李 燚，李 蓉，賈 可，趙 軻

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院：1.兒科；2.胸外科，湖北武漢 430030)

哮喘是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，其特征是氣流可逆性阻塞、支氣管反應(yīng)過度，臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的喘息、咳嗽和呼吸困難[1]。哮喘患者的免疫反應(yīng)改變可歸因于遺傳和表觀遺傳改變。微小RNA(miRNA)是短鏈非編碼的RNA分子，高度保守并通過靶向mRNA致mRNA降解、切割或抑制蛋白質(zhì)翻譯來控制基因表達(dá)過程，參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡和細(xì)胞因子調(diào)節(jié)[2]。在過敏性氣道疾病中，miRNA的作用主要通過影響一般炎癥和組織反應(yīng)細(xì)胞因子表達(dá)而實(shí)現(xiàn)[3]。

miRNA Let-7屬于由12個(gè)基因組成的高度保守的miRNA家族，其編碼9種不同的RNA分別命名為L(zhǎng)et-7a至let-7i，let-7家族在肺臟中表達(dá)水平最為豐富[4]。Let-7a通過直接靶向白細(xì)胞介素(IL)-13轉(zhuǎn)錄物的3′UTR來抑制IL-13表達(dá)，調(diào)節(jié)IL-13分泌并由此調(diào)節(jié)氣道過敏性炎癥[5]。IL-13主要由Th2細(xì)胞分泌，是參與過敏性炎癥和哮喘的細(xì)胞分子[6]。兒童哮喘狀態(tài)下血清IL-13 水平增加，參與支氣管高反應(yīng)性、幾丁質(zhì)酶上調(diào)等病理生理過程[7]。盡管如此，哮喘兒童血漿Let-7a 表達(dá)水平尚無(wú)報(bào)道，本研究旨在探討兒童哮喘患者血漿Let-7a的表達(dá)水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2017年3月至2018年3月于本院收治的過敏性哮喘兒童90例為哮喘組，其中男41例，女49例，年齡6～10歲。哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)和嚴(yán)重程度參照全球哮喘倡議指南(GINA)[8]。并根據(jù)哮喘的嚴(yán)重程度分為輕度(41例)、中度(28例)、重度(21例)3個(gè)亞組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者出現(xiàn)反復(fù)喘息和呼吸困難且診斷為哮喘；(2)吸入β2激動(dòng)劑治療，肺功能檢測(cè)第1秒用力呼氣容積(FEV1)與吸入前相比增加12%；(3)皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)陽(yáng)性。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有心、肝和腎臟疾??；(2)患有與胸悶、劇烈呼吸和(或)咳嗽相關(guān)的其他肺病。根據(jù)肺功能檢查結(jié)果，采用FEV1水平評(píng)估哮喘的嚴(yán)重程度：輕度(FEV1>80%)、中度(FEV1 60%～80%)、重度(FEV1<60%)哮喘。選擇同期年齡和性別相匹配的沒有呼吸系統(tǒng)疾病或慢性病史的健康兒童90例為健康對(duì)照組，其中男40例，女50例，年齡6～10歲。本研究通過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得所有參與研究?jī)和改傅闹橥狻?/p>

1.2肺功能評(píng)估 使用便攜式兒科肺活量計(jì)(Masterlab Jaeger，Wurzberg，Germany)評(píng)估哮喘組中兒童的FEV1和用力肺活量(FVC)。肺功能測(cè)試的結(jié)果以預(yù)測(cè)的百分比表示。

1.3患者血液樣本收集 在完全無(wú)菌條件下從參與的兒童收集外周血樣品(4 mL)并分成兩部分：將2 mL收集至乙二胺四乙酸管中，然后將管離心10 min(1 900×g，4 ℃)，并將血漿小心地轉(zhuǎn)移到不含RNase的管中，然后再次離心10 min(12 000×g，4 ℃)。將另一部分(2 mL)在室溫下凝結(jié)30～60 min，然后離心10 min(1 000×g)以制備血清。將血漿和血清樣品儲(chǔ)存在-80 ℃直至進(jìn)一步分析。

1.4測(cè)量血清IL-13水平 使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定商業(yè)試劑盒(Bender MedSystems，Heidelberg，Germany)按照制造商的說明測(cè)定人血清中的IL-13水平，評(píng)估靈敏度為1.50 pg/mL。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清Let-7a表達(dá)水平 使用miRNeasy血清/血漿試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)從血漿樣品中提取總RNA。分光光度計(jì)通過測(cè)量260和280 nm處的吸光度來確認(rèn)提取的RNA純度和質(zhì)量。根據(jù)制造商的說明書，使用miScript Ⅱ RT試劑盒(Qiagen，Germany)通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，并將cDNA儲(chǔ)存在-80 ℃直至使用。使用SYBR Green測(cè)定試劑盒(mi-ScriptSYBR?GreenPCR Kit和miScript Primer assay(Qiagen，Valencia，CA)在Stratagene Mx3000p系統(tǒng)(實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)，Agilent Technologies，Germany)中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)混合物以20 μL的總體積進(jìn)行，含有4 μL cDNA(100 ng/mL)、300 nmol/L引物和10 μL SYBR Green Master Mix，并用無(wú)核酸酶水完成至20 μL。熱循環(huán)條件如下：在95 ℃下初始變性5 min，然后在94 ℃變性40 s,退火15 s，并在72 ℃延伸10 s。選擇管家miRNA SNORD68(miScript PCR control，Qiagen，Germany)作為內(nèi)部對(duì)照并采用2-ΔΔCt方法計(jì)算Let-7a的表達(dá)水平。Let-7a的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異度引物：正向5′-GCA GTG AGG TAG TAG GTT G-3′；反向5′-GGT CCA GTT TTT TTT TTT TTT TAA CTA TAC-3′。管家小RNA(SNORD-68)用作內(nèi)部對(duì)照，其引物序列為：正向5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′；反向5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。每個(gè)病例樣本獨(dú)立重復(fù)測(cè)量3次，取平均值作為該樣本最終Let-7a表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.12組一般臨床資料比較 哮喘組與健康對(duì)照組在年齡和性別上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2組研究對(duì)象哮喘家族史、肺功能檢測(cè)(FEV1和FVC)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；哮喘組兒童血清IL-13水平顯著高于健康對(duì)照組(P=0.000)，哮喘組兒童Let-7a表達(dá)水平顯著低于健康對(duì)照組(P=0.000)。見表1。

表1 哮喘組與健康對(duì)照組一般臨床資料比較

2.2不同嚴(yán)重程度的哮喘患兒血清IL-13和Let-7a表達(dá)水平比較 外周血中IL-13水平隨哮喘嚴(yán)重程度顯著增加(P=0.000)，血清Let-7a表達(dá)水平隨哮喘嚴(yán)重程度顯著下降(P=0.000)。見表2。

2.3血清Let-7a表達(dá)水平的診斷價(jià)值 當(dāng)最佳臨界值為2.09時(shí)，血清Let-7a診斷哮喘兒童的AUC為0.92(95%CI：0.87～0.95，P=0.001)，靈敏度和特異度分別為85.0%和90.0%；當(dāng)最佳臨界值為1.60時(shí)，Let-7a區(qū)分重度和中輕度哮喘的AUC為0.80(95%CI：0.68～0.92，P=0.001)，靈敏度和特異度分別為75.0%和93.5%。見圖1。

表2 血清IL-13和Let-7a表達(dá)水平與哮喘嚴(yán)重程度的關(guān)系

注：A表示哮喘；B表示重度哮喘。

圖1 Let-7a表達(dá)水平的ROC 曲線

2.4Let-7a與IL-13、FEV1、FVC相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示，Let-7a的表達(dá)水平與IL-13水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.31，P=0.001)，見圖2A；Let-7a的表達(dá)水平與FEV1 呈正相關(guān)(r=0.270，P=0.004)，與FVC呈正相關(guān)(r=0.412，P=0.002)，見圖2B、C。

注：A表示Let-7a和IL-13水平相關(guān)性;B表示Let-7a和FEV1之間相關(guān)性;C表示Let-7a和FVC之間相關(guān)性。

圖2 Let-7a與IL-13、FEV1、FVC相關(guān)性分析

3 討 論

哮喘是嚴(yán)重影響小兒身心健康的常見呼吸道疾病，兒童哮喘的患病率及死亡率均有上升趨勢(shì)，我國(guó)存在1 000多萬(wàn)哮喘患兒[9]。探討兒童哮喘相關(guān)血清非侵入性標(biāo)志物對(duì)哮喘診斷和疾病嚴(yán)重程度的評(píng)估具有重要意義[10]。

miRNA是一大類小的調(diào)節(jié)分子，在各種細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[11]。在哮喘發(fā)病過程中，miRNA通過調(diào)節(jié)Th2的存活、激活、增殖、分化和發(fā)育來控制過敏性免疫應(yīng)答的強(qiáng)度[12]。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘兒童Let-7a表達(dá)水平顯著性低于健康對(duì)照兒童，提示在兒童哮喘患者中，Let-7a表達(dá)受到抑制。隨著哮喘嚴(yán)重程度增加，血清Let-7a表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)。ROC曲線分析表明，Let-7a表達(dá)水平可區(qū)分哮喘和健康兒童，研究結(jié)果提示血清Let-7a表達(dá)水平可作為哮喘患者診斷的生物標(biāo)志物。ROC曲線分析顯示，血清Let-7a表達(dá)水平可以預(yù)測(cè)哮喘嚴(yán)重程度。本研究報(bào)道與文獻(xiàn)結(jié)果一致，哮喘患者血清中Let-7a表達(dá)水平降低[13]，同時(shí)在哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中分離出來的氣道上皮細(xì)胞中Let-7a表達(dá)水平也下降[14]。有文獻(xiàn)報(bào)道，與患有慢性阻塞性肺疾病的患者和健康對(duì)照組患者相比，哮喘患者呼出氣冷凝物中Let-7a miRNA表達(dá)較低[15]。通過miRNA微陣列分析檢查哮喘個(gè)體的支氣管肺泡灌洗液，發(fā)現(xiàn)Let-7a表達(dá)下調(diào)[16]。與輕度哮喘患者和健康對(duì)照組相比，嚴(yán)重哮喘患者的支氣管活檢發(fā)現(xiàn)氣道上皮細(xì)胞內(nèi)Let-7a表達(dá)水平降低[17]。

本研究通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法分析兒童哮喘患者血清IL-13水平，發(fā)現(xiàn)兒童哮喘患者血清IL-13水平顯著高于健康對(duì)照兒童，且隨著疾病嚴(yán)重程度增加而增加。嗜酸性粒細(xì)胞增多和Th2細(xì)胞因子(IL-13、IL-4和IL-5)分泌增加是哮喘患者氣道高反應(yīng)性特征[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，Let-7a表達(dá)水平與IL-13水平呈負(fù)相關(guān)，與FEV1和FVC呈正相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA Let-7a可通過靶向性結(jié)合IL-13的信使RNA 3′UTR端，靶向抑制信使RNA翻譯過程，進(jìn)而抑制IL-13的表達(dá)，降低IL-13在氣道上皮中的水平，減少氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性，具有阻止肺纖維化功能，其研究還發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠模型中Let-7a表達(dá)在哮喘中的抗炎作用，可降低哮喘小鼠外周血T細(xì)胞誘導(dǎo)IL-13分泌[5]。在癌癥患者和特發(fā)性肺纖維化患者中也提出了Let-7a的抗炎作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，兒童哮喘患者血清Let-7a表達(dá)水平與IL-13水平呈負(fù)相關(guān)，提示Let-7a表達(dá)可能通過抑制IL-13 產(chǎn)生而發(fā)揮抗炎和降低高反應(yīng)性作用。Let-7a表達(dá)水平與肺功能參數(shù)(FEV1和FEV)呈正相關(guān)，確切原因尚不清楚，猜測(cè)可能與Let-7a表達(dá)水平降低氣道高反應(yīng)性相關(guān)，需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，哮喘兒童外周血中Let-7a表達(dá)水平顯著下降，其水平與疾病嚴(yán)重程度、IL-13水平和肺功能參數(shù)呈相關(guān)性。Let-7a可用作哮喘診斷和嚴(yán)重程度的非侵入性血清學(xué)生物標(biāo)志物。