楊 靜 怡， 王 燕 燕， 于 放

( 大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

單萜類吲哚生物堿(Monoterpene indole alkaloids，MIAs)具有數(shù)千種已經(jīng)被報道的化學結(jié)構(gòu)，是植物所具有的代謝物中最多樣化的產(chǎn)物之一[1]。眾所周知，MIAs擁有不同的生物活性，也是臨床上各種藥物的重要來源，包括長春花(Catharanthusroseus)中的抗癌化合物長春質(zhì)堿和長春新堿等天然次生代謝物。MIAs在植物體內(nèi)合成量較少，并且因其化學結(jié)構(gòu)復雜，難以進行化學合成，因此在市場上往往供不應求。最近，在長春花植株代謝途徑中發(fā)現(xiàn)了兩個一氧乙?；伛R地寧(Stemmadenine-O-acetylation，OAS)的水解酶HL1和HL2。OAS首先被氧化，通過綴合亞胺的NADPH依賴性酶進行還原，再將得到的烯胺脫乙?；?片段化，通過HL1和HL2的作用產(chǎn)生兩種脫氫甘氨酸型中間體，經(jīng)過不同的合成過程，促進了長春花植株中對長春質(zhì)堿或水甘草堿的積累，近而提高了長春質(zhì)堿和長春新堿的積累量，最終合成長春新堿和長春質(zhì)堿。

長春花細胞培養(yǎng)物中除小檗堿和利舍平可進行大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)外，其他MIAs因含量低而無法進行工業(yè)化生產(chǎn)[3]。目前，長春花組織培養(yǎng)物中只能生產(chǎn)用于降血壓和鎮(zhèn)痛的阿嗎堿和利舍平，而具有抗癌功效的長春質(zhì)堿和長春新堿卻無法生產(chǎn)。趙劍等[4]對長春花葉片進行愈傷組織誘導時發(fā)現(xiàn)，相對于原本葉片中文多靈和長春質(zhì)堿的含量，在誘導的過程中兩者迅速降解到極低水平。Goswami等[5]對長春花進行秋水仙素的處理，形成同源四倍體中MIAs含量比母本也有下降趨勢。張秀省等[6]對不同長春花愈傷組織進行分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)EMS誘變后的愈傷組織能產(chǎn)生更多的生物堿。對于長春花細胞培養(yǎng)物的研究從未間斷過，然而卻鮮有關(guān)于其分子機理及不同組織生物堿積累量系統(tǒng)的研究。

本研究培育了長春花5種不同愈傷組織與懸浮細胞，并且對其生長狀態(tài)進行比較，采用實時熒光定量PCR和高效液相色譜方法對細胞培養(yǎng)物中OAS水解過程進行解析，以期為探究長春花細胞培養(yǎng)物的遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)生MIAs提供基礎(chǔ)。

1 試 驗

1.1 材料與試劑

長春花種子、長春花無菌苗及長春花毛狀根均為本實驗室培育。

MS培養(yǎng)基、WPS培養(yǎng)基，海博生物公司；植物激素2，4-D和6-BA，索萊寶公司，實驗室中貯備液質(zhì)量濃度為2 mg/mL；反轉(zhuǎn)錄酶、RNA提取TRNzol試劑、沒有RNA污染降解RNA中的DNA酶、DNA聚合酶、TransStart Tip Green qPCR SuperMix酶以及瓊脂糖凝膠均來自全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 長春花無菌苗的培養(yǎng)

將長春花種子作為外植體進行消毒處理，首先用流水將長春花種子沖洗干凈，浸入酒精15～30 s，用無菌水沖洗2次；在95%次氯酸鈉中浸泡5～7 min，使用無菌水沖洗3～5次，將滅菌的種子置于三角瓶中的MS培養(yǎng)基中萌發(fā)生長；在光照強度3 000 lx、時間16 h、24 ℃條件下培養(yǎng)，待生長到一定時間繼續(xù)實驗。

1.2.2 不同長春花細胞培養(yǎng)物的誘導

長春花愈傷組織誘導培養(yǎng)基：WPS培養(yǎng)基加入1.5 mg/L 2，4-D和1.5 mg/L 6-BA，蔗糖3%，瓊脂0.8%。

長春花愈傷組織生長培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基加入1.75 mg/L 2，4-D和1.75 mg/L 6-BA，蔗糖3%，瓊脂0.8%。在光照強度3 000 lx、時間12 h、24 ℃條件下培養(yǎng)。

長春花懸浮細胞液體培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基加入1.75 mg/L 2，4-D和1.75 mg/L 6-BA，蔗糖3%。培養(yǎng)基pH均為5.8。

1.2.3 不同組織長春花懸浮細胞的誘導

選取同批培養(yǎng)、質(zhì)地疏松、分散度良好、生長旺盛均一的淡黃綠色的不同的長春花愈傷組織作為懸浮培養(yǎng)的材料，將不同的愈傷組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中。每150 mL的三角瓶中分裝50 mL 液體培養(yǎng)基，每瓶接種量2 g，搖瓶轉(zhuǎn)速為100 r/min，溫度25 ℃，黑暗條件下培養(yǎng)。

1.2.4 懸浮細胞生長量的測定

利用液氮研磨法破碎不同的長春花細胞培養(yǎng)物，利用TRNzol法提取RNA[13]，對樣品RNA進行消化后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，如表1所示。以CrACT3-F/R為引物進行生物檢測，終產(chǎn)物利用實時定量PCR進行檢測。

1.2.5 長春花細胞培養(yǎng)物的次級代謝產(chǎn)物的檢測

將愈傷組織和懸浮細胞收集到2 mL離心管中。在每個離心管中加入2顆均勻氧化鋯，通過高通量組織研磨儀進行破碎，加入甲醇破碎后進行超聲處理，收集上清，利用真空旋干干燥儀旋至干粉。再加入500 mL甲醇溶解，將所得溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，使用HPLC進行分析檢測。

色譜柱：安捷倫C18色譜柱；流動相A，乙腈；流動相B，水；V(A)∶V(B)=9∶1。檢測波長：文多靈310 nm，長春質(zhì)堿280 nm；體積流量1.2 mL/min，自動進樣器進樣量10 μL，柱溫25 ℃。根據(jù)標準曲線以及樣品的峰面積計算長春質(zhì)堿含量。

表1 實驗所用引物序列Tab.1 Primer sequence in the experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 長春花懸浮培養(yǎng)細胞的生長曲線

為了選取合適的懸浮細胞材料，在細胞懸浮培養(yǎng)過程中，以長春花細胞通光率，即培養(yǎng)過程中細胞的密度作為生長指標。如圖1所示，幾種不同懸浮細胞的生長曲線均為S型，大致分為3個時期：延遲期、指數(shù)期和靜止期，且這5種懸浮細胞的密度變化時間也較為一致。

圖1 長春花不同部位細胞懸浮物培養(yǎng)過程中密度變化

Fig.1 The changes of cell density during cell suspension culture ofCatharanthusroseus

從圖1可以看出，這幾種長春花懸浮培養(yǎng)細胞均有比較明顯的延遲期，但時間不同。愈傷組織剛接入時的液體培養(yǎng)基顏色較淺，并且細胞分布不均勻且稀疏，推測是由于愈傷組織的細胞暫時不適應液體培養(yǎng)基，這個階段為延遲期；第二個階段為指數(shù)生長期，培養(yǎng)基的顏色也逐漸加深，變?yōu)辄S綠色，細胞分布均勻，并且有些懸浮細胞的培養(yǎng)基中出現(xiàn)了少量的細胞團；處于第三個階段靜止期時，培養(yǎng)基由黃綠色逐漸變?yōu)辄S褐色或灰色，細胞密度有所降低，有些培養(yǎng)基中出現(xiàn)散亂且大量的細胞團，推測是因為培養(yǎng)基中細胞密度變大導致的營養(yǎng)成分耗盡，提供的營養(yǎng)物質(zhì)不足所致，選取30 d左右的組織培養(yǎng)物作為進一步研究的材料。

2.2 長春花不同培養(yǎng)物中CrHL1和CrHL2的反轉(zhuǎn)錄鑒定

提取長春花不同懸浮細胞和愈傷組織的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用內(nèi)參基因CrACT3進行PCR鑒定，如圖2所示。條帶清晰明顯，證明反轉(zhuǎn)錄成功，進行實時定量PCR檢測。

(a) 懸浮細胞

(b) 愈傷組織

1，莖；2，根；3，花；4，毛狀根；5，葉

圖2 長春花不同培養(yǎng)物中RNA的鑒定

Fig.2 Detection of RNA in differentCatharanthusroseuscultures

2.3 長春花不同培養(yǎng)物中CrHL1和CrHL2的相對表達量

如圖3所示，不同懸浮細胞中CrHL1和CrHL2的相對表達量不同，與愈傷組織中的相對表達量也不同；而除毛狀根和莖誘導而來的懸浮細胞中CrHL1的相對表達量低于CrHL2外，其余均與愈傷組織中相對表達量變化的趨勢相同。不同愈傷組織中水解酶基因的相對表達量存在差異，推測是由于這5種愈傷組織來源于不同組織。不同愈傷組織中合成長春質(zhì)堿前體的CrHL1的相對表達量均高于合成水甘草堿前體CrHL2。

選取實驗組各3個重復生物學樣本進行分析 (*P<0.05，**P<0.01)

圖3 長春花不同培養(yǎng)物中CrHL1和CrHL2的相對表達量

Fig.3 Relative expression ofCrHL1 andCrHL2 in differentCatharanthusroseuscultures

2.4 長春花不同培養(yǎng)物中生物堿的積累量

選取繼代后28 d左右不同長春花的愈傷組織和培養(yǎng)30 d左右的懸浮細胞進行HPLC檢測，結(jié)果如圖4所示。文多靈和長春質(zhì)堿標準品上樣量均為50 mg/L，對比圖中不同的峰，在長春花的不同培養(yǎng)物中檢測到存在長春質(zhì)堿的積累，而沒有檢測到文多靈的積累。

a，文多靈標準品； b，長春質(zhì)堿標準品； c，長春花葉片； d，長春花愈傷組織； e，懸浮細胞

圖4 長春花不同培養(yǎng)物的HPLC圖

Fig.4 HPLC of catharanthine in differentCatharanthusroseuscultures

不同的細胞培養(yǎng)物中長春質(zhì)堿積累量的差異變化如圖5所示，且在愈傷組織誘導生成懸浮細胞的過程中，根、花和葉懸浮細胞中長春質(zhì)堿的積累分別提高了137.3%、157.5%和190.9%；莖中長春質(zhì)堿積累量提高了113.5%，相較于其他懸浮細胞提高并不顯著；在毛狀根的愈傷組織被誘導形成懸浮細胞的過程中，長春質(zhì)堿積累量降低了25.1%。

圖5 長春花不同培養(yǎng)物中長春質(zhì)堿的積累量 (*P<0.05)

Fig.5 Accumulation of catharanthine in differentCatharanthusroseuscultures

3 結(jié)論與討論

在轉(zhuǎn)錄水平上，由長春花愈傷組織的代謝產(chǎn)物和對應的一氧乙?；伛R地寧水解酶的表達量的比較得知，CrHL1的相對表達量高于CrHL2，且終產(chǎn)物長春質(zhì)堿得到積累，而并未檢測到文多靈的合成；證明不同愈傷組織積累吲哚生物堿的過程中，當OAS水解時，代謝流更多的是向著合成長春質(zhì)堿這一方向流動。而由愈傷組織形成懸浮細胞過程中，花、葉和根的CrHL1的相對表達量均升高，長春質(zhì)堿的積累量也隨之增加；而毛狀根和莖中CrHL1的相對表達量均降低，但又由于毛狀根中CrHL2的相對表達量升高，莖中CrHL2的相對表達量幾乎沒有變化，因而毛狀根中長春質(zhì)堿的積累量降低，而莖中長春質(zhì)堿的積累量沒有顯著變化。

在次級代謝產(chǎn)物水平上對長春質(zhì)堿合成量的能力進行對比，從宏觀來看，懸浮細胞較愈傷組織更為理想。在愈傷組織誘導生成懸浮細胞的過程中，花、葉和根中長春質(zhì)堿積累量增加，在這個過程中基中長春質(zhì)堿的積累量沒有顯著的變化，但毛狀根中長春質(zhì)堿的積累量有所減少；其中，根誘導而來的懸浮細胞中長春質(zhì)堿的積累量最高，是一種比較理想的材料。在長春花細胞培養(yǎng)物積累次級代謝產(chǎn)物的過程中還有很多的影響因素，并且整個過程復雜，能否通過單獨調(diào)控CrHL1和CrHL2基因的表達改變水解過程來改變長春花細胞培養(yǎng)物的代謝流變化還有待探究。