宋博雅, 郝選明

(1.西安體育學院 運動與健康科學學院，陜西 西安 710068; 2.華南師范大學 體育科學學院，廣東 廣州 510006)

衰老是機體隨年齡增長出現的多系統(tǒng)、多組織器官發(fā)生的退行性改變及機能的衰退，是一種不可逃避的自然生理現象。機體在自然老化進程中有一明顯共性即衰老機體長期處于一種慢性促炎癥反應進行性升高的狀態(tài)，被稱為炎性衰老[1](inflamm-aging)，這種炎性狀態(tài)與多種老年相關疾病如阿爾茲海默癥、動脈粥樣硬化、帕金森病、骨質疏松等的發(fā)生發(fā)展密切相關[2]。研究發(fā)現，促炎癥細胞因子在由慢性炎癥誘發(fā)的炎性衰老中起著核心作用[3]。衰老機體內炎癥失衡，最終表現為促炎反應過度是導致炎性衰老的根本原因[4]。白細胞介素-6(interleukin 6，IL-6)被認為是與老年性疾病及導致身體功能殘疾關聯最強烈的炎癥反應因子，其血清水平可作為炎性衰老的預測指標[5]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)也是一種重要的促炎因子，能夠促進局部和系統(tǒng)性炎癥反應。老年人血清中IL-6和TNF-α水平的升高與疾病、殘疾和死亡率有關。白細胞介素-10(interleukin 10，IL-10)又稱細胞因子合成抑制因子，能夠抑制炎癥反應和促炎因子的釋放。IL-6、TNF-α和IL-10等炎癥細胞因子可用作炎性衰老的血清學標志[3]。大量人體及動物實驗表明，有氧運動能夠延緩機體衰老[6,7]。但目前，運動干預對炎性衰老機制的研究較少，本實驗研究借助D-半乳糖致衰老模型模擬自然衰老，觀察長期適宜強度運動對衰老進程大鼠血液炎性因子表達的影響，探尋運動干預延緩衰老的可能機制，為抗衰老研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物分組

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠24只，體重280～310 g，2月齡，購自西安交通大學醫(yī)學院動物實驗中心。適應性喂養(yǎng)一周后，隨機分為正常對照組(Normal Control Group，NC組)，衰老模型對照組(Aging Control Group，AC組)，衰老模型訓練組(Aging Exercise Group，AE組),每組8只。

1.2 建模

(1)衰老模型的建立：本實驗采用D-半乳糖致衰老模型。AC組、AE組大鼠均每日腹腔注射1次D-半乳糖125 mg/kg；NC組腹腔注射等時、等量的生理鹽水作為對照；AC與NC組均常規(guī)飼養(yǎng)，自由活動，共6周。

(2)運動方案：AE組除每日腹腔注射等量D-半乳糖外，同時進行6周的跑臺訓練。訓練方案參照Bedford運動負荷標準[8]，選擇中小強度跑臺訓練(坡度為0°)，方案如下：第1周跑速20 m/min；第2～6周跑速25 m/min，訓練時間由第1周15 min/day，每周增加5 min，直到第6周40 min/day。每周一、三、五訓練，其他時間休息，連續(xù)6周[9-11]。

1.3 大鼠的一般情況及衰老指標檢測[11]

造模及訓練過程中每日監(jiān)測各組大鼠生存狀態(tài)及生物學行為的動態(tài)變化，進行組間比較。第6周訓練結束24 h后，對各組大鼠腹腔麻醉，灌注取材。按照衰老相關β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色試劑盒方法檢測各組大鼠腦、脾、腎組織衰老細胞百分率。并參照衰老標志蛋白p16蛋白的免疫組化試劑盒使用說明對大鼠腦、脾、腎組織進行組織化學染色，光學顯微鏡下觀察p16蛋白陽性表達程度，應用Image-pro plus6.0軟件對免疫組化染色進行半定量分析，檢測結果與國內外有關D-半乳糖模型研究結果一致，說明D-半乳糖致衰老模型復制成功。

1.4 血清IL-6、IL-10、TNF-α檢測

各組大鼠腹腔麻醉后，腹主動脈取血0.5 ml置于試管內，常溫下靜置1 h后，以3 500 r/min離心10 min，取血清 0.1 ml，取血48 h內由試劑公司專業(yè)人員按試劑盒操作說明采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定血清中細胞因子IL-6、IL-10及TNF-α的含量。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 跑臺運動對各組大鼠血清白細胞介素-6(IL-6)水平的影響

由表1知，與NC組比較，AC組大鼠血清IL-6分泌量明顯增多，差異顯著(P<0.01)；而AE組IL-6分泌量與NC組相差不多，差異不具有統(tǒng)計學意義；與AC組相比，AE組大鼠血清IL-6水平顯著下降(P<0.01)。提示，在衰老進程中促炎癥因子IL-6表達明顯升高，而6周的跑臺訓練可使機體IL-6的分泌水平大幅度降低。

2.2 跑臺運動對各組大鼠血清白細胞介素-10(IL-10)水平的影響

AE組大鼠血清IL-10含量顯著高于AC和NC組(P< 0.01)。AC組與NC組大鼠血清IL-10含量相差不多，差異不具有統(tǒng)計學意義(表1)。提示，6周中小強度的跑臺訓練可促使機體分泌更多的抗炎癥因子IL-10，增強機體的抗炎能力。

2.3 跑臺運動對各組大鼠血清白細胞介素腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平的影響

大鼠血清TNF-α分泌量AC組最多，AE組次之，NC組最少。與AC組相比，AE組TNF-α分泌量明顯降低，差異顯著(P<0.01)。提示，6周中小強度的跑臺訓練可使機體促炎癥因子TNF-α的分泌量顯著減少(表1)。

GroupIL-6IL-10TNF-α NormalControlGroup(NC)54.04±16.56??##24.39±5.904.71±1.26AgingControlGroup(AC)109.56±30.70??22.08±6.9127.84±3.95??##AgingExerciseGroup(AE)41.65±15.98##38.27±3.35??##16.15±4.63?##

*P<0.05,**P<0.01vsNC；#P<0.05,##P<0.01vsAC

3 討論

在自然衰老進程中，隨機體年齡增長會出現促炎癥反應狀態(tài)呈慢性、進行性升高的現象，被稱為炎性衰老，炎性衰老是衰老研究領域的新成員。機體內炎性水平的高低是影響衰老速率及壽命的決定因素之一[5]，這種持續(xù)的、慢性的、低程度的炎性刺激會影響周圍組織狀態(tài)，造成一個或多個器官損傷，是一些老年多發(fā)性疾病如帕金森病、阿爾茨海默病、動脈粥樣硬化、骨質疏松等的發(fā)病基礎[2，12]。機體內炎癥細胞因子網絡是由兩個相互對立又相互依存的促炎癥細胞因子網絡和抗炎癥細胞因子網絡交織而成，兩者此消彼長的動態(tài)變化決定著機體炎癥狀態(tài)是朝向有利還是有害的方向發(fā)展。促炎-抗炎細胞因子網絡平衡失調，最終表現為促炎癥反應呈增齡性升高是炎性衰老的最主要的特點。大量人群研究表明，衰老與機體內高促炎癥反應狀態(tài)相關，歸因于老年人血清中促炎癥介質如白細胞介素-1β、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α及C反應蛋白的升高，使組織器官不斷的暴露在炎性環(huán)境中，促炎癥細胞因子能夠通過氧化應激途徑及激活相關信號通路，影響細胞的增殖分化及機體內環(huán)境穩(wěn)定，進而誘導細胞衰老，而衰老的細胞又會產生一系列的炎癥應激[13]，分泌化學因子、蛋白酶、炎性細胞因子、生長因子等導致組織衰老及衰老相關疾病的發(fā)生，促炎癥細胞因子與細胞衰老兩者構成了互為因果的惡性循環(huán)，進一步加速炎性衰老進程[2]。

白細胞介素-6(interleukin 6，IL-6)是一種重要的內源性炎癥細胞因子和免疫調節(jié)因子，主要由T、B淋巴細胞、巨噬細胞及單核細胞產生，在傳遞信息、調節(jié)免疫功能、介導炎癥反應中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現，年輕人群的血清IL-6水平普遍較低，而當50～60歲時，受刺激的外周淋巴細胞會產生更高水平的IL-6[14]。異常高水平的IL-6可能激發(fā)炎癥反應、引起內分泌功能紊亂，加速機體老化，在衰老和眾多老年性疾病發(fā)生時，均伴有外周血IL-6水平升高的現象。血清IL-6水平是最常用的評估炎癥狀態(tài)的血清標志物，可作為老年人炎性衰老的預測標志[5,15]。本實驗亦同樣發(fā)現，AC組大鼠血清IL-6分泌水平顯著高于NC組(P<0.01)，證實了在衰老進程中機體呈現出促炎癥因子呈增齡性明顯升高的炎性狀態(tài)。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)是機體內一種強有力的促炎癥因子，主要由T淋巴細胞、活化的單核巨噬細胞分泌，能夠調節(jié)炎癥反應，其在炎癥反應早期即可大量釋放，誘導產生如IL-1、IL-6等多種促炎癥細胞因子，啟動炎癥級聯反應，進一步加重炎癥反應的程度[16]。Freund等報告指出，超過50歲人群的血清炎性因子如IL-6、TNF-α分泌水平較年輕人群升高2～4倍[17]。本實驗發(fā)現，AC組大鼠血清TNF-α分泌量極顯著高于NC組(P<0.01)，說明經過6周D-半乳糖干預后的AC組大鼠體內炎性水平明顯高于NC組，并且可能由于AC組大鼠體內存在著大量的炎性介質TNF-α，其能誘導產生更多的IL-6致使體內炎癥程度進一步加重。有研究指出，對衰老進程中的大鼠進行游泳鍛煉，可明顯改善衰老大鼠膠質細胞的激活狀態(tài)并顯著下調促炎因子TNF-a的表達[18]。還有研究發(fā)現，對大鼠進行每周2 d，2次/天的12W低強度低密度抗阻訓練后，其骨骼肌TNF-α mRNA表達降低40%[19]。Colbert 等研究指出，經常運動的老年人相對于久坐的老年人，循環(huán)血中具有較低水平的 TNF-α、IL-6和CRP[20]。本實驗結果表明，經過6周中小強度跑臺訓練的AE組大鼠血清IL-6及TNF-α分泌量明顯較AC組降低，差異顯著(P<0.01)，說明6周中小強度的跑臺訓練在一定程度上可以干預機體血清促炎癥因子的分泌，降低機體炎癥反應程度。IL-10是細胞因子網絡中一種重要的抗炎細胞因子，主要由Th2細胞產生，其可通過調節(jié)PI3k/Akt、STAT3、ERK等相關信號通路激活核轉錄因子NF-κ B的表達，進而抑制IL-6、IL-8、TNF-α等促炎細胞因子的表達，降低機體炎癥反應[21]。IL-10與肌動蛋白有關，骨骼肌運動會刺激機體外周血IL-10、IL-1ra及sTNF-R水平的增加，這表明運動促進了抗炎細胞因子的環(huán)境。本實驗發(fā)現，AE組大鼠血清IL-10含量顯著高于AC和NC組(P<0.01)。提示，6周中小強度的跑臺訓練可促使機體分泌更多的抗炎癥因子IL-10，提高機體的抗炎能力。

運動作為一種應激刺激能引起機體出現短暫的炎癥反應，伴有白細胞增多、氧化應激和血漿C反應蛋白(CRP)水平升高的現象，隨后機體會出現一個長期的抗炎癥的適應性反應。本實驗也同樣發(fā)現，6周的運動干預可以顯著上調抗炎因子IL-10的分泌，下調促炎因子IL-6及TNF-α的分泌水平，其可能機制是由于機體對6周跑臺訓練產生了良好的適應性反應，體內抗炎水平升高，伴隨抗炎因子IL-10的分泌增加，促炎因子IL-6及TNF-α的表達在一定程度上受到抑制，扭轉了炎性衰老中促炎因子水平逐漸上調而抗炎因子水平逐漸下調的現狀，重塑機體促炎-抗炎癥細胞因子網絡新平衡，從而達到延緩炎性衰老的目的。