張 晶， 宋 亮,2， 趙 泓 博， 劉 玉 欣,2， 趙 琪,2， 周 大 勇,2

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 遼寧 大連 116034； 2.大連工業(yè)大學(xué) 國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

南極磷蝦油富含磷脂型多不飽和脂肪酸，尤其是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，具有健腦益智、促進(jìn)視力發(fā)育等功能[1]。有機(jī)溶劑法是工業(yè)上常用的南極磷蝦油提取方法，但其制得的南極磷蝦油雜質(zhì)較多，酸價(jià)較高，且高于國(guó)家現(xiàn)有食用油及魚油的酸價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。此外，南極磷蝦油腥味較重，所含磷脂遇水膨脹，這些都限制了其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用[2]。

本實(shí)驗(yàn)以干燥粉碎研磨后的南極磷蝦粉為原料，采用有機(jī)溶劑法提取南極磷蝦油，經(jīng)食品級(jí)硅酸鈉吸附脫酸[3]、溴化鉀脫除不皂化物[4]、低溫沉降去除不溶性雜質(zhì)[5]，制得精制南極磷蝦油。將精制的南極磷蝦油經(jīng)高速剪切乳化、高壓均質(zhì)成穩(wěn)定的南極磷蝦油乳液，再將乳化液經(jīng)噴霧干燥制得南極磷蝦油微膠囊。對(duì)精制南極磷蝦油及其微膠囊的品質(zhì)進(jìn)行分析，旨在為其在食品領(lǐng)域的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦，大連遼漁集團(tuán)有限公司；將南極磷蝦冷凍干燥、粉碎，凍干粉置于-20 ℃?zhèn)溆?。正己烷、硅酸鈉、酪蛋白酸鈉、脫鹽乳清蛋白、單甘酯均為食品級(jí)，溴化鉀為光譜純，正己烷、甲醇為色譜級(jí)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MK-6s棒狀薄層色譜儀，日本雅特隆公司；Agilent 7890A氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent 公司；T-25型勻漿機(jī)，德國(guó)IKA集團(tuán)；PandaPLUS 2000高壓均質(zhì)機(jī)，意大利GEA公司；SU-8010型冷場(chǎng)發(fā)射電子掃描顯微鏡，日本日立集團(tuán)；Mastersizer 2000激光粒度儀，英國(guó)馬爾文集團(tuán)；u-SC差示掃描量熱儀，法國(guó)賽塔拉姆公司；SP8激光共聚焦顯微鏡，德國(guó)徠卡公司。AFM5500M原子力顯微鏡，日本日立集團(tuán)；Frontier 型傅里葉變換紅外光譜儀，PerkinElmer；YC-1800低溫噴霧干燥機(jī)，上海雅程儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 南極磷蝦油的提取

采用張建潤(rùn)等[6]的方法提取南極磷蝦油，得到的南極磷蝦油充氮密封，-30 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 南極磷蝦油精制

稱取10 g蝦油，溶解于40 mL食品級(jí)正己烷，加入質(zhì)量比5∶2的硅酸鈉于40 ℃中等轉(zhuǎn)速攪拌1 h，脫除游離脂肪酸；加入質(zhì)量比10∶1的溴化鉀于40 ℃下恒溫?fù)u動(dòng)2 h，脫除不皂化物；低溫(4±1) ℃沉降12 h，脫除不溶性雜質(zhì)。處理后蝦油經(jīng)10 000 r/min離心10 min，上清液于40 ℃ 下真空濃縮，測(cè)定所得蝦油的酸值、不皂化物以及不溶性雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3 精制南極磷蝦油理化指標(biāo)、脂質(zhì)組成、脂肪酸組成及其相對(duì)含量檢測(cè)

采用GB/T 5530—2005熱乙醇法測(cè)定南極磷蝦油的酸值；采用GB/T 5535.2—2008己烷法測(cè)定不皂化物質(zhì)量分?jǐn)?shù)；采用GB/T 15688—2008測(cè)定不溶性雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)；采用GB/T 5532—2008測(cè)定碘值；采用GB/T 5009.37—2003第二法比色法測(cè)定過氧化值。利用棒狀薄層色譜分析儀(TLC-FID)檢測(cè)油脂中的脂質(zhì)組成[7]。采用張建潤(rùn)等[6]的方法檢測(cè)并分析精制南極磷蝦油的脂肪酸組成及其相對(duì)含量。

1.3.4 精制南極磷蝦油微膠囊制備

稱取37.00 g酪蛋白酸鈉和42.75 g脫鹽乳清粉溶解于150 mL去離子水中，在40 ℃下攪拌30 min，將所得溶液與20 g南極磷蝦油和0.25 g單甘酯充分混勻，經(jīng)高速剪切(10 000 r/min，10 min)后，在高壓均質(zhì)機(jī)下均質(zhì)3次，均質(zhì)壓力為600 bar，形成穩(wěn)定乳化液；將乳化液經(jīng)噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度130 ℃，出風(fēng)溫度90 ℃，速率設(shè)定為6 mL/min，制得南極磷蝦油微膠囊。

1.3.5 精制南極磷蝦油微膠囊粒徑和Zeta電位檢測(cè)

將南極磷蝦油微膠囊溶于去離子水中，質(zhì)量濃度0.05 mg/mL。將樣品裝入相應(yīng)的樣品池，在溫度25 ℃、探測(cè)角90°進(jìn)行檢測(cè)[8]。每個(gè)樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3.6 精制南極磷蝦油微膠囊微觀形態(tài)觀察

冷場(chǎng)發(fā)射高分辨掃描電鏡(Cryo-SEM)：取適量制備好的南極磷蝦油微膠囊進(jìn)行掃描電鏡分析。在3 kV的加速電壓下觀察南極磷蝦油微膠囊形態(tài)[9]。

原子力顯微鏡(AFM)：取5 μL制備好的南極磷蝦油微膠囊乳液滴在云母片上晾干，在PM模式下觀察[10]。

激光共聚焦掃描顯微鏡(LCSM)：經(jīng)質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL尼羅紅溶液(油脂-紅色)和0.2 mg/mL FITC(蛋白-綠色)染料染色，染色過程為：取1 mL樣品，加入50 μL FITC染料，加入50 μL尼羅紅溶液，室溫避光靜置10 mini涂片，63×油鏡觀察，F(xiàn)ITC激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，尼羅紅激發(fā)波長(zhǎng)為543 nm[11]。

1.3.7 精制南極磷蝦油微膠囊負(fù)載率和包封率檢測(cè)

表面油質(zhì)量測(cè)定：根據(jù)Deshmukh[12]的方法稍作修改，測(cè)定游離(表面)油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。采用有機(jī)溶劑直接萃取法測(cè)定粉末油脂的表面油，具體方法：將3 g微膠囊樣品置于帶螺旋蓋的燒瓶中，加入27 mL石油醚以提取未微膠囊化的游離(表面)磷蝦油。使用恒溫振蕩器在室溫條件下進(jìn)行提取，100 r/min振蕩10 min。萃取后，使用濾紙過濾分散體并用10 mL石油醚洗滌螺旋蓋的燒瓶和濾紙2次。收集含有游離(表面)油的濾液并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀下蒸干，干燥至恒重。通過重量分析測(cè)定游離(表面)油質(zhì)量。

總油質(zhì)量測(cè)定：根據(jù)Deshmukh[12]的方法稍作修改，測(cè)定總油質(zhì)量分?jǐn)?shù)?？傆桶ㄓ坞x(表面)和微囊化油。為了分解南極磷蝦油微膠囊，將1 g樣品與15 mL HCl (4 mol/L)在恒溫振蕩器中在室溫條件以200 r/min混合30 min。為了提取總油，加入30 mL石油醚。在恒溫振蕩器中以150 r/min提取12 h。萃取后，使用濾紙過濾分散體并用10 mL石油醚洗滌螺旋蓋的燒瓶和濾紙2次。收集含有總油的濾液并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀下蒸干，干燥至恒重。通過重量分析測(cè)定總油質(zhì)量。

分別計(jì)算南極磷蝦油微膠囊負(fù)載效率(mg/g)和包封率(mg/g)[13]：

負(fù)載效率=(wt-wf)/w

(1)

包封率=(wt-wf)/wt

(2)

式中：wt為總油質(zhì)量，g；wf為表面油質(zhì)量，mg；w為微膠囊的質(zhì)量，mg。

1.3.8 精制南極磷蝦油微膠囊傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析

采用KBr壓片法，稱取樣品與KBr 1∶100的比例混合研細(xì)后于7.0×107Pa下壓成透明薄片，以KBr空白壓片作參比，裝入壓片于4 000～500 cm-1進(jìn)行掃描，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32，得到平均數(shù)據(jù)[14]。

1.3.9 精制南極磷蝦油微膠囊差示掃描量熱(DSC)分析

稱取樣品5～10 mg于鋁制坩堝內(nèi)，壓緊用沖模密封放入量熱池。以空鋁鍋?zhàn)鳛榭瞻讓?duì)照，重復(fù)3次測(cè)定。設(shè)置升溫程序：樣品平衡2 min，從10 ℃逐漸升溫加熱至150 ℃，再逐漸冷卻到10 ℃，升溫和降溫速率均為10 ℃/min[15]。

1.3.10 精制南極磷蝦油微膠囊電子鼻風(fēng)味圖譜檢測(cè)

電子鼻是由10個(gè)不同的金屬氧化物傳感器(表1)和識(shí)別分析軟件組成的儀器[16]。稱取南極磷蝦油和微膠囊各1 g (精確至0.01 g)，放入10 mL 頂空瓶中，加蓋密封，載氣為干燥潔凈空氣，氣體體積流量80 mL/min，數(shù)據(jù)采集時(shí)間120 s，數(shù)據(jù)采集延遲時(shí)間300 s，手動(dòng)頂空進(jìn)樣。每個(gè)樣品做10次平行實(shí)驗(yàn)。

表1 電子鼻傳感器性能Tab.1 Performance description of electronic nose sensor

1.3.11 精制南極磷蝦油微膠囊熱穩(wěn)定性分析

將南極磷蝦油微膠囊分別溶解在25、62、100 ℃ 去離子水中，質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL。水浴孵育30 min，冷卻至室溫。分別進(jìn)行粒徑、電位、微觀形態(tài)等指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.12 精制南極磷蝦油微膠囊pH穩(wěn)定性分析

將微膠囊粉溶解在62 ℃水中，質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL。樣品通過加入0.01～2 mol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至2～9，采用磁力攪拌器在500 r/min條件下連續(xù)攪拌1 h。分別進(jìn)行粒徑、電位等指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.13 數(shù)據(jù)處理方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示，并采用SPSS16.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，在P<0.05時(shí)認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 精制南極磷蝦油品質(zhì)

精制南極磷蝦油品質(zhì)分析結(jié)果見表2。理化指標(biāo)分析可知，其酸值、不皂化物、不溶性雜質(zhì)均符合水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中精制魚油標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)脂質(zhì)組成分析可知，與Li[17]、Tandy[18]等的研究結(jié)果相比，本實(shí)驗(yàn)精制得到的南極磷蝦油磷脂含量高，而游離脂肪酸含量低。脂肪酸組成及相對(duì)含量分析可知，與Ali-Nehari等[19]的研究結(jié)果相比，本實(shí)驗(yàn)精制得到的南極磷蝦油營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)顯著提高。

表2 南極磷蝦油精制后的理化指標(biāo)Tab.2 Indicators of refined Antarctic krill oil %

2.2 精制南極磷蝦油微膠囊的粒徑及Zeta電位表征

由圖1(a)可知，南極磷蝦油微膠囊的粒徑分布范圍較窄，平均粒徑為337.7 nm，本實(shí)驗(yàn)制得的磷蝦油微膠囊粒徑小易于人體胃腸道消化吸收。由圖1(b)可知，南極磷蝦油微膠囊?guī)ж?fù)電荷，且電位絕對(duì)值為37.5 mV，大于30 mV，而Zeta電位絕對(duì)值大于30 mV被認(rèn)為是液滴聚集和聚結(jié)穩(wěn)定性的指示值[20]，因此，本實(shí)驗(yàn)制得的磷蝦油微膠囊復(fù)水后，其乳液穩(wěn)定性較好。

2.3 精制南極磷蝦油微膠囊的微觀形態(tài)觀察

南極磷蝦油微膠囊在Cryo-SEM下表面形態(tài)如圖2所示。從圖2(a)可以看出，磷蝦油微膠囊呈圓球形，表面相對(duì)光滑，囊壁比較完整，分布較均勻，無聚集現(xiàn)象，表明南極磷蝦油被封裝到以脫鹽乳清粉和酪蛋白酸鈉為壁材的囊殼中。圖2(b)原子力顯微鏡檢測(cè)顯示，南極磷蝦油微膠囊呈圓球形，3D圖分析表明，磷蝦油微囊的囊殼具有一定硬度，經(jīng)探針碰撞并未破壞微囊結(jié)構(gòu)，表明南極磷蝦油微膠囊具有良好的穩(wěn)定性[21]。

2.4 精制南極磷蝦油微膠囊的負(fù)載率和包封率測(cè)定

由公式(1)、(2)計(jì)算可知，本實(shí)驗(yàn)制得的南極磷蝦油微膠囊負(fù)載率為(190.29±0.05) mg/g，包封率為(960.45±0.74) mg/g。Shi等[22]通過復(fù)凝聚法制備的南極磷蝦油微囊的負(fù)載率為130 mg/g，包封率為800 mg/g，本實(shí)驗(yàn)制得的南極磷蝦油微膠囊負(fù)載率相對(duì)較高，表明所選壁材對(duì)南極磷蝦油具有很好的承載性能，使得磷蝦油具有較長(zhǎng)的持效性。包封效果較好，表明所選壁材適合用于包封磷蝦油。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)制得的南極磷蝦油微膠囊兼具速效性和持效性。

(a) 粒徑

(b) Zeta電位

圖1 南極磷蝦油微膠囊粒徑及Zeta電位

Fig.1 Particle size and Zeta potential of Antarctic krill oil microcapsules

(a) Cryo-SEM

(b) AFM

圖2 南極磷蝦油微膠囊微觀形態(tài)

Fig.2 Microstructure of Antarctic krill oil microcapsules

2.5 精制南極磷蝦油及其微膠囊的紅外光譜分析

圖3 南極磷蝦油及其微膠囊傅里葉變換紅外 光譜Fig.3 FTIR of Antarctic krill oil and its microcapsules

2.6 精制南極磷蝦油微膠囊的差示掃描量熱分析

如圖4所示，南極磷蝦油微膠囊在58 ℃前，曲線基本無變化，表明微膠囊仍處于玻璃態(tài)，性質(zhì)較穩(wěn)定；當(dāng)溫度超過58 ℃時(shí)，出現(xiàn)第一個(gè)吸熱峰，峰值為74 ℃，即微膠囊的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度[23]。此階段反應(yīng)為微膠囊壁材成分在高溫下受熱溶脹，有序晶體結(jié)構(gòu)向無序晶體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，發(fā)生吸熱現(xiàn)象。隨著溫度的升高，在86 ℃出現(xiàn)第2個(gè)吸收峰，峰值為125 ℃，此階段微膠囊成分開始發(fā)生熱分解反應(yīng)。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)制得的磷蝦油微膠囊具有良好的溫度耐受性，能滿足一般食品加工的條件，并保證其結(jié)構(gòu)完整[24]。

圖4 南極磷蝦油微膠囊差示掃描量熱曲線Fig.4 DSC of Antarctic krill microcapsules

2.7 精制南極磷蝦油及其微膠囊風(fēng)味雷達(dá)圖譜

如圖5所示，南極磷蝦油在傳感器W1S響應(yīng)值最大，為11.90；在W3S響應(yīng)值最小，為0.10。而南極磷蝦油微膠囊響應(yīng)值最大為1.43。南極磷蝦油在W1C、W5S、W1S、W1W、W2S、W2W響應(yīng)值均顯著大于南極磷蝦油微膠囊，即南極磷蝦油具有極性大的芳香成分氣味。通過傳感器雷達(dá)圖可以直觀地顯示出南極磷蝦油和南極磷蝦油微膠囊風(fēng)味在傳感器上的響應(yīng)差異[25]。結(jié)果表明，磷蝦油經(jīng)微膠囊化后，揮發(fā)性成分減少，特征風(fēng)味減弱，明顯改善了南極磷蝦油產(chǎn)品的不良?xì)馕丁?/p>

圖5 南極磷蝦油及其微膠囊傳感器雷達(dá)響應(yīng)圖Fig.5 Sensor radar response of Antarctic krill oil and its microcapsules

2.8 精制南極磷蝦油微膠囊熱穩(wěn)定性

由圖6(a)可知，南極磷蝦油微膠囊在25 ℃下呈球形，表面相對(duì)光滑，分布較均勻；在62 ℃條件下微囊仍保持完整，略有粘連現(xiàn)象；在100 ℃下觀察到南極磷蝦油微囊仍呈球形，粒徑變大且分布不均勻。由圖6(b)可知，在25 ℃下南極磷蝦油微膠囊分布較均勻；在62 ℃條件下未有紅色油滴出現(xiàn)，說明微囊仍保持完整；在100 ℃下其粒徑變大，可能由于蛋白溶脹作用[26]，但微囊的結(jié)構(gòu)并未被破壞，未發(fā)現(xiàn)紅色油滴破囊釋放。

由表3可知，南極磷蝦油微囊在62 ℃平均粒徑變化不顯著(P>0.05)；在100 ℃下，平均粒徑顯著變大(P<0.05)，與圖6結(jié)果一致。Zeta電位絕對(duì)值在不同溫度下均大于30 mV，表明微囊復(fù)水乳液均處于穩(wěn)定狀態(tài)。上述結(jié)果均表明，本實(shí)驗(yàn)制得的南極磷蝦油微膠囊在較高溫度下仍可保持穩(wěn)定狀態(tài)。

2.9 精制南極磷蝦油微膠囊pH穩(wěn)定性

由圖7可知，當(dāng)pH=2～3，南極磷蝦油微膠囊復(fù)水乳液的平均粒徑減小，復(fù)水乳液帶有正電荷且Zeta電位變大；當(dāng)pH=4，乳液出現(xiàn)相分離，有絮狀沉淀，這可能由于此時(shí)pH接近酪蛋白酸鈉的等電點(diǎn)，此結(jié)果與Khalid等[27]結(jié)果相似；當(dāng)pH為5～9，復(fù)水乳液粒徑保持相對(duì)穩(wěn)定，Zeta電位逐漸變大且均大于30 mV。結(jié)果表明，南極磷蝦油微膠囊化后，磷蝦油具有良好的pH穩(wěn)定性，對(duì)油脂有保護(hù)作用。

(a) Cryo-SEM

(b) LCSM

圖6 不同溫度下南極磷蝦油微膠囊微觀形態(tài)變化

Fig.6 Microstructure changes of Antarctic krill oil microcapsules at different temperatures

表3 不同溫度下南極磷蝦油微膠囊粉末平均粒徑及Zeta電位變化

Tab.3 Mean particle size and zeta potential changes of Antarctic krill oil microcapsules at different temperatures

θ/℃d/nmV/mV25337.70a-37.50a62341.33a-41.86b100413.13b-46.33c注:不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。

圖7 不同pH下南極磷蝦油微膠囊的平均粒徑和Zeta電位

Fig.7 The particle size and zeta potential changes of Antarctic krill oil microcapsules at different pH

3 結(jié) 論

采用硅酸鈉吸附脫酸、溴化鉀脫除不皂化物、低溫沉降等方法去除不溶性雜質(zhì)，制備得到了酸值(1.34±0.19) mg/g、不皂化物(0.65±0.05)%、不溶性雜質(zhì)(0.04±0.01)%的精制南極磷蝦油，其磷脂含量較高，游離脂肪酸含量較少。將精制南極磷蝦油經(jīng)噴霧干燥工藝，制備得到了負(fù)載率為(190.29±0.05) mg/g、包封率(960.45±0.74) mg/g的南極磷蝦油微膠囊。經(jīng)表征，微膠囊呈圓球形，表面相對(duì)光滑，囊壁比較完整，分布較均勻，無聚集現(xiàn)象，具有較高的耐受溫度；微囊化后的南極磷蝦油揮發(fā)性成分減少，磷蝦油氣味強(qiáng)度減弱，產(chǎn)品穩(wěn)定性較好，可以達(dá)到保護(hù)油脂的目的，為在烘焙食品、固體飲料方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。