楊凌君，蘇銀燕，趙奕敏，王琤韡

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330013）

藜蒿，又名艾蒿、蔞蒿、蘆蒿等，為菊科屬多年生草本植物，以根莖和嫩莖供食用，營養(yǎng)豐富，可涼拌或炒食，作為鄱陽湖一種特色時(shí)令蔬菜，深受大家喜歡。研究表明，被丟棄的藜蒿葉和老莖中含有豐富的黃酮類化合物和活性多糖等天然活性成分，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗突變、抗衰老等廣泛的藥理作用[1-3]。黃酮類化合物的提取方法主要有熱水浸提、醇法提取、微波輔助提取以及超聲輔助提取等[4]。由于醇法提取具有過程簡單，研究成本低，利用率高等優(yōu)點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)選取醇法提取鄱陽湖野生藜蒿葉中的黃酮類化合物，通過實(shí)驗(yàn)找出黃酮類化合物醇法提取的最佳工藝條件，為藜蒿葉中黃酮類化合物的高效提取提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、儀器

野生藜蒿葉采摘自鄱陽湖，經(jīng)挑選、分類、洗凈瀝干，低溫烘干至恒重，超微粉碎后過80目篩；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購買于合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。

無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、蒸餾水等所有試劑均為分析純，購買于西隴科學(xué)股份有限公司。

電子天平（ES2000），天津市德安特傳感技術(shù)有限公司；電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（DHG-9015A），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DK-S26），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；722N可見分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；回流裝置。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)液的制備

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液（準(zhǔn)確稱取0.010g蘆丁置于50mL容量瓶中，以60%乙醇溶解定容，取25mL定容后的溶液用蒸餾水稀釋至50mL，即蘆丁濃度為0.1mg/mL）。制備過程：準(zhǔn)備7 支有編號(hào)標(biāo)簽的25mL的試管（0、1、2、3、4、5、6號(hào)），準(zhǔn)確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、1、2、3、4、5、6mL分別加入試管中，向每支試管中加入30%乙醇溶液5mL、5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min后再加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置6min，最后加入4%氫氧化鈉溶液4mL，用蒸餾水稀釋至25mL，放置25min 后在紫外分光光度計(jì)上設(shè)定波長510nm 處測(cè)定各試管中溶液的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。蘆丁濃度與吸光度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.9982，線性回歸方程y=0.011x+0.0027，滿足測(cè)定要求。

1.2.2 藜蒿葉總黃酮的制備

將新鮮摘的藜蒿取葉洗凈在鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)60℃下烘干至恒重，超微粉碎后過80目篩得到樣品粉末。準(zhǔn)確稱取經(jīng)處理后的藜蒿葉樣品粉末1.000g 置于25mL 圓底燒瓶中，加入一定體積的70%乙醇溶液浸泡1h后，放入一定溫度恒溫水浴鍋中回流提取一定時(shí)間后，得到的提取液用濾紙過濾定容至25mL 作為樣品液備用。制備過程：準(zhǔn)備1支25mL的試管，準(zhǔn)確量取樣品液1mL加入試管中，向試管中加入30%乙醇溶液5mL、5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min后再加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置6min，最后加入4%氫氧化鈉溶液4mL，用蒸餾水稀釋至25mL，放置25min后在紫外分光光度計(jì)上設(shè)定波長510nm處測(cè)定試管中溶液的吸光度。利用線性回歸方程計(jì)算藜蒿葉中總黃酮得提取率（其中每組實(shí)驗(yàn)均做3 組重復(fù)，下列表中總黃酮得率所代表的數(shù)值為3個(gè)重復(fù)組的平均數(shù)）。計(jì)算公式：

m1=xV×稀釋倍數(shù)

藜蒿葉總黃酮提取率=m1/m2×100%

式中，y 為吸光度；x 為濃度；m1為黃酮的質(zhì)量；m2為藜蒿葉樣品粉末的質(zhì)量；V為最初定容的體積。

1.2.3 藜蒿葉總黃酮提取率的影響

1.2.3.1 單因素對(duì)藜蒿葉總黃酮提取率的影響

單因素實(shí)驗(yàn)中以藜蒿葉粉末質(zhì)量（1g）不變的情況下，設(shè)置各元素之間變量與不變量的關(guān)系，進(jìn)行研究分析不同變量對(duì)藜蒿葉總黃酮提取率的影響。設(shè)提取溫度70℃、提取時(shí)間1.5h為不變量，研究分析不同液固比（5、10、15、20、25mL/g）對(duì)藜蒿葉總黃酮提取率的影響；設(shè)液固比20mL/g、提取時(shí)間1.5h為不變量，研究分析不同提取溫度（40、50、60、70、80℃）對(duì)藜蒿葉總黃酮提取率的影響；設(shè)液固比20mL/g、提取溫度70℃為不變量，研究分析不同提取時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5h）對(duì)藜蒿葉總黃酮提取率的影響。

1.2.3.2 藜蒿葉總黃酮提取工藝正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以液固比、提取溫度、提取時(shí)間3個(gè)選項(xiàng)進(jìn)行L9（33）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定3個(gè)不同提取水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)見表1）。通過正交實(shí)驗(yàn)確定藜蒿葉總黃酮提取的最佳工藝組合。

表1 提取藜蒿葉總黃酮的正交實(shí)驗(yàn)

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)輸入，用Spss18.0軟件處理數(shù)據(jù)并進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

不同因素及不同提取水平下藜蒿葉中總黃酮提取率見表2。由表2 可知總黃酮提取率隨著液固比、提取溫度和提取時(shí)間的增加均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中在液固比為10mL/g時(shí)總黃酮提取率出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），而總黃酮提取率受提取溫度和提取時(shí)間的影響較小，組間差異不顯著（P＞0.05）。在液固比為20mL/g 時(shí)總黃酮提取率最高為3.031%，提取溫度為70℃時(shí)總黃酮提取率最高為2.901%，提取時(shí)間為1.5h時(shí)總黃酮提取率最高為2.786%。

表2 不同因素及不同提取水平下藜蒿葉總黃酮提取率

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)方案以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知藜蒿葉總黃酮提取的最佳提取組合為A2B1C2。由表3 中R 值可知藜蒿葉總黃酮提取率的影響大小因素依次是A＞B＞C，即液固比大于提取溫度大于提取時(shí)間。在表3中提取率最高的組合為A2B1C2，提取率為3.960%即液固比15mL/g、提取溫度60℃、提取時(shí)間1.5h。在表3 中由K 值可知藜蒿葉總黃酮的最佳提取工藝組合為A2B1C2。

表3 藜蒿葉總黃酮測(cè)定的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

藜蒿葉中總黃酮提取的方差分析結(jié)果見表4。由表4中F值可知FA＞FB＞FC，F(xiàn)值的大小可以判斷出各因素對(duì)藜蒿葉總黃酮提取率的影響大小，由結(jié)果可知每個(gè)因素對(duì)提取率的影響都不同，影響大小依次是液固比、提取溫度、提取時(shí)間，其中液固比對(duì)藜蒿葉中總黃酮提取率的影響顯著。

表4 藜蒿葉中總黃酮提取的方差分析結(jié)果

3 討論

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)藜蒿葉總黃酮提取率的影響

3.1.1 液固比對(duì)藜蒿葉總黃酮提取率的影響

以液固比為變量（5、10、15、20、25mL/g），而其他條件均為固定量（提取溫度70℃，提取時(shí)間為1.5h）進(jìn)行總黃酮提取的單因素實(shí)驗(yàn)（見圖1）。由圖1可以看出液固比在5～20mL/g時(shí)，藜蒿葉中總黃酮的提取率逐漸升高?？赡茉蚴钱?dāng)液固比較低時(shí)液體量不足，不能充分浸泡藜蒿葉粉末，導(dǎo)致總黃酮的提取不完全；當(dāng)繼續(xù)增大液體量時(shí)，提取已較為完全，變化趨勢(shì)波動(dòng)不大；當(dāng)液固比太大時(shí)，溶劑用量大，體系升溫速率變慢從而影響提取效果使得提取率降低。所以液固比在20mL/g時(shí)總黃酮的提取率最高為3.031%。

圖1 液固比對(duì)藜蒿葉總黃酮提取的影響

3.1.2 提取溫度對(duì)藜蒿葉總黃酮提取率的影響

以提取溫度為變量（40、50、60、70、80℃），而其他條件均為固定量（液固比20mL/g，提取時(shí)間為1.5h）進(jìn)行總黃酮提取的單因素實(shí)驗(yàn)（見圖2）。由圖2 可以看出提取溫度在40～70℃時(shí)藜蒿葉總黃酮的提取率不斷增高?？赡茉蚴菧囟壬撸肿舆\(yùn)動(dòng)劇烈，加快了總黃酮的溶出，增大了提取率；溫度過高時(shí)，由于黃酮類化合物有一定的熱敏性導(dǎo)致其分子結(jié)構(gòu)被破壞而分解，使得提取率下降。所以提取溫度在70℃時(shí)總黃酮的提取率最高為2.901%。

圖2 提取溫度對(duì)藜蒿葉總黃酮提取的影響

3.1.3 提取時(shí)間對(duì)藜蒿葉總黃酮提取率的影響

以提取時(shí)間為變量（0.5、1、1.5、2、2.5h），而其他條件均為固定量（液固比20mL/g，提取溫度為70℃）進(jìn)行總黃酮提取的單因素實(shí)驗(yàn)（見圖3）。由圖3可以看出提取時(shí)間在0.5～1.5h時(shí)藜蒿葉總黃酮的提取率不斷增高?？赡茉蚴翘崛r(shí)間過短，總黃酮不能充分溶出致使提取率較低；提取時(shí)間過長時(shí)，總黃酮受熱時(shí)間長，其中主要成分部分發(fā)生熱分解損失，造成提取率的下降。所以提取溫度在1.5h時(shí)總黃酮的提取率最高為2.786%。

圖3 提取時(shí)間對(duì)藜蒿葉總黃酮提取的影響

3.2 正交實(shí)驗(yàn)對(duì)藜蒿葉總黃酮提取率的影響

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知藜蒿葉中提取總黃酮的最佳提取條件是液固比15mL/g、提取溫度60℃、提取時(shí)間1.5h，而單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果中顯示當(dāng)液固比為變量時(shí)，液固比為20mL/g總黃酮提取率最大；提取溫度為變量時(shí)，提取溫度為70℃總黃酮提取率最大；提取時(shí)間為變量時(shí)，提取時(shí)間為1.5h 總黃酮提取率最大。經(jīng)過兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比，發(fā)現(xiàn)單因素實(shí)驗(yàn)最佳提取條件與正交實(shí)驗(yàn)最佳提取條件不完全符合，可能原因是針對(duì)藜蒿葉中提取總黃酮而言不同因素之間存在相互影響作用。

4 結(jié)論

藜蒿作為大家喜愛的一種鄱陽湖特色時(shí)令蔬菜，主要食用其莖，而葉被丟棄造成一種浪費(fèi)，所以本實(shí)驗(yàn)通過乙醇回流法對(duì)藜蒿葉中總黃酮進(jìn)行提取并研究探討了提取工藝的優(yōu)化。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得在液固比15mL/g、提取溫度60℃、提取時(shí)間1.5h 的條件下藜蒿葉中總黃酮得率最高為3.960%，且液固比對(duì)藜蒿葉中總黃酮提取率有顯著影響。