張秋香， 應(yīng)聰萍， 劉思思， 陳 衛(wèi)， 張 灝

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

乳酸菌是一類公認安全的、對于工業(yè)尤其是食品工業(yè)以及人體健康具有重大意義的益生菌[1]。常見的乳酸菌有雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬、明串珠菌屬、片球菌屬和嗜熱鏈球菌屬等[2]。研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌具有促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、減緩乳糖不耐癥、吸附重金屬、降低血清膽固醇和血脂濃度、預(yù)防高血壓、糖尿病、調(diào)節(jié)免疫功能以及平衡腸道菌群等生理作用[3-6]。乳酸菌在體內(nèi)的定殖是其發(fā)揮生理作用的重要前提[7]。而功能性低聚糖可以選擇性地促進乳酸菌在體內(nèi)增殖，因此，對功能性低聚糖的利用被認為是益生菌的一項重要的新特性[8]。

常見的功能性低聚糖有大豆低聚糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、棉子糖、低聚異麥芽糖等[9-10]。不同品種的功能性低聚糖對乳酸菌的增殖效果存在差異。Tseteslava等人[11]研究了低聚果糖、葡糖低聚糖和低聚半乳糖對于酸奶中分離出的18株保加利亞乳桿菌的增殖作用，發(fā)現(xiàn)這些菌株對3種低聚糖的利用能力各不相同且具有菌株特異性；王苗等人[12]探究了動物乳桿菌、糞腸球菌、植物乳桿菌和羅伊氏乳桿菌4株乳酸菌對魔芋低聚糖的降解利用情況，發(fā)現(xiàn)不同乳酸菌對低聚糖的利用規(guī)律和代謝產(chǎn)物分布等方面均存在差異。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)低聚果糖（FOS）和低聚木糖（XOL）對雙歧桿菌和乳桿菌的增殖有積極的影響[13-14]。但大部分研究集中在乳酸菌單個種或單株菌的水平，涉及菌株較少，覆蓋面不夠廣，對于乳酸菌利用低聚糖的特性在種屬水平上較為宏觀系統(tǒng)的研究比較少見。

作者選取35株不同種屬的乳酸菌，通過體外實驗測定它們對低聚果糖和低聚木糖的偏好性，以及分別以這兩種低聚糖為唯一碳源生長時的代時和產(chǎn)酸速率。

1 材料與方法

1.1 試劑及培養(yǎng)基

低聚果糖（95%）：購自日本明治公司；低聚木糖（95%）：購自山東龍力生物公司；牛肉膏、胰蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、吐溫-80、三水磷酸氫二鉀、無水乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、七水硫酸鎂、一水硫酸錳、瓊脂條、L-半胱氨酸鹽酸鹽、溴甲酚紫、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸：購自國藥集團化學(xué)試劑公司。

MRS 培養(yǎng)基[15]（1 L）：牛肉膏 10 g；胰蛋白胨10 g；酵母粉5 g；葡萄糖20 g；無水乙酸鈉5 g；MgSO4·7H2O 0.1 g；MnSO4·H2O 0.05 g； 檸檬酸氫二銨 2 g；K2HPO4·3H2O 2.6 g；吐溫-80 1 mL；調(diào)節(jié) pH為6.8±0.2。121℃滅菌15 min（若培養(yǎng)雙歧桿菌則另加入L-半胱氨酸鹽酸鹽1 g）。

MRS-低聚糖培養(yǎng)基：以低聚糖代替MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖，添加量為0.5 g/dL，并滴加1.5 g/dL溴甲酚紫溶液作為指示劑。

1.2 實驗菌株

實驗用乳酸菌菌株共35株，詳細信息見表1。

表1 實驗菌株信息Table 1 Information of experimental strains

1.3 乳酸菌利用低聚糖的偏好性檢測

參考Tseteslava等人[11]的方法進行。取1 mL過夜培養(yǎng)的菌液，5 000 r/min離心5 min，以滅菌的生理鹽水洗滌兩次后用生理鹽水重懸。吸取2 μL菌懸液，點在相應(yīng)的MRS-低聚糖固體培養(yǎng)基上，置于厭氧工作站倒置培養(yǎng)12 h。若菌落周圍變黃色，則表明該菌株可以利用相應(yīng)的低聚糖。以MRS-葡萄糖和MRS-無糖固體培養(yǎng)基分別作為陽性和陰性對照。

1.4 乳酸菌利用低聚糖的代時測定

代時指細胞每分裂一次所需的時間[16]。代時越短，表明生長速度越快。配制MRS-低聚糖液體培養(yǎng)基，將能利用FOS/XOS的菌株劃線活化后，挑取單菌落接種至5 mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，以體積分數(shù)0.2%的接種量接入至5 mL液體培養(yǎng)基，置于厭氧工作站37℃培養(yǎng)。以接種時間為0 h，每隔2 h取出試管，測定A600nm值，同時設(shè)置兩個平行。選取處于各菌株對數(shù)生長期的數(shù)據(jù)點，計算代時G。對數(shù)期代時公式如下所示：

式（1）中：G為代時；A1、A2為t1、t2時刻測定菌懸液的吸光值。

1.5 乳酸菌利用低聚糖的產(chǎn)酸速率測定

吸取3 mL測定代時剩余的菌液，以酚酞為指示劑，參照GB/T 12456-2008[17]的方法，用0.05 mol/L的NaOH溶液進行滴定并計算菌液的總酸度。再按以下公式計算酸度變化率：

式（2）中：S為酸度變化率；AG 為酸度；ΔAG 為t1、t2時刻所測得菌液酸度的差值。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 17.0[18]對實驗數(shù)據(jù)進行分析，用Origin 8.5[19]進行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌利用低聚果糖的偏好性

各種屬的乳酸菌對低聚果糖的利用偏好性見表2。結(jié)果表明，共有18株乳酸菌能利用FOS。其中，大多數(shù)植物乳桿菌、部分干酪乳桿菌和羅伊氏乳桿菌能利用FOS，鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌、短乳桿菌和嗜熱鏈球菌普遍不利用FOS，其中包括了被廣泛研究的益生菌株LGG，這與Kaplan[20]研究中FOS對乳桿菌的選擇性增殖作用這一結(jié)果相一致。此外，F(xiàn)OS雖然是超強雙歧因子[21]，普遍能促進雙歧桿菌增殖[22]。但實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩歧雙歧桿菌CCFM16、短雙歧桿菌CCFM622、動物雙歧桿菌CCFM624和長雙歧桿菌長亞種CCFM642不利用FOS，說明不是所有的雙歧桿菌都可以利用FOS作為雙歧因子。總的來說，乳酸菌對FOS的偏好性呈現(xiàn)一定的菌株特異性。

表2 乳酸菌對低聚果糖和低聚木糖的偏好性Table 2 FOS and XOS utilization by LAB

2.2 乳酸菌利用低聚木糖的偏好性

各種屬的乳酸菌對低聚木糖的利用偏好性如表2所示，共有13株菌能利用XOS。短乳桿菌、植物乳桿菌普遍可以利用XOS，而其余乳桿菌均不能利用，說明乳桿菌對于XOS的利用在種內(nèi)比較一致，可能在種間存在差異。對于雙歧桿菌，動物雙歧桿菌CCFM625、青春雙歧桿菌CCFM626、BB6070可以利用XOS，其余菌株均不能利用，這表明XOS不能被所有雙歧桿菌利用。Immerzeel等人[23]的研究發(fā)現(xiàn)兩株人源的短乳桿菌（DSMZ 1269）和青春雙歧桿菌（ATCC 15703）可以利用XOS，這支持了作者的研究結(jié)果。

綜合分析35株乳酸菌對FOS和XOS的利用能力，發(fā)現(xiàn)4株鼠李糖乳桿菌、3株嗜熱鏈球菌、2株嗜酸乳桿菌、都不能利用FOS和XOS，而8株植物乳桿菌都可以利用FOS和XOS，呈現(xiàn)出很高的一致性，這是一個值得探討的現(xiàn)象。細菌利用低聚糖通常需要轉(zhuǎn)運蛋白和糖苷酶的參與[24]，后續(xù)可以從乳酸菌的代謝途徑或降解低聚糖的酶系及基因方面進行差異探究。此外，短乳桿菌、干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、格氏乳桿菌、羅伊氏乳桿菌和雙歧桿菌在株水平上對FOS/XOS的利用存在差異。

2.3 低聚果糖對乳酸菌體外生長、產(chǎn)酸的影響

代時相對較長，多數(shù)在100 min以上，說明其降解FOS的速度較乳桿菌慢。雖然雙歧桿菌本身較難培養(yǎng)且生長速度較慢，但短雙歧桿菌CCFM623生長速度與干酪乳桿菌相近，代時達到了84.7 min，青春雙歧桿菌CCFM626甚至達到了與植物乳桿菌相近的速度，代時為60.3 min，表明FOS對這兩株菌的促生長作用非常顯著。此外，18株乳酸菌的產(chǎn)酸速率存在差異，植物乳桿菌LP-29的產(chǎn)酸速率最快，乳桿菌的產(chǎn)酸速率普遍高于雙歧桿菌。

圖1 乳酸菌在低聚果糖中的代時Fig.1 Generation time of LAB in MRS broth added with FOS

圖2 乳酸菌在低聚果糖中的產(chǎn)酸速率Fig.2 Acid production rate of LAB in MRS broth added with FOS

乳酸菌在MRS-FOS液體培養(yǎng)基中的代時及其產(chǎn)酸速率分別見圖1和圖2。以FOS為碳源時，乳桿菌的代時普遍較短，均小于100 min，表明乳桿菌可以較快地降解FOS，促進自身的生長。雙歧桿菌

2.4 低聚木糖對乳酸菌體外生長、產(chǎn)酸的影響

乳酸菌在MRS-XOS液體培養(yǎng)基中的代時及其產(chǎn)酸速率分別如圖3和圖4所示。以XOS為碳源時，除兩株短乳桿菌代時較短，為107.8 min和69.1 min，其余乳桿菌的代時普遍大于雙歧桿菌，平均在200 min左右。說明除了兩株短乳桿菌，其它乳桿菌以XOS為碳源時的生長速度普遍小于雙歧桿菌，雙歧桿菌可以比乳桿菌更快地利用XOS。相應(yīng)地，2株短乳桿菌和3株雙歧桿菌的產(chǎn)酸速率大于其它乳桿菌（如圖4），這與其代時的差異相對應(yīng)。

總體來說，在FOS/XOS作為碳源時，菌株的生長速率和產(chǎn)酸速率呈正相關(guān)，生長速率較快的菌株，產(chǎn)酸速率也較快，且乳桿菌產(chǎn)酸速率普遍大于雙歧桿菌。但這一現(xiàn)象并不絕對，例如生長速率接近的兩株干酪乳桿菌，產(chǎn)酸速率相差較大，說明即使是同一種菌，不同株之間對同種低聚糖的利用特性也可能不同。

圖3 乳酸菌在低聚木糖中的代時Fig.3 Generation time of LAB in MRS broth added with XOS

圖4 乳酸菌在低聚木糖中的產(chǎn)酸速率Fig.4 Acid production rate of LAB in MRS broth added with XOS

3 結(jié)語

為研究不同種屬的乳酸菌對低聚果糖和低聚木糖的利用特性，作者對35株乳酸菌進行功能性低聚糖偏好性、代時和產(chǎn)酸速率的測定。使用溴甲酚紫平板法和體外培養(yǎng)的方式，發(fā)現(xiàn)乳酸菌對2種功能性低聚糖的利用具有菌株特異性但也存在一定的規(guī)律。不同種屬的乳酸菌對低聚果糖和低聚木糖的利用特性不同，這可以幫助人們更加科學(xué)地認識益生元和益生菌之間的關(guān)系，為選擇和開發(fā)益生元、益生菌以及合生元產(chǎn)品提供一些參考。作者使用的低聚糖都是由不同聚合度的寡糖組成的混合物，后續(xù)可以進一步分析乳酸菌對于不同聚合度的寡糖的偏好性以及利用規(guī)律。