葉恒平，張雅婷，袁 敏，邢學(xué)森，呂 靜，何 飛，周海健，李國明，楊紅梅△

(1.仙桃市疾病預(yù)防控制中心，湖北仙桃 433000；2.湖北省疾病預(yù)防控制中心，湖北武漢 430079；3.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京 100026)

傷寒沙門菌引起的傷寒是常見的消化道傳染病，目前仍是重要的公共衛(wèi)生問題[1]，主要通過糞-口傳播。食用受污染的水產(chǎn)品，飲用未煮沸的水或消毒不徹底的牛奶，生食瓜果蔬菜等均有可能導(dǎo)致該菌的傳播，人口流動(dòng)、個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣、地方飲食風(fēng)俗、環(huán)境衛(wèi)生、食品衛(wèi)生、水源管理、糞便管理、經(jīng)濟(jì)條件及居住環(huán)境等對(duì)傷寒沙門菌流行起著重要的作用，由于慢性帶菌者持續(xù)存在，傳播途徑不易徹底切斷[2]。仙桃市是湖北省的傷寒高發(fā)區(qū)，每年發(fā)病率在全省排名位列前3位。2013年仙桃市某高校出現(xiàn)了傷寒暴發(fā)，暴發(fā)后在學(xué)校及周邊部分區(qū)域開展重點(diǎn)人群傷寒Vi多糖疫苗應(yīng)急接種，但由于傷寒沙門菌莢膜多糖(Vi抗原)疫苗人工免疫效果欠佳，散發(fā)病例在仙桃市仍時(shí)有出現(xiàn)。為了解仙桃市傷寒沙門菌耐藥性和分子分型特征，本研究通過對(duì)2014—2018年仙桃市腸道門診監(jiān)測(cè)系統(tǒng)收集并分離的傷寒沙門菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分型及多位點(diǎn)序列分型(MLST)研究，對(duì)該地區(qū)的傷寒防控有重要意義。

1 材料與方法

1.1菌株來源 菌株來源于2014—2018年仙桃市傷寒患者血液或糞便樣本中分離的29株傷寒沙門菌。藥敏質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922和PFGE的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參考菌株H9812均由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 CHEF MAPPER PFGE儀(美國Bio-Rad公司)，凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)，VitekⅡ全自動(dòng)生化分析儀(法國梅里埃公司)，Vitek比濁儀(法國梅里埃公司)，PCR儀(美國Bio-Rad公司)，熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)，隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海齊欣)，去離子水系統(tǒng)(美國Milipore公司)，APLUS震蕩恒溫水槽(美國APLUS實(shí)驗(yàn)室通用儀器公司)，DK-8D電熱恒溫水槽(上海齊欣儀器公司)，TU-100C恒溫金屬浴(上海一恒儀器公司)，5424R 臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，AIM自動(dòng)接種系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司)。

1.2.2試劑 沙門顯色培養(yǎng)基(中國科瑪嘉公司)，VITEK革蘭陰性細(xì)菌鑒定卡(法國梅里埃公司)，沙門菌診斷血清(丹麥SSI公司)，革蘭陰性需氧菌藥敏檢測(cè)板(美國Thermo Fisher公司，型號(hào)CHN1GOV、CHN2GOV)，Xba Ⅰ酶、100 bp DNA Ladder[寶生物工程(大連)有限公司]，SeaKemGold Agarose瓊脂糖(美國Cambrex公司)，蛋白酶K(美國Sigma公司)，十二烷基肌氨酸鈉(美國Sigma公司)，Tris-HCl、乙二胺四乙酸、5×TBE(北京索萊寶科技有限公司)。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3方法

1.3.1菌株復(fù)核 將菌株復(fù)蘇后接種至沙門顯色培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單個(gè)紫色菌落按照Vitek革蘭陰性細(xì)菌鑒定卡使用說明書進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)。生化復(fù)核后，進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)[3]。

1.3.2PFGE分型 參考文獻(xiàn)[4-6]，選用XbaⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株和H9812進(jìn)行酶切(37 ℃，3 h)。電泳參數(shù)：初始脈沖2.16 s，最終脈沖63.8 s，電壓6 V/cm，電場(chǎng)夾角120°，電泳溫度14 ℃，電泳時(shí)間19 h。電泳結(jié)束后，進(jìn)行染色、脫色，再采用凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。PFGE圖像導(dǎo)入Bio Numerics 7.6軟件，設(shè)置Dice相關(guān)系數(shù)為1.5%，選擇非加權(quán)組平均法(UPGMA)，設(shè)置條帶位置差異容許度為1.5%，進(jìn)行聚類分析。分型判別標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[7]，相似度100%認(rèn)定為同一PFGE帶型。

1.3.3MLST分析 挑取傷寒沙門菌單個(gè)菌落接種營養(yǎng)肉湯，37 ℃生長過夜后取1.5 mL菌液8 000 r/min離心10 min，去上清后沉淀復(fù)懸于1.0 mL無菌超純水中，100 ℃金屬浴10 min，13 200 r/min離心10 min，留取上清液作為PCR模板。利用擴(kuò)增引物及條件(94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min)分別擴(kuò)增7個(gè)管家基因片段(thrA、purE、sucA、hisD、aroC、hemD、dnaN)后進(jìn)行測(cè)序[8]。管家基因位點(diǎn)選擇參見愛爾蘭科克大學(xué)(University College Cork,Ireland)MLST網(wǎng)站(http://mlst.ucc.ie)，擴(kuò)增及測(cè)序引物參見http://mlst.ucc.ie/mlst/dbs/Senterica/documents/primersEnterica_html。

1.3.4藥敏試驗(yàn) 采用微量肉湯稀釋法對(duì)最低抑菌濃度(MIC值)進(jìn)行測(cè)定。將傷寒沙門菌轉(zhuǎn)種腦心浸液瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)16 h后混懸于0.85%生理鹽水中制成0.5麥?zhǔn)蠁挝粦乙?，采用自?dòng)接種系統(tǒng)接種至藥敏檢測(cè)微孔板中，藥物包含氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、四環(huán)素、氯霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑、頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢西丁、慶大霉素、亞胺培南、萘啶酸、阿奇霉素、磺胺異噁唑、環(huán)丙沙星、阿莫西林/克拉維酸、多黏菌素E、多黏菌素B、米諾環(huán)素、阿米卡星、氨曲南、頭孢吡肟、美羅培南、左氧氟沙星、卡那霉素、鏈霉素，同時(shí)大腸埃希菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌株。依據(jù)藥敏檢測(cè)板說明書進(jìn)行操作，36 ℃孵育培養(yǎng)，18 h后系統(tǒng)依據(jù)微孔板中菌株生長與否判讀MIC值。結(jié)果的判定依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)2019年出版的M100藥敏試驗(yàn)指南進(jìn)行[9]。

1.3.5產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)耐藥基因檢測(cè) 采用煮沸法提取菌株及質(zhì)粒DNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25.0 μL，包含12.5 μL 2×PCR反應(yīng)混合物，純水9.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，模板1.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 40 s、52 ℃ 40 s、72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；75 ℃延伸5 min。blaCTX-M、blaTEM、blaSHV、blaGES、blaPER、blaVEB、blaOXA-1、blaOXA-2、blaOXA-10型基因引物序列及反應(yīng)條件見表1[10-11]，引物序列合成及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行GenBank Blast比對(duì)。

表1 ESBLs耐藥基因PCR引物及序列

圖1 傷寒沙門菌PFGE圖譜和相關(guān)信息

2 結(jié) 果

2.1菌株復(fù)核結(jié)果 29株菌經(jīng)生化及血清復(fù)核后均為傷寒沙門菌。其中27份菌株來源于患者血液，2份菌株來源于患者糞便。29株菌中2014年5株，2015年2株，2017年14株，2018年8株。病例年齡10～79歲，其中11～20歲占27.6%(8/29)，其次為21～30歲及41～50歲，均占17.2%(5/29)，其他年齡組分布依次為31～40歲占13.8%(4/29)，51～60占10.34%(3/29)，61～70歲占6.9%(2/29)，70歲以上占6.9%(2/29)。男、女性別比為0.61:1(11/18)，以女性為主。見圖1。

2.2分子分型結(jié)果 29株傷寒沙門菌經(jīng)Xba Ⅰ酶切PFGE電泳后，根據(jù)電泳條帶的不同，29株傷寒沙門菌可分為6個(gè)型別(HuBXTSal001～HuBXTSal006)，其中HuBXTSal003型包含24株菌，為優(yōu)勢(shì)帶型。其余5種帶型分別只包含1株菌。HuBXTSal004、HuBXTSal005、HuBXTSal006與HuBXTSal003相比分別只有4條帶的差異。將這24株HuBXTSal003型圖譜與仙桃市疾病預(yù)防控制中心所保存的2013年仙桃傷寒暴發(fā)疫情[12]中所分離到的菌株P(guān)FGE圖譜進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這24株菌與2013年暴發(fā)菌株帶型一致，均為HuBXTSal003帶型。29株傷寒沙門菌MLST分型分為2個(gè)ST型。27株血液分離菌株為ST2型(等位基因譜為1-1-2-1-1-1-5)；2株糞便來源菌株為ST19型(等位基因譜為10-7-12-9-5-9-2)。見圖1。對(duì)患者來源地點(diǎn)進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)，患者主要來自于干河街道(8例，27.5%)、龍華山街道(5例，17.2%)及沙嘴街道(5例，17.2%)，在空間上較為集中。

2.3藥敏試驗(yàn)結(jié)果 29株傷寒沙門菌中分離自血液的27株菌對(duì)26種抗菌藥物均為敏感/中度敏感；分離自糞便的有2株菌對(duì)抗菌藥物有不同程度的耐藥性，見表2。分離自糞便的有2株菌株，菌株號(hào)為HB-2015-SAL-02的菌株對(duì)氨芐西林及四環(huán)素耐藥，菌株號(hào)為HB-2014-SAL-01的菌株耐藥譜分布較廣，耐藥藥物名稱為AMP-A/S2-TET-CHL-STX-FAZ-FOT-TAZ-FOX-AZI- FIS-CIP-AUG-MIN-AZT-KAN-STR。將這2種耐藥菌株送至國家疾病預(yù)防控制中心采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)一步確認(rèn)，結(jié)果均一致。與分離自血液的菌株耐藥結(jié)果相比，糞便來源的菌株耐藥譜分布較廣，且出現(xiàn)了1株多重耐藥菌株。

表2 29株傷寒沙門菌抗菌藥物耐藥情況[n(%)]

續(xù)表2 29株傷寒沙門菌抗菌藥物耐藥情況[n(%)]

2.4ESBLs細(xì)菌耐藥基因檢測(cè) 選取對(duì)氨芐西林和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑均耐藥的菌株HB-2014-SAL-01,對(duì)其進(jìn)行blaCTX-M、blaTEM、blaSHV、blaGES、blaPER、blaVEB、blaOXA-1、blaOXA-2、blaOXA-10 9種ESBLs基因檢測(cè)，電泳結(jié)果見圖2，僅有blaOXA-1擴(kuò)增產(chǎn)物符合目的產(chǎn)物大小，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證為blaOXA-1。

注：泳道1為分子標(biāo)志物，泳道2～10依次為blaCTX-M、blaTEM、blaSHV、blaGES、blaPER、blaVEB、blaOXA-1、blaOXA-2、blaOXA-10擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道11為陰性對(duì)照。

圖2 耐藥基因檢測(cè)電泳結(jié)果

3 討 論

2010—2015年全國傷寒發(fā)病率約為0.65/10萬[13-14]，湖北省不屬于傷寒高發(fā)區(qū)域，仙桃地區(qū)除2013年仙桃市某學(xué)校暴發(fā)傷寒疫情至今，發(fā)病率也基本控制在0.01/10萬至0.93/10萬，處于相對(duì)平穩(wěn)且無暴發(fā)流行的狀態(tài)，流行趨勢(shì)以高度散發(fā)為主[12]。本研究中傷寒病例年齡在10～79歲，男、女性別比為0.61∶1，發(fā)病時(shí)間集中于夏秋季，體現(xiàn)了仙桃市近年來傷寒流行病學(xué)的基本特點(diǎn)和變化趨勢(shì)。對(duì)仙桃市傷寒沙門菌流行菌株開展藥敏監(jiān)測(cè)和分子分型分析，可指導(dǎo)臨床用藥和特殊人群的預(yù)防性服藥，在疫情防控中確定病原菌特征、分析傳播途徑、追溯傳染源、研究菌株之間的親緣性等方面具有重要作用。

PFGE是大多數(shù)細(xì)菌病原體分子分型的金標(biāo)準(zhǔn)，選用全基因組DNA在統(tǒng)一設(shè)定識(shí)別罕見切點(diǎn)的內(nèi)切酶和實(shí)驗(yàn)條件下，以不同相對(duì)分子質(zhì)量的差異作為分離不同分子的依據(jù)。PFGE因費(fèi)用較低、結(jié)果直觀，因而應(yīng)用較廣。其中HuBXTSal003型菌株出現(xiàn)在同一地區(qū)(仙桃市干河街道6株)不同的時(shí)間(4株為2017年菌株，1株為2018年菌株，1株為2014年菌株)，在不同年份(2014年4株，2015年1株，2017年12株，2018年7株)反復(fù)出現(xiàn)反應(yīng)傷寒沙門菌不斷變異中的一種相對(duì)的穩(wěn)定型，提示當(dāng)?shù)匚廴驹闯掷m(xù)存在，可能存在慢性帶菌者群體，特別是2017年的12株與2018年的7株HuBXTSal003型簇聚類可能存在相同來源暴露的傷寒沙門菌潛在暴發(fā)。由于本研究菌株來源于腸道門診監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，均為傷寒患者標(biāo)本分離所得，因此，未能在環(huán)境中揭示出暴露來源，還需結(jié)合流行病進(jìn)一步開展聚集性傷寒病例的溯源工作，找出可能持續(xù)存在的感染源頭。

MLST因其易標(biāo)準(zhǔn)化而被廣泛用于不同地區(qū)不同菌株的比較和生物進(jìn)化研究。MLST分型結(jié)果顯示，29株傷寒沙門菌分為ST2(27株)和ST19(2株)兩個(gè)序列型別，表明仙桃市傷寒沙門菌株存在優(yōu)勢(shì)克隆。官網(wǎng)(http://mlst.ucc.ie)查詢表明，這2種型別傷寒沙門菌在各地均廣泛分布。

仙桃市的傷寒沙門菌耐藥情況與其他地區(qū)不盡相同[15-17]，分離自血液的27株菌對(duì)喹諾酮類的敏感率高達(dá)100%，提示環(huán)丙沙星可作為成人臨床治療傷寒沙門菌感染的首選藥物。同時(shí)，這27株菌對(duì)第3、4代頭孢菌素類抗菌藥物均為敏感，但頭孢菌素類抗菌藥物易引起ESBLs、Ampc酶等一系列多重耐藥菌的產(chǎn)生。隨著臨床中抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，傷寒沙門菌對(duì)抗菌藥物的敏感性逐漸降低，多重耐藥菌株顯著增多[18]，故應(yīng)慎重選擇并加強(qiáng)耐藥監(jiān)測(cè)。

本研究還顯示分離自糞便的菌株耐藥譜分布較廣。本研究采用的藥敏試驗(yàn)為微量肉湯稀釋法進(jìn)行MIC測(cè)定，發(fā)現(xiàn)1株耐藥菌株對(duì)青霉素類、頭孢類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺抑制劑復(fù)合物、單環(huán)內(nèi)酰胺類等抗菌藥物耐藥。但對(duì)該菌進(jìn)行ESBLs耐藥基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)為blaOXA-1，也從分子層面驗(yàn)證了該菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺抑制劑復(fù)合物類藥物耐藥。在本研究發(fā)現(xiàn)的此多耐藥菌株來自較大年齡患者(63歲)，對(duì)3代頭孢菌素已產(chǎn)生了耐藥，僅對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物敏感，有基礎(chǔ)疾病且住院時(shí)間較長，存在院內(nèi)獲得性耐藥可能，也有可能是傷寒沙門菌和患者腸道內(nèi)的某些攜帶耐藥基因的菌株進(jìn)行了基因交換獲得，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)闡明。遺憾的是本研究耐藥病例較少，但隨著研究病例的增多，將對(duì)科學(xué)合理用藥提供更為有力的依據(jù)。

4 結(jié) 論

2014—2018年仙桃市所分離的傷寒沙門菌株存在優(yōu)勢(shì)PFGE帶型及優(yōu)勢(shì)ST型，與血液來源的菌株不同，分離自糞便的菌株耐藥譜分布較廣，并出現(xiàn)了多重耐藥菌株。因此，需加強(qiáng)該地區(qū)的病例監(jiān)測(cè)，并開展傷寒病例的溯源工作，發(fā)現(xiàn)并控制危險(xiǎn)因素。