zhì)量安全問題一直困擾著人們，這其中獸藥殘留現(xiàn)象比較普遍，后果也較為嚴(yán)重[1，2]。 因此，如何提高檢驗(yàn)效率、降低檢測成本，控制和消除藥殘，保證食品安全，是重大民生課題[3-4]。

獸藥殘留檢測存在諸多困難，如殘留量甚微、獸藥品種繁多、動物源性食品基質(zhì)復(fù)雜等，提取凈化方法復(fù)雜，檢驗(yàn)成本高，耗時耗力等。而且傳統(tǒng)的檢測方法只針對某一類獸藥進(jìn)行檢測，存在篩查范圍小、檢測效率低等缺點(diǎn)，無法滿足大批量檢測樣品的目的。因此，建立簡便、快速、高通量、高靈敏度的方法已成為未來獸藥殘留檢測的趨勢。目前同時檢測動物源性食品中多種類獸殘的國家標(biāo)準(zhǔn)還比較少，主要采用的方法是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-6]。檢索文獻(xiàn)有用免疫分析法[7-9]、液相色譜法[10-11]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12-13]、超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜法[14-17]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[18-24]等。免疫分析法一般只作為初篩或輔助檢測手段，出現(xiàn)陽性結(jié)果還要進(jìn)一步質(zhì)譜確認(rèn)；液相色譜法應(yīng)用廣泛，但專屬性及檢測限不高，限制了該方法在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用；氣質(zhì)法靈敏度就高專屬性強(qiáng)，但是檢測獸藥品種范圍有限，不適合作為多類獸藥殘留的檢測；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，且在定性方面具有較強(qiáng)優(yōu)勢，是如今使用最廣泛的獸藥殘留檢測方法。作者應(yīng)用ProElut PLS-A技術(shù)對樣品基質(zhì)進(jìn)行凈化處理，并且建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS）法對65種獸藥殘留進(jìn)行快速檢測分析。這些獸藥涵蓋了磺胺類抗生素、β-受體興奮劑類、喹諾酮類抗生素、四環(huán)素類抗生素、糖皮質(zhì)激素類、雄性激素類、β-內(nèi)酰胺類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、氨基糖苷類抗生素、抗病毒類、鎮(zhèn)靜劑類、驅(qū)蟲劑類、硝基咪唑類、三苯甲烷類、二羥基苯甲酸內(nèi)酯類、雌激素類、氯霉素類、氯代烴類等18類65種獸藥化合物，為動物源性食品中獸藥殘留篩查提供了一個簡單且快速的檢測方法，提高了檢測效率。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1290 infinity II型超高效液相色譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品；TSQ.QuantumAccess型三重四級桿質(zhì)譜儀：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；XS205DU型電子天平：美國梅特勒公司產(chǎn)品；BSA2202S-CW型電子天平：德國賽多利斯公司產(chǎn)品；Tube Mill型研磨機(jī)（配MT40型一次性40mL研磨杯）、MS 3型渦漩混合器：德國IKA公司產(chǎn)品；KQ-1000型超聲儀：昆山超聲儀器廠產(chǎn)品；Rotina 380R型控溫離心機(jī)：美國Hettich公司產(chǎn)品；N-EVAP 112型氮吹儀：美國Organomation公司產(chǎn)品；ProElut PLS-A型固相萃取小柱：天津迪馬公司產(chǎn)品；Endeavorsil C18，100 mm×2.1mm，1.8μm超高效色譜柱：天津DIKMA公司產(chǎn)品。

65種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品 （純度均大于93.0%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；乙腈、甲醇（色譜純），德國Merck公司產(chǎn)品；甲酸（優(yōu)級純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品；水為超純水；其它試劑為分析純。

1.2 樣品前處理

取畜、禽或水產(chǎn)品的可食部分置研磨機(jī)上研磨攪碎，精密稱取攪碎的樣品2 g，置50 mL離心管中，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸乙腈，置漩渦混合器上震蕩5 min，超聲5 min，6 000 r/min離心5 min，取上清液待凈化。小柱不需活化，直接置固相萃取裝置上，精密量取離心上清液5 mL加入小柱中，接收流出液，將接收的流出液在40℃條件下氮吹至近干，精密加入1 mL體積分?jǐn)?shù)90%乙腈溶液（含有體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸）1 mL復(fù)溶，微孔濾膜過濾，供儀器分析。

1.3 樣品檢測

1.3.1 色譜條件 進(jìn)樣量 5 μL，柱溫 30℃，流量0.2 mL/min。正離子模式采用流動相（單位均為體積分?jǐn)?shù)）A：0.1%甲酸乙腈溶液，流動相B：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～2 min，10%A；2～8 min，10%A→60%A；8～10 min，60%A→90%A；10～13 min，90%A；13～14 min，90%A→10%A；14～20 min，10%A。負(fù)離子模式采用流動相A：乙腈，流動相 B：10 mmol/L 乙酸銨溶液，梯度洗脫：0～2 min，40%A；2～8 min，40%A→70%A；8～10 min，70%A→90%A；10～13 min，90%A；13～14 min，90%A→40%A；14～20 min，40%A。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電離模式為ESI，正負(fù)離子分別掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式，電噴霧電壓為±4 000 V，離子源溫度370℃。目標(biāo)化合物具體的母離子、定量離子、定性離子、碰撞電壓等參數(shù)詳見表1。

表1 65種獸藥殘留多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MRM parameters for the detection of 65 veterinary drugs

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

2 結(jié)果與分析

2.1 65種獸藥殘留的選擇

中國目前動物源性食品中獸藥殘留最大限量的標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)主要有農(nóng)業(yè)部第193號、第235號、第560號和第2292號公告，以及全國食品安全整頓工作辦公室函（整頓辦函[2010]50號）等，標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定了允許使用獸藥品種的最高限量以及禁止使用的獸藥品種。并且每年國家食品藥品監(jiān)督管理總局都會出臺《食品安全監(jiān)督抽檢和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測實(shí)施細(xì)則》（以下簡稱《細(xì)則》），在該《細(xì)則》2015 年版之前還未對獸藥殘留進(jìn)行控制，之后的2016年版、2017年版和2018年版均已將動物源性食品中的獸藥殘留的檢驗(yàn)列為了重點(diǎn)監(jiān)控對象，且將風(fēng)險(xiǎn)等級定為了“高”，可見近幾年國家對獸藥殘留的問題已經(jīng)越來越重視。

作者選擇的65種獸藥品種都是農(nóng)業(yè)部第193號、第235號、第560號和第2292號公告以及整頓辦函[2010]50號等標(biāo)準(zhǔn)中收錄的品種，且以上標(biāo)準(zhǔn)對這65種獸藥殘留限量有著明確規(guī)定。本試驗(yàn)所選擇的這65種獸藥同時也涵蓋了 《細(xì)則》2016年版、2017年版和2018中規(guī)定的除4種硝基呋喃代謝物之外的所有獸藥，并且將原本檢驗(yàn)需要的51個質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)綜合成為1個標(biāo)準(zhǔn)，大大節(jié)省了人力和物力和時間，為食藥檢系統(tǒng)更好的做好動物源性食品獸藥殘留的檢驗(yàn)提供了有力的技術(shù)支持。

2.2 樣品提取條件的選擇

試驗(yàn)采用不同提取溶劑對目標(biāo)化合物進(jìn)行提取，包括體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸乙腈、0.1%甲酸甲醇、1%甲酸乙腈3種提取溶劑。結(jié)果表明，體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸乙腈與0.1%甲酸甲醇相比，蛋白質(zhì)沉淀效果更好，提取溶液更澄清，更有利于下一步的凈化操作；選擇體積分?jǐn)?shù)1%甲酸乙腈作為提取溶解時，會使得部分堿性目標(biāo)化合物提取效率不好，回收率不高；而選擇體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸乙腈作為提取溶劑時，可以滿足大多數(shù)目標(biāo)化合物的提取效率，回收率較好，且提取溶劑中乙腈及甲酸揮發(fā)性均較強(qiáng)，可減少下一步氮?dú)獯蹈刹襟E的時間。試驗(yàn)還曾采用β-葡糖醛酸苷肽酶對樣品進(jìn)行酶解后提取，此步驟可切斷藥物與基質(zhì)中氨基的鍵合，更好的將目標(biāo)化合物與基質(zhì)蛋白進(jìn)行分離，但是酶解過程一般需要超過12 h才能完成，使得分析時間大大延長。試驗(yàn)中加入的微量乙酸亦有使藥物與基質(zhì)蛋白分離的作用，為了滿足對大批量樣品高通量的分析，故選擇了體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸乙腈作為提取溶劑。

2.3 樣品凈化條件的選擇

凈化處理是獸藥殘留檢測前處理中至關(guān)重要的步驟，因?yàn)閯游镌葱允称坊|(zhì)復(fù)雜，若凈化不完全會造成儀器基線噪音高、干擾目標(biāo)化合物檢測等后果，而且也會加速液質(zhì)聯(lián)用儀離子源的污染，進(jìn)一步影響到儀器靈敏度。本試驗(yàn)應(yīng)用到的ProElut PLS-A型固相萃取小柱，使用前無需活化，采用固相萃取模式中的保留干擾物模式，采用新型吸附材料PLS-A，基體為高交聯(lián)的均勻球形聚苯乙烯-二乙烯苯，表面含有極性基團(tuán)及非極性基團(tuán)，具有通用性，對非極性、弱極性、強(qiáng)極性化合物具有均衡的保留能力，克服了傳統(tǒng)C18、C8等反相吸附材料對極性化合物保留差的缺點(diǎn)。同時材料具有保水性，由于極性基團(tuán)的存在，即使柱床干涸，材料的保留性質(zhì)也不會發(fā)生變化。另外，由于材料基體為聚合物的特點(diǎn)，可在pH 0～14范圍內(nèi)均表現(xiàn)穩(wěn)定，而傳統(tǒng)的硅膠鍵合吸附劑pH范圍為2～8。此材料還有吸附容量大的特點(diǎn)，傳統(tǒng)的硅膠鍵合材料其基體為多孔硅膠，比表面積為180～450 m2/g范圍，新材料的聚合物基體比表面積可達(dá)到1 000 m2/g，這樣可提供更多的吸附位點(diǎn)，提高凈化效率，適合短時間內(nèi)完成大批量的分析測試。

2.4 流動相的選擇

試驗(yàn)比較了乙腈-水，體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液，乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液，甲醇-10 mmol/L乙酸銨溶液等流動相系統(tǒng)，事實(shí)證明流動相對目標(biāo)化合物的色譜分離及質(zhì)譜靈敏度均有很大的影響。在正離子模式下，在流動相中加入體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸，可以促進(jìn)正離子的離子化，提高靈敏度；在負(fù)離子模式下，采用乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液系統(tǒng)，可以促進(jìn)目標(biāo)化合物分子失去質(zhì)子帶一分子負(fù)電荷，靈敏度更高，同時，溶液中有緩沖鹽存在時，可以改善化合物的保留時間及色譜峰型，因此最終確立了正離子體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液以及負(fù)離子甲醇-10 mmol/L乙酸銨溶液的流動相系統(tǒng)。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限 取不含目標(biāo)化合物的動物源性食品樣品，按照“1.2”項(xiàng)下方法制備空白基質(zhì)溶液，用空白基質(zhì)溶液將標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋成質(zhì)量濃度為 2.0、10.0、20.0、100.0、250.0、500.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，按照“1.3”項(xiàng)下的方法檢測。以質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果65種獸藥的線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99。并將標(biāo)準(zhǔn)曲線工作進(jìn)一步稀釋，以（S/N）=3 為檢出限，（S/N）=10 為定量限，方法檢出限為 0.1～1.6 μg/kg，定量限為 0.3～5.3 μg/kg，具體數(shù)據(jù)見表3。

2.5.2 回收率和精密度 向不含待測物的空白豬肉、牛肉、雞肉、水產(chǎn)品和奶、蛋樣品中進(jìn)行添加回收率實(shí)驗(yàn)，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2、5、10 μg/kg的3個水平標(biāo)準(zhǔn)溶液。65種獸藥殘留物回收率范圍為67.1%～100.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為0.1%～7.8%，具體數(shù)據(jù)見表2。由數(shù)據(jù)可知，采用本方法檢測動物源性食品中的65種獸藥殘留，具有較好的準(zhǔn)確度與精密度。

表2 65種藥物檢測限、定量限、相關(guān)系數(shù)、回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 LOD，LOQ，correlation coefficients，recoveries and precisions of 65 veterinary drugs

續(xù)表2

續(xù)表2

2.5.3 實(shí)際樣品檢測 按照上述方法檢測轄區(qū)內(nèi)抽取的牛肉50份，豬肉50份，雞肉30份，水產(chǎn)品100份，牛奶30份，雞蛋30份，結(jié)果有2批牛肉檢出氯霉素陽性10.2 μg/kg，1批豬肉檢出氯丙嗪陽性5.3 μg/kg，1 批鯽魚檢出恩諾沙星陽性 252.3 μg/kg，1批多寶魚檢出地西泮陽性20.0 μg/kg，均超過標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定最大限度值。

3 結(jié) 語

應(yīng)用ProElut PLS-A技術(shù)對樣品基質(zhì)進(jìn)行凈化處理，并且建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS）法對65種獸藥殘留進(jìn)行快速檢測分析。多獸藥殘留品種一步同時提取，提取液直接通過固相萃取柱的凈化方式，減少傳統(tǒng)方法中對提取液濃縮復(fù)溶等復(fù)雜的操作，避免樣品不必要的損失。同時，前處理操作簡單，一步凈化的方法克服了傳統(tǒng)方法中SPE需要進(jìn)行活化平衡等繁瑣的步驟，節(jié)約時間、節(jié)省溶劑，減少人員操作成本，且無需特殊實(shí)驗(yàn)裝置，檢測獸藥種類較多。

作者建立了UHPLC-MS/MS分析方法，該方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確，在樣品基質(zhì)復(fù)雜，目標(biāo)化合物理化性質(zhì)差異較大的條件下實(shí)現(xiàn)了同時測定，為大批量動物源性食品中獸藥多殘留檢測提供簡便可靠的方法。