陳洪強(qiáng)，夏惠，王進(jìn)，鄧群仙，梁東，呂秀蘭，唐禮平

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川 成都 611130；2.廣安市前鋒區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 廣安 638019)

植物中的類黃酮化合物依據(jù)結(jié)構(gòu)上的差異和生物合成的先后被分為查爾酮類、黃烷酮類、黃酮類、黃酮醇類、花色素苷類、黃烷醇類和原花色素類等7大類。類黃酮具有很強(qiáng)的抗氧化功能，可提高植物的抗逆性[1]，影響果蔬及其加工品的色澤和風(fēng)味[2]，還具有抗菌、消炎和抑制癌細(xì)胞等功效[3–4]。類黃酮類物質(zhì)來(lái)自苯丙氨酸代謝途徑。苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL)等催化下形成4–香豆酰輔酶A，再經(jīng)查爾酮合成酶(CHS)和查爾酮異構(gòu)酶(CHI)的作用進(jìn)入類黃酮代謝途徑[5]。

葡萄中的類黃酮化合物主要包括花色素苷類、黃酮醇類和黃烷醇類，主要存在于果皮中[6]?；ㄉ剀疹愔饕嬖谟诩t(紫、紫黑、藍(lán))色葡萄果皮中，以花青素和花翠素的糖基化、甲基化和?；问酱嬖?，一般不含天竺葵素及其衍生物。不同品種間花色苷含量及種類差異極大[7]，花色素苷的積累從果實(shí)轉(zhuǎn)熟期開(kāi)始直至成熟。目前已獲得葡萄果皮中花色素苷生物合成途徑中關(guān)鍵酶黃烷酮醇–4–還原酶(DFR)、無(wú)色花色素雙加氧酶(LDOX)、UDP–葡萄糖–類黃酮–3–O–糖苷轉(zhuǎn)移酶(UFGT)和O–甲基轉(zhuǎn)移酶(OOMT)等的基因序列[8]。葡萄黃酮醇中常見(jiàn)的苷元主要是山柰酚、槲皮素和楊梅素等，它們的配糖體主要是以葡萄糖、半乳糖、鼠李糖等組成的單糖、二糖或多糖，均為3–O–配糖體，且以3–O–葡糖基、3–O–半乳糖基和3–O–葡糖醛酸基為主。黃酮醇生物合成途徑中相關(guān)基因FLS、F3H、F3’H和F3’5’H等已被克隆、鑒定，并進(jìn)行了部分功能驗(yàn)證[9]。黃烷醇類物質(zhì)是葡萄果實(shí)中重要的酚類物質(zhì)之一，聚合的黃烷醇又被稱為原花色素, 目前已獲得與黃烷醇合成相關(guān)的無(wú)色花色素還原酶(LAR)和花色素還原酶(ANR)及其基因序列[10]。

貴州和四川近年來(lái)已成為葡萄主栽區(qū)[11]。這些地區(qū)在葡萄生長(zhǎng)過(guò)程中面臨高溫、多雨、寡日照等不利生態(tài)條件，因而以避雨栽培模式為主。為探索四川地區(qū)避雨栽培條件下葡萄類黃酮物質(zhì)生物合成規(guī)律，筆者以西南產(chǎn)區(qū)主栽的‘夏黑’葡萄為試材，測(cè)定了其果實(shí)發(fā)育過(guò)程中果皮的4種類黃酮組分含量，并分析了這些類黃酮物質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)，以期豐富葡萄類黃酮在不同栽培條件下的代謝機(jī)理研究。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為四川省崇州市榿泉鎮(zhèn)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)科研基地 4年生‘夏黑’葡萄(Vitis viniferaL.cv.Summer Black)。

1.2 方法

葡萄單干四主蔓水平棚架避雨栽培，株行距為1.5 m × 3.0 m。從葡萄謝花20 d后開(kāi)始，至果實(shí)成熟(花后80 d)結(jié)束，每隔10 d(±2 d)取葡萄果實(shí)，分離果皮，用液氮速凍后保存于–80 ℃冰箱中，用于測(cè)定果皮中各類黃酮組分含量，分析相關(guān)基因表達(dá)。

1.2.1 葡萄果皮類黃酮物質(zhì)的提取及組分的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[12]的方法，提取葡萄果皮類黃酮物質(zhì)。100 mL提取液中甲醇、甲酸、無(wú)水乙醇體積比為70∶2∶28。稱取果皮0.3 g，加2 mL提取液，研磨后離心，再加 3 mL提取液沖洗研缽后并入離心管。超聲浸提后10 000 g離心10 min，上清液用0.45 μm的濾膜過(guò)濾后用于類黃酮物質(zhì)含量的測(cè)定。

1) 總黃酮醇含量的測(cè)定。參照文獻(xiàn)[13]的方法，略有修改。提取液、氯化鋁和乙酸鈉混合后孵育2.5 h，440 nm下測(cè)定吸光值。結(jié)果以槲皮素等價(jià)值表示。

2) 總黃烷醇和總原花色素含量的測(cè)定。參照文獻(xiàn)[14]的方法，略有改動(dòng)。提取液與 p–DMACA溶液混勻后在640 nm下測(cè)定總黃烷醇含量，結(jié)果以兒茶素等價(jià)值表示。提取液中加入香草醛–甲醇溶液和H2SO4–甲醇溶液，混勻后避光孵育，于500 nm測(cè)定總原花色素含量。

3) 總花色素和總類黃酮含量的測(cè)定。參照文獻(xiàn)[15]的方法，略有改動(dòng)?？偦ㄉ睾坑胮H示差法測(cè)量，結(jié)果以矢車菊–3–葡萄糖苷等價(jià)值表示?？傤慄S酮含量以蘆丁等價(jià)值表示。

1.2.2 葡萄果皮RNA提取與基因表達(dá)分析

葡萄果皮總 RNA的提取參照 RNeasy Plant Mini Kit試劑盒(Qiagen)使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用DNase I降解 RNA中存留的 DNA。用 Nanodrop ND–2000 spectrophotometer(Thermo)進(jìn)行定量。利用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(Takara)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，各基因引物如表1所示。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后按照 SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒(Takara)在熒光定量PCR儀上進(jìn)行Real–time RT–PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后數(shù)據(jù)分析采用2–ΔΔCt法，重復(fù)3次。以EF1?和GAPDH為參照基因。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄果皮中類黃酮物質(zhì)含量的變化

葡萄果實(shí)發(fā)育過(guò)程中果皮類黃酮物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果列于表2?；ê?1 d時(shí)，葡萄果皮中的總黃酮醇含量最高，隨后含量下降，至花后52 d下降至最低，花后 52～69 d的含量基本保持不變，花后69～80 d再次升高?？傸S烷醇含量和總原花色素含量的變化趨勢(shì)相似，均從花后21 d開(kāi)始增加，直至花后42 d時(shí)達(dá)到最大值，隨著果實(shí)進(jìn)入轉(zhuǎn)色期(花后40～50 d)含量下降，之后含量變化不大。

果實(shí)進(jìn)入轉(zhuǎn)色期之前，幾乎檢測(cè)不到總花色素含量，從花后42 d起，含量逐漸增加，花后60～80 d是快速增長(zhǎng)期，在果實(shí)完全成熟時(shí)達(dá)到最高值，是花后42 d時(shí)的15倍?；ê?1～31 d，總類黃酮含量逐漸下降，隨后又升高，之后隨著果實(shí)進(jìn)入轉(zhuǎn)色成熟期逐步下降，花后69～80 d 又有1次小幅升高，低于果實(shí)發(fā)育早期時(shí)的含量。

表2 葡萄果皮類黃酮物質(zhì)的含量Table 2 The content of flavonoids in grape peel mg/g

2.2 類黃酮物質(zhì)生物合成相關(guān)基因的表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量RT–PCR分析葡萄果皮中類黃酮生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果如圖1所示。PAL1在果實(shí)生長(zhǎng)初期表達(dá)水平快速上升，至花后31 d達(dá)到最高值，隨后表達(dá)水平快速下降，但在成熟時(shí)再次升高；果實(shí)生長(zhǎng)初期PAL2表達(dá)水平較低，后隨果實(shí)成熟逐漸升高。進(jìn)入轉(zhuǎn)色期前，CHS2表達(dá)水平一直下降，后隨果實(shí)成熟逐漸升高；CHS3和CHI2表達(dá)隨果實(shí)生長(zhǎng)至花后60 d時(shí)達(dá)到最高水平，隨后降低；CHI1的表達(dá)水平隨果實(shí)成熟逐漸升高；F3H隨果實(shí)成熟表達(dá)逐漸下降；F3’H在幼果期表達(dá)水平迅速上升，而后下降，隨成熟再次上升；F3’5’H、LDOX、UFGT、OMT和FLS的表達(dá)水平均是果實(shí)生長(zhǎng)中后期高于前期；DFR的表達(dá)水平在花后31 d左右達(dá)到最高，隨后迅速下降，但又隨果實(shí)成熟逐漸升高；LAR1、LAR2和ANR的表達(dá)相似，均是在果實(shí)生長(zhǎng)早、中期較高，后隨果實(shí)成熟下降。

3 討論

DOWNEY 等[16]測(cè)定了‘Shiraz’和‘Chardonnay’葡萄果實(shí)生長(zhǎng)過(guò)程中黃酮醇含量的變化，發(fā)現(xiàn)坐果初期和果實(shí)成熟期是黃酮醇主要的積累時(shí)期，轉(zhuǎn)色期黃酮醇含量非常低。FANG等[17]也發(fā)現(xiàn)‘Cabernet Sauvignon’葡萄的幼果期和成熟期是總黃酮醇和單體黃酮醇的主要積累時(shí)期。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了同樣的趨勢(shì)，而且還發(fā)現(xiàn)黃酮醇生物合成的關(guān)鍵基因FLS的表達(dá)與黃酮醇含量的變化趨勢(shì)一致。這可能是因?yàn)槠咸压麑?shí)發(fā)育的早期由于碳水化合物含量比較低，限制了花色素苷的生物合成，因此，花色素苷和黃酮醇生物合成的共同底物二氫黃酮醇更多地流向了黃酮醇生物合成方向[16–17]。

BOGS 等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，從‘Shiraz’葡萄開(kāi)花起，原花色素就開(kāi)始積累，隨后持續(xù)增加直至果實(shí)轉(zhuǎn)熟期。FUJITA等[18]和CADOT等[19]的研究也發(fā)現(xiàn)，葡萄果實(shí)中黃烷–3–醇類物質(zhì)的積累主要是在葡萄進(jìn)入轉(zhuǎn)色期前，而后伴隨著葡萄果實(shí)的成熟呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。本研究中，發(fā)現(xiàn)黃烷醇和原花色素含量均在花后21～42 d時(shí)增加，后隨果實(shí)進(jìn)入轉(zhuǎn)色期含量顯著下降，進(jìn)入成熟期后含量基本不再變化或略有下降。雖然黃烷醇和原花色素含量在果實(shí)生長(zhǎng)過(guò)程中的變化趨勢(shì)略有不同，但總體上可以看到，幼果期黃烷醇和原花色素含量顯著高于成熟期。這可能是因?yàn)橛坠诨ㄉ剀疹惢衔锘静缓铣?，無(wú)色花色素和花色素單體在LAR和ANR的催化下更多地轉(zhuǎn)變?yōu)辄S烷醇或者原花色素，但進(jìn)入轉(zhuǎn)色成熟期后，無(wú)色花色素和花色素單體便主要用于花色素苷的生物合成了。本研究中LAR2和ANR的表達(dá)趨勢(shì)與 BOGS等[10]在‘Shiraz’葡萄果皮中的研究結(jié)果較為一致，但LAR1表達(dá)趨勢(shì)差異較大，這可能與葡萄品種和栽培環(huán)境有關(guān)。

從本研究的結(jié)果來(lái)看，幼果期(花后 21～42 d)和果實(shí)成熟后期(花后 69～80 d)是類黃酮類化合物主要的積累時(shí)期，這與以往研究[17,20]的發(fā)現(xiàn)是一致的。幼果期是葡萄果實(shí)生長(zhǎng)的第1個(gè)快速期，這一時(shí)期果實(shí)細(xì)胞大量分裂和膨大，并伴隨著強(qiáng)烈的呼吸作用和新陳代謝，導(dǎo)致包括類黃酮化合物在內(nèi)的各種代謝產(chǎn)物迅速積累。成熟期是葡萄果實(shí)快速生長(zhǎng)的另一時(shí)期，碳水化合物和各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量積累，可能使類黃酮類化合物再次積累，但由于細(xì)胞內(nèi)含水量較高，因而積累量反不如幼果期。另外，類黃酮類化合物與植物的抗逆性密切相關(guān)。相比于轉(zhuǎn)色期和成熟初期充足的水分條件，葡萄果實(shí)在幼果期時(shí)雨水較少，而成熟后期一般都會(huì)人為控水以促成熟，從而使葡萄受到一定程度的干旱脅迫，因此，葡萄果實(shí)也可能會(huì)合成更多的類黃酮化合物。

圖1 葡萄果皮類黃酮生物合成基因的相對(duì)表達(dá)水平Fig.1 Relative expression level of genes involved in flavonoid biosynthesis in developing grape berries