賀琤雯，薛 苗，姚文杰，魯 瓊

(海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，上海 200433)

丙型肝炎病毒(HCV)是一種嗜肝RNA病毒。慢性HCV感染可導(dǎo)致肝細(xì)胞自身免疫性抗原表位暴露而誘發(fā)自身免疫系統(tǒng)疾病。自首次在自身免疫性肝炎患者血清中檢出HCV特異性抗體以來(lái)，HCV感染與自身免疫的關(guān)系越來(lái)越受到臨床關(guān)注[1]。同時(shí)，長(zhǎng)期存在的自身免疫功能紊亂可能是誘發(fā)肝細(xì)胞惡變的原因之一。有文獻(xiàn)報(bào)道，70%以上HCV感染者可出現(xiàn)自身抗體，包括抗核抗體(ANA)、胰島素相關(guān)抗體、甲狀腺過氧化物酶抗體等[2-3]。然而，HCV感染者抗核抗體譜(LIA-ANAs)的表達(dá)鮮有報(bào)道。本研究通過回顧性分析臨床確診的慢性丙型肝炎患者LIA-ANAs的分布及其與性別、年齡、HCV-RNA載量、肝臟功能等的關(guān)系，旨在探討慢性丙型肝炎患者出現(xiàn)自身抗體的臨床意義，為進(jìn)一步診斷、治療及預(yù)后判斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 根據(jù)臨床診療結(jié)果及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行回顧性分析。選取2018年3—7月海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院感染科門診和住院收治的慢性丙型肝炎患者血清標(biāo)本81例作為慢性丙型肝炎組，其中男性48例(59.3%)，女性33例(40.7%)；年齡24～86歲，平均(51.4±10.6)歲。同時(shí)選取81例體檢健康者作為健康對(duì)照組，其中男性45例(55.6%)，女性36例(44.4%)；年齡24～86歲，平均(52.1±11.3)歲。2組在性別、年齡上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2病例納入、排除標(biāo)準(zhǔn) 所有慢性丙型肝炎病例的臨床診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)2015版《丙型肝炎防治指南》的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[4]，即HCV感染超過6個(gè)月，或有6個(gè)月以前的流行病學(xué)史；HCV抗體(抗-HCV)及HCV-RNA陽(yáng)性，肝臟病理學(xué)檢查符合慢性肝炎。排除其他病毒性肝炎、藥物性肝炎及自身免疫性疾病。

1.3儀器與試劑 北京科美生物技術(shù)有限公司提供的CHEMCLIN 1500全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀、EUROStar Ⅱ熒光顯微鏡、EUROBlotMaster 44半自動(dòng)免疫印跡儀、EUROLINEScan掃描儀、日立7600型全自動(dòng)生化分析儀、羅氏Cobas 4800熒光定量PCR儀?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑采用北京科美生物技術(shù)有限公司HCV-IgG化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒(試劑盒批號(hào)：20180428)。間接免疫熒光法檢測(cè)試劑采用歐蒙(杭州)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司生產(chǎn)的ANA間接免疫熒光試劑盒(試劑盒批號(hào)：CF180506AB)。免疫印跡法檢測(cè)試劑采用歐蒙(杭州)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司生產(chǎn)的LIA-ANAs試劑盒(試劑盒批號(hào)：D180503AA)。生化指標(biāo)檢測(cè)采用上?？迫A生物工程公司生產(chǎn)的相應(yīng)試劑盒。HCV-RNA定量檢測(cè)采用上?？迫A生物有限公司提供的HCV-RNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(試劑盒批號(hào)：18022511)。

1.4方法

1.4.1樣本采集與保存 符合上述標(biāo)準(zhǔn)的人群采用真空采血管按常規(guī)采血步驟采清晨空腹靜脈血3 mL，1 h內(nèi)以3 000 r/min離心分離血清并檢測(cè)。未能及時(shí)檢測(cè)的樣本分離血清后-20 ℃保存，7 d內(nèi)檢測(cè)完畢。

1.4.2HCV-IgG檢測(cè) 采用北京科美生物技術(shù)有限公司HCV-IgG化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，操作完全按照試劑和儀器說(shuō)明書進(jìn)行，信號(hào)/陰性對(duì)照比值(S/Co)≥1為陽(yáng)性。HCV-IgG質(zhì)控品由上海市臨床檢驗(yàn)中心提供，HCV-IgG化學(xué)發(fā)光法室內(nèi)質(zhì)控批號(hào)：1801、1802。

1.4.3免疫印跡法檢測(cè)LIA-ANAs 該試劑膜條可同時(shí)檢測(cè)以下15種自身抗體：nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、著絲點(diǎn)蛋白B(CENP B)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、雙鏈DNA(ds-DNA)、核小體、組蛋白、核糖體P蛋白(rRNP)、線粒體-M2(AMA-M2)的抗體。其中CENP B、PM-Scl、Ro-52、PCNA為重組抗原，其余均為經(jīng)親和層析純化的天然抗原。待檢血清1∶100倍稀釋后進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。靶抗原部位出現(xiàn)棕色條帶，即為該自身抗體陽(yáng)性。

1.4.4ANA檢測(cè) 采用德國(guó)歐蒙公司提供的ANA間接免疫熒光法檢測(cè)。待檢血清樣本1∶100倍稀釋后進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。每次試驗(yàn)均設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照。在EUROStar Ⅱ熒光顯微鏡下觀察熒光模式和熒光強(qiáng)度。ANA≥1∶100為陽(yáng)性。

1.4.5HCV-RNA檢測(cè) 采用上?？迫A生物有限公司提供HCV-RNA熒光定量PCR儀檢測(cè)，HCV-RNA 檢出限為1×103copies/mL。所有操作步驟均嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。HCV-IgG質(zhì)控品由上海市臨床檢驗(yàn)中心提供(HCV-RNA質(zhì)控品批號(hào)：1801、1802)。

1.4.6丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)檢測(cè) 采用速率法，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上?？迫A生物工程公司，儀器為日立7600型全自動(dòng)生化分析儀。

2 結(jié) 果

2.1LIA-ANAs在慢性丙型肝炎患者血清中的檢出情況 在81例慢性丙型肝炎患者標(biāo)本中，共檢出LIA-ANAs陽(yáng)性37例(45.68%)，陽(yáng)性率顯著高于健康對(duì)照組4.94%(4/81)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=33.300，P<0.001)。30例患者(37.04%)檢出1種自身抗體，占LIA-ANAs陽(yáng)性者的81.08%(30/37)；檢出2種自身抗體6例(7.40%)，占LIA-ANAs陽(yáng)性者的16.21%(6/37)；檢出3種自身抗體1例(1.23%),占LIA-ANAs陽(yáng)性者的2.70%(1/37)。81例慢性丙型肝炎患者LIA-ANAs陽(yáng)性和陰性組間年齡(t=0.720,P=0.479)、性別(χ2=0.400,P=0.520)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LIA-ANAs具體檢出情況見表1。

2.2慢性丙型肝炎患者血清ANA的檢出情況 81例慢性丙型肝炎患者血清ANA陽(yáng)性6例，其中均質(zhì)型1例,胞漿型2例,核仁型2例和顆粒型1例,見表2。然而，1例胞漿型和1例核仁型血清未檢出LIA-ANAs。

表1 慢性丙型肝炎患者和健康對(duì)照人群HCV抗體水平及LIA-ANAs表達(dá)

表2 6例ANA陽(yáng)性慢性丙型肝炎患者ANA檢出情況

注：-表示此項(xiàng)未檢出LIA-ANAs。

表3 LIA-ANAs陰性組及陽(yáng)性組年齡、性別、肝功能及HCV-RNA載量的比較

2.3慢性丙型肝炎患者HCV-RNA載量、性別、年齡、肝功能與LIA-ANAs的關(guān)系 81例慢性丙型肝炎患者中57例HCV-RNA<1×103copies/mL，24例HCV-RNA≥1×103copies/mL。LIA-ANAs 陽(yáng)性組和陰性組間HCV-RNA載量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.645,P<0.05)。LIA-ANAs陽(yáng)性組HCV-RNA載量高于陰性組。81例慢性丙型肝炎患者LIA-ANAs陽(yáng)性和陰性組間年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組ALT和AST 的中位數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，LIA-ANAs陽(yáng)性組ALT和AST水平均高于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=595.000、597.500，P=0.038 2、0.040 3)。見表3。

3 討 論

大部分急性丙型肝炎患者會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)槁圆《靖腥荆磸?fù)慢性炎癥的作用導(dǎo)致肝纖維化，并引起機(jī)體內(nèi)環(huán)境的紊亂，最終發(fā)展成為肝硬化，甚至肝細(xì)胞癌。近些年的研究表明，HCV 感染參與了自身免疫和免疫耐受平衡的破壞，促使致病性自身抗體的產(chǎn)生，從而引發(fā)自身免疫反應(yīng)，肝臟組織纖維化的發(fā)生、發(fā)展與此密切相關(guān)[1]。在HCV感染者中已經(jīng)揭示了一些與肝臟慢性感染相關(guān)的肝外表現(xiàn)，其中大多數(shù)可以通過免疫學(xué)機(jī)制介導(dǎo)，而不與肝外組織的直接感染有關(guān)，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、甲狀腺功能紊亂及自身免疫性肝病[5-7]。目前的研究報(bào)道對(duì)慢性丙型肝炎患者體內(nèi)自身抗體與年齡、性別、肝功能及病毒載量等因素的相關(guān)性觀點(diǎn)不一致[8-10]。大部分的研究主要集中在丙型肝炎與ANA、平滑肌抗體的相關(guān)性研究[11-12]，與LIA-ANAs的相關(guān)性研究較少見。

本研究發(fā)現(xiàn)，在81例慢性丙型肝炎患者中共37例檢出LIA-ANAs，陽(yáng)性率為45.68%，與AMICO等[12]的報(bào)道比較一致；且顯著高于健康對(duì)照人群。在LIA-ANAs陽(yáng)性慢性丙型肝炎患者中絕大部分(81.08%)僅檢出1種自身抗體；檢出2種自身抗體的僅占16.21%；檢出3種自身抗體的比例則更低。然而，81例慢性丙型肝炎患者中ANA陽(yáng)性僅6例(7.4%)，與LIA-ANAs 45.67%的檢出率明顯不符，可能與ANA間接免疫熒光法檢測(cè)的靈敏度較低有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)1例ANA胞漿型和1例核仁型患者血清均未檢出LIA-ANAs，這是否表明本研究所使用的15種LIA-ANAs尚不足以覆蓋慢性丙型肝炎患者體內(nèi)產(chǎn)生的ANA種類？需要進(jìn)一步擴(kuò)大病例數(shù)來(lái)驗(yàn)證。

在所有檢出的LIA-ANAs中Ro-52檢出率最高，在37例LIA-ANAs陽(yáng)性患者中檢出Ro-52抗體有24例，比例高達(dá)64.86%。Ro-52是TRIM蛋白家族成員，在機(jī)體抗病原微生物等感染的固有免疫中起重要的調(diào)節(jié)作用；在細(xì)胞內(nèi)可與多種分子相互作用，在核內(nèi)可與DNA相互作用，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能[13-14]。當(dāng)免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)某些環(huán)節(jié)出現(xiàn)紊亂，表現(xiàn)出免疫自穩(wěn)機(jī)制破壞，使Ro-52存在的微環(huán)境失衡，從而導(dǎo)致多種自身免疫性疾病發(fā)生，如干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎等[15-16]。有研究分析了10年內(nèi)北美地區(qū)Ⅰ型自身免疫性肝炎患者的流行病學(xué)資料發(fā)現(xiàn)，患者Ro-52抗體的陽(yáng)性率高達(dá)37.3%[17]。在自身免疫性肝病中Ro-52抗體是患者出現(xiàn)肝損傷的原因還是結(jié)果，目前仍存在爭(zhēng)議。這些出現(xiàn)Ro-52抗體的丙型肝炎患者是否會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的肝損傷？需要后續(xù)積累更多的病例加以分析。

慢性丙型肝炎患者自身抗體的出現(xiàn)，是否與病毒載量存在相關(guān)性，這對(duì)于患者的診斷和治療均較為重要。通過本研究分析發(fā)現(xiàn)慢性丙型肝炎患者中LIA-ANAs陽(yáng)性者HCV-RNA載量明顯高于陰性者，可能是HCV 感染可導(dǎo)致肝細(xì)胞膜通透性增加或細(xì)胞膜抗原成分發(fā)生變異，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生自身抗體所致[18]。這些自身抗體的存在是否誘發(fā)了機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)肝細(xì)胞的免疫損傷或出現(xiàn)自身免疫和病毒感染破壞的疊加損傷？本研究發(fā)現(xiàn)慢性丙型肝炎LIA-ANAs陽(yáng)性者血清ALT和AST水平高于參考區(qū)間的比例明顯高于陰性者，提示LIA-ANAs存在可能是引起肝臟組織損害的一個(gè)重要因素，也是導(dǎo)致肝外病理表現(xiàn)的原因。

4 結(jié) 論

在臨床上自身免疫性肝病與慢性丙型肝炎在治療原則上截然不同，如不恰當(dāng)?shù)厥褂酶蓴_素治療可使自身免疫性疾病病情惡化，而盲目地應(yīng)用免疫抑制劑又可加重患者的病毒血癥。因此，如何正確判斷是合并HCV感染的自身免疫性肝病，還是伴有自身免疫現(xiàn)象的慢性丙型肝炎，這對(duì)于疾病的診斷和鑒別診斷、患者的治療方向等有著極其重要的臨床意義。對(duì)慢性丙型肝炎患者血清進(jìn)行LIA-ANAs的檢測(cè)，將有助于滿足臨床診治的需求。