任 鵬,谷 春,李建立,劉貴建

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100055)

甘膽酸為膽酸的主要成分，可早期靈敏地反映肝膽功能的異常，是診斷肝細(xì)胞損傷和肝內(nèi)膽汁淤積癥的特異和靈敏的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)[1-3]，對(duì)肝膽疾病有診斷、鑒別診斷意義，并為肝膽疾病的預(yù)后分析提供重要依據(jù)[4]。類風(fēng)濕因子是一種自身抗體，存在于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、硬皮病、肝炎等患者的血清中[5]。在臨床檢驗(yàn)工作中發(fā)現(xiàn)，在某些類風(fēng)濕因子水平較高患者的血清中其他肝膽指標(biāo)均正常而甘膽酸異常降低；或者肝炎患者肝功檢測(cè)結(jié)果明顯異常但甘膽酸檢測(cè)結(jié)果卻正常。此種情況下甘膽酸的異常低值是真實(shí)反映肝膽功能還是由于受到干擾而出現(xiàn)的假陰性結(jié)果？如何判斷其真實(shí)性？在臨床工作中，某些未可預(yù)知的干擾會(huì)對(duì)臨床檢測(cè)結(jié)果造成明顯影響，誤導(dǎo)醫(yī)生對(duì)患者的診斷和病情判斷，形成了醫(yī)療安全方面的隱患。本文擬通過在標(biāo)本中添加不同水平類風(fēng)濕因子，驗(yàn)證較高水平的類風(fēng)濕因子是否會(huì)干擾血清甘膽酸的檢測(cè)，導(dǎo)致甘膽酸檢測(cè)結(jié)果假性降低，同時(shí)平行實(shí)驗(yàn)觀察另一種自身抗體抗核抗體對(duì)甘膽酸檢測(cè)的干擾情況，作一定的對(duì)比驗(yàn)證。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集臨床檢測(cè)到的含高水平類風(fēng)濕因子患者的血清樣本(類風(fēng)濕因子>10 000 IU/mL)，同時(shí)收集不同水平的甘膽酸血清樣本,水平區(qū)間為3.33～58.65 mg/L；收集高滴度抗核抗體標(biāo)本，涵蓋核心型、著絲點(diǎn)型、均質(zhì)型、顆粒型和混合型，同步進(jìn)行干擾試驗(yàn)。

1.2儀器與試劑 類風(fēng)濕因子測(cè)定：Beckman Coulter IMMAGE800 特種蛋白分析儀，Beckman Coulter 類風(fēng)濕因子檢測(cè)試劑盒(免疫比濁法)，標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品均為Beckman Coulter同批次產(chǎn)品。血清甘膽酸測(cè)定：Beckman Coulter AU5821全自動(dòng)生化分析儀,寧波美康公司的甘膽酸測(cè)定試劑盒(膠體金增強(qiáng)免疫法)，標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品均為寧波美康公司同批次產(chǎn)品。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，儀器已按照規(guī)定進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn)，各項(xiàng)性能指標(biāo)符合要求，整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過程中，嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)室制訂的質(zhì)量控制程序和檢驗(yàn)操作規(guī)程，并以質(zhì)控品進(jìn)行常規(guī)質(zhì)量控制，監(jiān)控整個(gè)分析操作過程。

1.3分組方法 選取符合條件的樣本進(jìn)行試驗(yàn)。每份樣本取血清2 mL，對(duì)照樣本組和干擾物組各1 mL,均分為10份，對(duì)照組分別添加0、100 μL生理鹽水；干擾物組分別添加0、150、322、545、789、1 915、3 300、4 200、5 500、11 400 IU/mL類風(fēng)濕因子血清100 μL，混勻后檢測(cè)血清甘膽酸水平。每個(gè)樣本測(cè)定2次取平均值作為檢測(cè)結(jié)果，除“0添加樣本”外，其余樣本檢測(cè)結(jié)果乘以2。同時(shí)選取含高滴度抗核抗體的血清樣本進(jìn)行同樣操作，觀察抗核抗體對(duì)甘膽酸測(cè)定的影響。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用配對(duì)t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 不同水平類風(fēng)濕因子干擾下甘膽酸檢測(cè)結(jié)果(mg/L)

圖1 干擾整體趨勢(shì)

表2 不同類型高滴度抗核抗體干擾下甘膽酸檢測(cè)結(jié)果(mg/L)

2 結(jié) 果

2.1甘膽酸處理前后的檢測(cè)結(jié)果差異 經(jīng)類風(fēng)濕因子處理前后各樣本甘膽酸檢測(cè)結(jié)果見表1。生理鹽水稀釋的標(biāo)本前后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。類風(fēng)濕因子處理前后血清甘膽酸檢測(cè)結(jié)果比較：添加類風(fēng)濕因子后的血清再次檢測(cè)甘膽酸水平，部分結(jié)果出現(xiàn)明顯下降。處理前后數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，11 400 IU/mL水平干擾下，檢測(cè)結(jié)果之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.19,P=0.000);5 500 IU/mL水平干擾下，檢測(cè)結(jié)果之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.09,P=0.002)。

2.2高濃度水平RF的干擾差異 血清甘膽酸的下降幅度與類風(fēng)濕因子的水平有關(guān)，但不成正比。類風(fēng)濕因子在4 200 IU/mL時(shí)，甘膽酸檢測(cè)結(jié)果在10 mg/L以上的樣本偏差已經(jīng)超過15%，類風(fēng)濕因子在5 500 IU/mL以上的所有樣本，甘膽酸檢測(cè)結(jié)果均超過原始檢測(cè)結(jié)果15%，原則上結(jié)果不能審核發(fā)放。見圖1。

2.3不同水平甘膽酸抗干擾的差異 原水平越低的甘膽酸樣本，受高水平類風(fēng)濕因子干擾越嚴(yán)重，抗干擾能力越低。類風(fēng)濕因子在5 500 IU/mL 水平時(shí)，甘膽酸小于15 mg/L的樣本，檢測(cè)結(jié)果不足實(shí)際水平的10%；大于40 mg/L的樣本，檢測(cè)結(jié)果約為實(shí)際結(jié)果的25%，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4低濃度水平RF的干擾差異 試劑說明書給出的建議是類風(fēng)濕因子<150 IU/mL時(shí)對(duì)甘膽酸測(cè)定無(wú)干擾。分析檢測(cè)數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕因子水平在545 IU/mL時(shí)，雖然有干擾，但結(jié)果仍然可以接受；而超過789 IU/mL時(shí)，偏差具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，需要臨床關(guān)注。

2.5未觀察到抗核抗體對(duì)甘膽酸檢測(cè)的干擾 抗核抗體平行試驗(yàn)并未觀察到對(duì)甘膽酸檢測(cè)的干擾,檢測(cè)結(jié)果之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)類風(fēng)濕因子處理后的血清甘膽酸檢測(cè)水平均有不同程度降低，尤其是類風(fēng)濕因子極高的樣本，血清甘膽酸檢測(cè)水平下降明顯，表明血清中較高水平的類風(fēng)濕因子會(huì)干擾甘膽酸的測(cè)定，導(dǎo)致血清甘膽酸假性降低。干擾的機(jī)制可能是因?yàn)轭愶L(fēng)濕因子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在機(jī)體中以多種分子結(jié)構(gòu)型存在，其理化性狀、表位種類及數(shù)目等均可影響抗原抗體反應(yīng)。人體內(nèi)IgG分子由于某些原因常相互聚集，產(chǎn)生抗原多價(jià)性，這也促進(jìn)了類風(fēng)濕因子與IgG分子或抗原抗體復(fù)合物的結(jié)合。但不同試劑盒甘膽酸抗體的來源不一，其結(jié)合特異性不能保證一致，因此，不同廠家試劑盒干擾程度很可能有所差異，這有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)觀察。此外，類風(fēng)濕因子的亞型有IGG、IGA、IGM、IGE型，結(jié)構(gòu)差異也有可能導(dǎo)致干擾程度的不同。

由于試劑研發(fā)和制備技術(shù)的發(fā)展，非特異性抗體引起的分析干擾發(fā)生率已經(jīng)明顯下降，但免疫測(cè)定過程中的干擾仍不可避免，需要臨床和檢驗(yàn)科保持警惕。本次實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)抗核抗體，亦進(jìn)行了高滴度抗核抗體對(duì)甘膽酸測(cè)定的干擾測(cè)試，結(jié)果顯示核心型、著絲點(diǎn)型、均質(zhì)型、顆粒型和混合型均未對(duì)免疫比濁法檢測(cè)甘膽酸的結(jié)果產(chǎn)生影響。分析其原因可能是抗核抗體主要以IgG型居多，而類風(fēng)濕因子以IgM型居多，故初步可以判斷IgG型抗核抗體可能不會(huì)對(duì)甘膽酸檢測(cè)造成干擾。

類風(fēng)濕因子作為自身免疫性抗體，在多種疾病中都有高水平存在的案例[6-7]，尤其是嚴(yán)重肝損害時(shí)，類風(fēng)濕因子也常常升高。臨床實(shí)驗(yàn)室在下列情況時(shí)應(yīng)考慮是否有類風(fēng)濕因子干擾物的存在：患者產(chǎn)生類風(fēng)濕因子可能性的病史或與類風(fēng)濕因子產(chǎn)生有關(guān)的疾??；臨床醫(yī)生根據(jù)其他的臨床檢驗(yàn)數(shù)據(jù)懷疑肝膽功能損傷。在這種情況下實(shí)驗(yàn)室能通過直接測(cè)定類風(fēng)濕因子的水平監(jiān)測(cè)干擾物的存在，若結(jié)果正常，則可以排除類風(fēng)濕因子干擾的可能；血清甘膽酸異常降低的結(jié)果可懷疑由類風(fēng)濕因子引起的甘膽酸假性降低，這類標(biāo)本可先進(jìn)行預(yù)稀釋處理，根據(jù)研究數(shù)據(jù)顯示，稀釋類風(fēng)濕因子水平至545 IU/mL以下時(shí)，類風(fēng)濕因子對(duì)甘膽酸測(cè)定結(jié)果的影響基本可以忽略。檢驗(yàn)人員審核甘膽酸結(jié)果時(shí)，可參考丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的檢測(cè)結(jié)果。一般ALT、AST超出檢測(cè)上限3倍的患者，甘膽酸結(jié)果會(huì)出現(xiàn)一定升高；嚴(yán)重肝病患者總膽汁酸和甘膽酸比值(TBA/CG)常常大于4,若臨床結(jié)果不符，可初步判斷甘膽酸檢測(cè)受到干擾。此類標(biāo)本需經(jīng)過處理后重新測(cè)定，方可審核發(fā)放報(bào)告。

分析所有甘膽酸檢測(cè)反應(yīng)曲線，均為X軸10點(diǎn)處開始反應(yīng)，27點(diǎn)處達(dá)到最高，且曲線路徑基本一致，無(wú)明顯差異；所有讀點(diǎn)結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，干擾并未對(duì)檢測(cè)曲線造成影響。因此，單純分析反應(yīng)曲線預(yù)計(jì)無(wú)法區(qū)分判斷干擾情況。

類風(fēng)濕因子對(duì)免疫法檢測(cè)系統(tǒng)的負(fù)干擾，在一些文獻(xiàn)中被提出，但進(jìn)行詳細(xì)研究的報(bào)道較少。干擾機(jī)制的研究，目前主要是空間位阻(屏蔽)假說，即當(dāng)類風(fēng)濕因子只能與捕獲或信號(hào)抗體中的某一種抗體結(jié)合時(shí)，會(huì)形成空間位阻(屏蔽)，阻礙捕獲抗體-抗原-信號(hào)抗體復(fù)合物的形成，造成檢測(cè)信號(hào)的減弱或缺失，引起假性降低或假陰性的檢測(cè)結(jié)果[8]。

在檢測(cè)前可以進(jìn)行預(yù)處理盡可能降低樣本中的類風(fēng)濕因子水平，以便消除或降低類風(fēng)濕因子對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的干擾。試驗(yàn)中常用的樣本預(yù)處理方法包括：使用阻斷試管采集檢測(cè)樣本[9]；分析前在樣本中加入動(dòng)物血清或IgG[10]或加入封閉阻斷試劑[11];使用聚乙二醇6000[12]處理樣本；用包被IgG的固體顆粒吸附[13]等，盡管這些方法在降低類風(fēng)濕因子干擾檢測(cè)方面被證實(shí)是有效的，且其中一些方法也較為簡(jiǎn)單實(shí)用，但這些預(yù)處理方法已被證實(shí)并不是對(duì)所有類風(fēng)濕樣本都有效[9-10，12]。價(jià)格較高的蛋白L沉淀[14]，由于性價(jià)比問題，基本不可能用于臨床試驗(yàn)當(dāng)中。部分文獻(xiàn)認(rèn)為可以通過添加還原劑2-巰基乙醇降解，使用聚乙二醇沉淀法預(yù)吸收[15]，或者重組單克隆抗體IgY作為試劑抗體等方法降低類風(fēng)濕因子的干擾作用[16]，本次試驗(yàn)由于條件所限，并未進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

綜上所述，類風(fēng)濕因子水平在545 IU/mL以下時(shí)，對(duì)甘膽酸檢測(cè)結(jié)果基本無(wú)影響，當(dāng)類風(fēng)濕因子水平大于545 IU/mL時(shí)，則會(huì)干擾甘膽酸的測(cè)定，導(dǎo)致甘膽酸檢測(cè)結(jié)果較實(shí)際血清水平低，需要引起臨床重視。結(jié)果審核時(shí)應(yīng)結(jié)合血清ALT、AST、總膽汁酸綜合分析報(bào)告血清甘膽酸結(jié)果。