殷艷

（涼山州食品藥品檢驗所 四川西昌 615000）

1 前言

脂質(zhì)是生物有機分子，極難溶于水，卻能輕易溶于非極性溶劑。而食品脂質(zhì)組分復(fù)雜，同時含量存在較大差異，要采用適合的組學(xué)分析技術(shù)手段，才能使各種組分得到有效分離，進一步提取檢測。應(yīng)用液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)色譜技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)的優(yōu)勢互補，滿足食品脂質(zhì)組學(xué)研究需求。

2 液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用概述

液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)是將液相色譜和質(zhì)譜2 種技術(shù)優(yōu)勢結(jié)合在一起的聯(lián)合檢測技術(shù)，在實現(xiàn)復(fù)雜樣品高效分離的同時，能完成準(zhǔn)確定性與定量分析，保持較高靈敏度?，F(xiàn)階段，液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)屬于常見組學(xué)分析手段，能夠用于實現(xiàn)食品脂質(zhì)定性和定量分析。借助液相色譜技術(shù)，能夠完成食品脂質(zhì)分類，然后利用質(zhì)譜技術(shù)完成脂質(zhì)分子檢測，提升組學(xué)分析的靈敏度和選擇性。目前，采用該技術(shù)不僅能對谷物、植物油、豬肉、雞肉等常見種植業(yè)產(chǎn)品和畜牧產(chǎn)品進行脂質(zhì)組學(xué)分析，還能對魚類、貝類等水產(chǎn)品實時程序化結(jié)構(gòu)測定，結(jié)合脂質(zhì)種類完成膽固醇、磷脂類等不同組分提取，利用系列固定相和分子間有機極性差異進行樣品洗脫處理，最終實現(xiàn)各類分子準(zhǔn)確檢測。

3 基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)的食品脂質(zhì)組學(xué)研究

在食品脂質(zhì)組學(xué)研究方面，應(yīng)考慮食品擁有復(fù)雜的脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，同時理化性質(zhì)較復(fù)雜，只有采用高分辨率和高分離水平的檢測技術(shù)，才能使檢測結(jié)果保持較高精確度。按照組學(xué)研究流程，需要先完成實驗設(shè)計，確定食品來源及實驗方法，然后進行樣品預(yù)處理。在此基礎(chǔ)上，可以采用先進技術(shù)手段進行實驗數(shù)據(jù)采集，再完成數(shù)據(jù)處理與分析，得到最終的定性與定量分析結(jié)果。采用液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)，可以滿足食品脂質(zhì)組學(xué)分析的需求，因此，還要完成相應(yīng)實驗設(shè)計分析。

3.1 實驗設(shè)計

3.1.1 實驗條件

實驗采用的樣品是由超市采購得到的冰鮮魷魚，配備1，2-二氯乙烷、丙酮2 種分析純，另外配備甲醇、乙腈、乙酸、甲酸、甲酸銨和乙酸銨這幾種色譜純，準(zhǔn)備卵磷脂（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰絲氨酸（PS）4 種標(biāo)準(zhǔn)品，純度能夠達到99.9%以上。實驗采用的儀器包含Agilent G6460A液相色譜儀、4000QTRAP 串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀、電噴霧離子源、高速冷凍離心機、氮吹儀、渦旋混勻器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和超純水系統(tǒng)。

3.1.2 實驗方法

實驗?zāi)康脑谟趯λa(chǎn)品中的 PC、PE、PI、PS 4 種組分展開分析，為判別品質(zhì)和追溯產(chǎn)地等工作開展提供數(shù)據(jù)支撐。對樣品材料進行處理，需要在低溫條件下完成樣品制備，采用液相色譜法完成組分提取，然后利用質(zhì)譜分析技術(shù)實現(xiàn)定量分析。得到的檢測數(shù)據(jù)需要采取預(yù)處理、降噪等手段進行處理，完成數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，繼而得到實驗分析結(jié)論。

3.2 脂質(zhì)組學(xué)分析過程

3.2.1 樣品預(yù)處理

在分析食品脂質(zhì)組學(xué)過程中，樣品預(yù)處理應(yīng)達到脂質(zhì)分離檢測要求，避免脂質(zhì)在有氧條件下發(fā)生氧化反應(yīng)，因此，需要在低溫環(huán)境下控制脂質(zhì)分子的氧化分解[1]。在實驗中，需要將取魷魚內(nèi)臟打碎勻漿，在-20℃下保存。而操作過程應(yīng)不超過1 h，以免出現(xiàn)脂質(zhì)分子氧化問題。稱取10 g 魷魚內(nèi)臟樣品，添加 30 mL 按照 1∶2 比例均勻混合的 1，2-二氯乙烷和甲醇混合液后，添加10 mL 超純水搖勻，然后在1 000 r/min 速度下離心10 min。利用移液器完成下層清液提取，在上層清液和固形物中添加10 mL的1，2-二氯乙烷后，重復(fù)進行離心提取。最終對提取到的清液進行合并，利用圓底燒瓶和蒸發(fā)儀進行清夜處理，在70℃溫度條件下使1，2-二氯乙烷順利揮發(fā)，從而得到由磷脂、甘油酯等脂質(zhì)成分構(gòu)成的脂質(zhì)混合物。對混合物進行冷卻處理后，添加100 mL預(yù)冷丙酮，然后進行振蕩萃取。在8 000 r/min條件下離心6 min，完成上層清液提取后，利用氮吹儀吹干，就可以完成食品中磷脂組分提取。在樣品預(yù)處理階段，需要在各組樣品中吸取等體積樣品混合，完成質(zhì)量控制樣品制備，采取相同的預(yù)處理步驟。進樣期間，每完成3 個樣品檢測應(yīng)插入1 個質(zhì)量控制樣品，用于對檢測方法的穩(wěn)定性展開評價[2]。

3.2.2 色譜-質(zhì)譜聯(lián)測

采用色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法，能夠使時間維度得到保留，根據(jù)樣品不同脂質(zhì)組分在色譜柱上的結(jié)合能力差異進行組分分離檢測，提高分析通量和動態(tài)范圍[3]。實際液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)測過程中，采用5 μm的 COSMPSIL HILIC 色譜柱（4.6 mm×150 mm），流動相A 采用含有0.1%甲酸的乙腈溶液，流動相B采用水溶液，存在0.1%甲酸和20 mmol/L 甲酸銨。在檢測過程中，流動相保持 200 μL/min 流速，進樣量為 2 μL。在梯度洗脫過程中，0～3 min 對95%流動相A 進行維持，在 3～13 min 中流動相 A 將達到 70%，13～18 min內(nèi)下降至 50%，18～23 min 內(nèi)可以維持 50%，23～24 min 內(nèi)恢復(fù)至 95%，24～32 min 內(nèi)可以維持 95%。在質(zhì)譜分析階段，需要將儀器設(shè)置為負(fù)離子模式，離子源電壓為 4 500 V，溫度為 500℃，在450～950 Da 范圍內(nèi)進行脂質(zhì)分子掃描，子離子掃描碰撞能可以達到30 V，儀器去簇電壓達到60 V，聚焦電勢200 V，去簇電勢10 V。質(zhì)譜分析的2 個氣源分別為50 psi 和60 psi，氣簾氣為 25 psi。

3.2.3 數(shù)據(jù)處理

在數(shù)據(jù)處理環(huán)節(jié)，脂質(zhì)組學(xué)需要對食品脂質(zhì)進行綜合表征，因此檢測數(shù)據(jù)擁有多個維度，還要采用降維、去噪等手段完成數(shù)據(jù)處理。在實驗中考慮數(shù)據(jù)處理復(fù)雜性，還要采用分析軟件完成單變量和多變量分析處理。具體來講，就是要將液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)測得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Lipid Search 軟件中完成預(yù)處理，實現(xiàn)峰值提取分析。在此基礎(chǔ)上，可以采用Excel軟件完成數(shù)據(jù)歸一化處理，將篩選得到的數(shù)據(jù)輸入SIMCA 軟件中完成多元統(tǒng)計和主成分分析，利用軟件提供的最小二乘法進行鑒別分析。采用SPSS 軟件展開統(tǒng)計分析，能夠完成數(shù)據(jù)t 檢驗，根據(jù)P 是否小于0.05 確定檢測分析結(jié)果的差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.3 脂質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果

3.3.1 檢測條件優(yōu)化分析

在液相色譜分析過程中，采用電噴霧電離源對樣品進行分離提取，可以將離子進行氣化，促使其進入氣相，使離子生成率得到提高的同時，提高檢測技術(shù)的靈敏度[4]。針對可以接受質(zhì)子的待測組分，也可以根據(jù)溶液化學(xué)原理添加甲酸或乙酸極性溶劑完成流動相制作，促使組分以離子狀態(tài)接受檢測[5]。在實際操作過程中，可以將 PC、PE、PI、PS 標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)作樣品進樣，在流動相中添加不同量的甲酸和乙酸，完成最佳流動相的篩選。從液相色譜分離度來看，磷脂標(biāo)準(zhǔn)品未能得到較好分離，在10～15 min 保留區(qū)存在峰值重疊效應(yīng)，將給PC 分離帶來嚴(yán)重干擾，在PS 豐度較低的情況下，整體基線發(fā)生了明顯變動。采用上述方法進行流動相優(yōu)化，可以在流動相A 和流動相B中添加0.1%甲酸，并在后者中按照20 mmol/L劑量添加甲酸銨，使各色譜峰維持較高分離度，有助于定性定量分析工作的開展。

3.3.2 脂質(zhì)組分分析結(jié)果

樣品液相色譜柱圖詳見圖1。與標(biāo)準(zhǔn)品色譜柱進行比較，能夠確定樣品中的脂質(zhì)組分種類。在對標(biāo)準(zhǔn)品進行檢測時，PC、PE、PI、PS 色譜柱中分別在10.4 min、11.3 min、17.5 min 和 18.6 min 出現(xiàn)峰值，因此，圖1 中對應(yīng)峰值出現(xiàn)時間約為9.5 min 的是PC，10.96 min、16.10 min 和 18.03 min 3 個時間點對應(yīng)的磷脂種類分別為PE、PI 和PS。

圖1 樣品液相色譜柱圖

從質(zhì)譜分析結(jié)果來看，PC 類脂質(zhì)組分在782～865、805、837、851 m/z 范圍內(nèi)集中呈現(xiàn)較大豐度，根據(jù)脂質(zhì)分子種類對選定脂肪酸鏈碎片的磷脂進行獲取，通過數(shù)據(jù)處理分析能夠完成分子含量測定，共分析得到17 種PC 分子。

采用相同的分析方法，能夠得到的PE、PI、PS分子分別為10 種、9 種和11種，并完成不同分子含量測定。為確定檢測方法的結(jié)果是否具有穩(wěn)定性，需要選擇1 組平行樣品和1 份質(zhì)量控制樣品，加強高低豐度磷脂分子檢測結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差計算（表1）。由表1 可知，檢測得到的分子含量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過7.2%，說明此方法能得到準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)分析結(jié)果，并且結(jié)果可重復(fù)，因此，采用液相色譜-質(zhì)譜檢測方法進行食品脂質(zhì)組學(xué)分析具有較高精密度。

表1 魷魚內(nèi)臟磷脂組分含量檢測相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（單位：%）

4 結(jié)論

綜上所述，在食品脂質(zhì)組學(xué)研究方面，液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)能夠用于實現(xiàn)各種食品檢測分析，為食品質(zhì)量安全管理提供依據(jù)；而在水產(chǎn)品等小眾食品檢測方面，通過液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)測能夠完成磷脂組分準(zhǔn)確測定，含量檢測結(jié)果相對偏差不超過7.2%，能夠為食品營養(yǎng)品質(zhì)研究等各項工作的開展提供支撐。