謝小玉，侯爽，冉春燕

(西南大學農(nóng)學與生物科技學院，重慶 北碚 400715)

干旱是限制作物產(chǎn)量提高的重要非生物因子。季節(jié)性干旱是油菜生產(chǎn)的主要自然災(zāi)害之一，嚴重影響油菜的生長和產(chǎn)量。據(jù)報道，春旱可使中國油菜減產(chǎn)20%以上[1]，因此，了解油菜抗旱機制，培育抗旱品種非常重要。

研究表明，抗旱性是多基因控制的性狀。ZHONG等[2]研究表明，油菜BnNAC2和BnNAC5參與植物對鹽、干旱和ABA的脅迫應(yīng)答。萬喬[3]從甘藍型油菜中克隆到干旱脅迫相關(guān)基因BnBip，且研究表明該基因的表達受干旱脅迫誘導，超量表達可提高植物對干旱脅迫的耐受力。

抑制消減雜交(SSH)常被用于差異表達基因的分離和cDNA文庫的構(gòu)建。在抗病基因的篩選和研究上，前人利用SSH技術(shù)構(gòu)建了環(huán)形泰勒蟲[4]、普通野生稻[5]、黃瓜[6]、青稞[7]等作物的抑制消減文庫，篩選出與抗病相關(guān)的基因；在非生物脅迫方面，利用SSH技術(shù)，篩選出了與山葡萄抗寒性相關(guān)的抗凍蛋白(AFPs)、熱休克蛋白(Hsps)、防御素樣蛋白、細胞色素P450加單氧酶等多個相關(guān)的ESTs[8]；在抗旱基因的研究上，前人利用SSH技術(shù)構(gòu)建了獐茅[9]、檸條[10]、大豆[11]、棉花[12]、蠶豆[13]等作物的抑制消減文庫，篩選出與抗旱相關(guān)的基因。

本研究以抗旱甘藍型油菜Holiday為材料，通過對SSH技術(shù)構(gòu)建的油菜干旱誘導的cDNA文庫的測定分析，篩選在干旱脅迫下油菜的差異表達基因及參與抗旱的代謝途徑，從該文庫中隨機篩選抗旱相關(guān)基因進行實時熒光定量PCR表達分析，旨在為揭示油菜抗旱的分子機制和克隆油菜抗旱基因提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 SSH文庫分析

從前期成功構(gòu)建的SSH文庫[14]中，以巢式PCR引物Primer 1和Primer 2R進行菌液PCR 擴增, 對陽性克隆進行進一步篩選，挑選有清晰單一條帶的646個片段，較長的陽性克隆對應(yīng)菌液送寶生物工程(大連)有限公司測序；應(yīng)用VecScreen去除構(gòu)建文庫時所用的載體及巢式引物接頭序列，摒棄低質(zhì)量的序列；利用 Blast 程序在 GenBank 中尋找同源序列，分析基因功能；采用 KOBAS 程序進行基因功能歸類和代謝途徑分析，尋找與抗旱密切相關(guān)的代謝途徑；運用 Blast2GO對功能蛋白進行注釋和分類。

1.2 抗旱相關(guān)基因的表達分析

以抗旱性強的甘藍型油菜Holiday為材料，種子用15%次氯酸鈉消毒20 min，用無菌水清洗4～6次后播種于口徑為30 cm花盆中，每盆裝沙壤土12 kg，出苗后每盆留苗3株，常規(guī)管理。開花初期(整個植株4%～5%的花開放)，對油菜進行干旱處理，在處理的第1、3、5、7天(土壤含水量分別為60%、40%、30%、20%)剪取對照(未經(jīng)干旱處理)和各干旱處理頂部完全展開的第2葉，液氮速凍，–80 ℃保存。采用 First Strand cDNA Synthesis Kit(TAKARA)合成 cDNA，按照試劑盒說明書，測定其純度和濃度。隨機選取文庫中篩選到的3個與干旱脅迫相關(guān)的P5CSb、BnSOS2和CAM基因，通過引物設(shè)計和內(nèi)參基因篩選[15–16]，進行實時熒光定量PCR分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

參照PFAFFL[17]的方法計算目的基因相對表達量；采用 Microsoft Excel 2007和SAS統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSH文庫檢測結(jié)果

對成功構(gòu)建的SSH文庫隨機挑選850個單菌落進行陽性克隆篩選，726個含有插入片段，其中48個單菌落電泳結(jié)果如圖1所示。13、26、8、20、29號是空質(zhì)?；蚍翘禺愋钥寺?，陽性克隆率約為89.6%，克隆片段長250～1 000 bp，平均長度545 bp。

2.2 測序結(jié)果分析

通過對646個經(jīng)PCR鑒定的陽性克隆測序，獲得 639個單一的表達序列標簽數(shù)量(expressed sequence tag，EST)，經(jīng)過聚類、拼接和去除冗余，獲得重疊群(contigs)89條，單拷貝序列 (singleton)97條。序列長度介于101～800 bp，其中EST長度101～300 bp的有11條，301～400 bp的有28條，401～500 bp的有37條，501～600 bp的有34條，601～800 bp的有76條。平均長度為531 bp。

圖1 SSH文庫陽性克隆片段檢測結(jié)果Fig.1 Positive fragments analysis of SSH cDNA library

2.2.1 EST序列分析

對測序獲得的186條單一序列進行Blastn和Blastx數(shù)據(jù)庫的序列比對，發(fā)現(xiàn)其中166條具有同源基因，其主要來源于擬南芥、甘藍型油菜、白菜、黃瓜、大豆、蒺藜苜蓿、草莓等物種；其余20條沒有匹配項。具有同源基因的EST中，154條與已知功能的蛋白有同源性，6條與假想蛋白有同源性，4條與推定蛋白有同源性，2條與未命名蛋白有同源性(表1)。其中MYB、NAC5、鋅指蛋白等轉(zhuǎn)錄因子以及蘋果酸脫氫酶、核酮糖1,5–二磷酸羧化酶/加氧酶、果糖–1,6–二磷酸醛縮酶、磷酸核酮糖激酶等與光合相關(guān)基因以及P5CS基因、F–box 蛋白等參與油菜干旱脅迫應(yīng)答。表1列出了部分ESTs及其功能。

表1 油菜葉片干旱脅迫下部分誘導表達的基因Table 1 Part result of blast alignment in rapeseed leaves under drought stress

表1(續(xù))

表1(續(xù))

2.2.2 KEGG代謝途徑分析和基因功能分類

以擬南芥為參考物種，利用 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因和基因組百科全書)的序列注釋分析系統(tǒng)(KOBAS)程序進行代謝途徑分析。結(jié)果表明，186條單一序列中160條序列得到匹配， 26條序列無匹配信號。57條EST定位到70條代謝途徑中，表明這70條途徑與植物的抗旱性有關(guān)。P＜0.5的48條代謝途徑中，乙醛酸和二羧酸代謝、碳代謝、光合碳固定、泛素–蛋白酶體途徑、氨基酸合成代謝、氮代謝、氰基氨基酸代謝、糖酵解、檸檬酸循環(huán)、精氨酸和脯氨酸代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等12個途徑都有3條及3條以上EST定位其中。P＜0.1的代謝途徑如表2所示。

表2 KOBAS分析的干旱誘導代謝途徑Table 2 Representative drought-induced metabolic pathway identified by KOBAS

根據(jù)P值推測乙醛酸和二羧酸代謝、碳代謝、光合器官中的碳固定、泛素–蛋白酶體途徑、氨基酸生物合成、氮代謝可能在油菜干旱脅迫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用。

2.2.3 GO基因注釋和功能分類

通過對186條單一序列進行GO功能注釋、分類，結(jié)果表明，111條EST共同在細胞組分、分子功能、生物學過程中執(zhí)行著功能，141條EST在生物學過程中發(fā)揮作用，133條EST在分子功能中發(fā)揮作用，144條EST在細胞組分中發(fā)揮作用。而細胞組分、分子功能及生物學過程的注釋中分布的亞類各不相同(表3)，這些單一序列涉及到細胞組分中所占比例較大的是細胞(cell)和細胞器(organelle)，分子功能中所占比例較大的是蛋白綁定(Binding)和催化活性(catalytic activity)，生物學過程中所占比例較大的是細胞過程(cellular process)和代謝過程(metabolic process)，表明甘藍型油菜在干旱脅迫下細胞及細胞器有關(guān)的組分和元件響應(yīng)積極，綁定結(jié)合和催化活性功能加強，新陳代謝加速，防御機制加強。

表3 GO基因注釋的功能分類的主要亞類及其比例Table 3 Main sub-category and percentage of GO annotated gene classification of EST

2.3 3個抗旱基因表達分析

2.3.1 總RNA質(zhì)量檢測及內(nèi)參基因的引物篩選

對樣品的總 RNA及 mRNA質(zhì)量檢測結(jié)果顯示，抽取的 RNA品質(zhì)和純度符合反轉(zhuǎn)錄和RT–qPCR的要求。通過對ACT7和UBC21候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析，選擇ACT7作為 RT–qPCR分析中的內(nèi)參基因[15]。其中目的基因和內(nèi)參基因的實時熒光定量PCR引物如表4。

表4 目的基因和候選內(nèi)參基因的RT–qPCR引物Table 4 The primers of candidate reference genes and target gene

2.3.2 3個抗旱基因表達量分析

對3個抗旱基因的相對表達量(表5)進行分析。結(jié)果表明：在干旱脅迫 1～5 d，油菜葉片中CAM和BnSOS2基因表達量均升高，而P5CSb在干旱脅迫后先輕微下降，第 5 天開始其表達量超過處理前。在干旱脅迫的前期(第1～5 天)，基因表達量從大到小依次為CAM、BnSOS2、P5CSb，干旱脅迫的后期(第 7 天)，基因表達量從大到小依次為CAM、P5CSb、BnSOS2；在整個干旱脅迫期間，BnSOS2和CAM基因表達量先增加后降低?？傮w而言，CAM、BnSOS2和P5CSb基因在干旱脅迫后均出現(xiàn)了上調(diào)表達，推測這些基因在油菜抵抗干旱脅迫中發(fā)揮了重要作用。

表5 干旱脅迫下3個抗旱基因的表達量Table 5 Expression values of three drought-related genes in leaf under drought stress

3 結(jié)論與討論

當植物受到干旱脅迫時，植物能在分子水平上作出適應(yīng)性調(diào)節(jié)，從而增強其對脅迫的耐受性。本研究結(jié)果表明，乙醛酸和二羧酸代謝、碳代謝、光合器官中的碳固定、泛素–蛋白酶體途徑、氨基酸生物合成、氮代謝等可能在油菜干旱脅迫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。SINGH等[18]的研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植物中AtNAC19、AtNAC55和RD26等過量表達均能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱能力；鋅指蛋白在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、病原菌防御及脅迫反應(yīng)等關(guān)鍵過程中發(fā)揮重要作用[19]。本研究中，MYB(contig35)、NAC(contig39)、鋅指蛋白(contig37)等轉(zhuǎn)錄因子及泛素類蛋白基因、抗脫水素基因、滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因(甘氨酸蛋白等)、抗氧化脅迫基因及光合作用相關(guān)基因參與油菜干旱脅迫應(yīng)答，與前人的研究結(jié)果一致。

干旱對光合碳同化過程中重要酶類的活性產(chǎn)生影響。研究表明，在輕度和中度干旱脅迫下，核酮糖–1,5–二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的活性以及1,5–二磷酸核酮糖(RuBP)的含量和活性基本保持穩(wěn)定；在嚴重干旱時，二者降低；不抗旱的植物種類或品種降低幅度更大[20]。葡萄在干旱脅迫下，磷酸核酮糖激酶等會發(fā)揮關(guān)鍵性的作用，以抵御干旱脅迫[21]。與光合碳同化過程有關(guān)的其他一些酶，如蔗糖磷酸合成酶(SPS)、果糖–1,6–二磷酸脂酶、NADP–蘋果酸酶(NADP–ME)和 NADP–蘋果酸脫氫酶(NADP–MDH)、碳酸酐酶(CA)以及 5–磷酸核酮糖激酶等的活性在干旱脅迫下都受到不同程度的抑制[22]。本研究結(jié)果表明，干旱脅迫下與油菜光合相關(guān)的蘋果酸脫氫酶 (contig16、CTE9)、核酮糖1,5 – 二磷酸羧化酶/加氧酶(contig89)、果糖–1，6–二磷酸醛縮酶(contig1、contig4)、磷酸核酮糖激酶(contig86、contig27)等參與光合碳固定過程，為油菜抵御干旱儲備能量。

P5CS基因作為谷氨酸途徑的限速酶，對谷氨酸含量的積累特別關(guān)鍵；周精華等[23]的研究結(jié)果表明，P5CS基因受干旱脅迫的誘導。BnSOS2基因編碼絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，作為抗鹽相關(guān)基因研究得較多[24]，而作為干旱脅迫基因研究得較少。本研究中發(fā)現(xiàn)，BnSOS2基因在受到干旱脅迫時表達量增加，說明BnSOS2參與了干旱脅迫的信號轉(zhuǎn)導。CAM(鈣調(diào)蛋白)是Ca2+的受體，與Ca2+結(jié)合后，具有了催化活性的CAM基因[25]，可以激活許多下游靶細胞，調(diào)節(jié)靶蛋白的活性，響應(yīng)干旱脅迫。本研究中，P5CS、BnSOS2、CAM基因在干旱脅迫下均呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)，表明這3個基因均參與了干旱脅迫的應(yīng)答。