張 權(quán)， 酉相成， 陳修來， 劉 佳， 羅秋玲， 劉立明*

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122；3.江南大學(xué) 食品微生物制造工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

硫酸軟骨素（sulfated chondroitin，CS）是一類硫酸化的糖胺聚糖（Glycosaminoglycan, GAG），由葡萄糖醛酸（UDP-GlcA）和N-乙酰氨基半乳糖（UDPGalNAc）通過β1→3 或者β1→4 糖苷鍵交替連接而成[1]。 根據(jù)二糖單位中硫酸基團(tuán)數(shù)量和位置的差異，CS 可以分為A、B、C、D、E、F 等類型， 動(dòng)物來源的CS 單體多為CS-A，C[2]。 CS 存在于動(dòng)物軟骨組織中，具有良好的生物活性和藥用價(jià)值，廣泛用于醫(yī)藥行業(yè)，食品保健品行業(yè)和護(hù)膚化妝品行業(yè)[3-5]。 CS的生產(chǎn)方法包括動(dòng)物組織提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。 由于原材料匱乏，生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，提取工藝復(fù)雜，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，環(huán)境污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)，嚴(yán)重制約了CS 的工業(yè)化生產(chǎn)[6-8]。 微生物發(fā)酵法與上述方法相比有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，微生物利用廉價(jià)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生產(chǎn)高價(jià)值的CS， 能夠顯著降低生產(chǎn)成本，增加經(jīng)濟(jì)效益；發(fā)酵液提取與純化工藝過程較其他方法簡(jiǎn)單，得到的產(chǎn)品質(zhì)量安全穩(wěn)定；此外，發(fā)酵法具有環(huán)境友好、低污染等優(yōu)勢(shì)[9-10]。

Escherichia coliK4 作為軟骨素及其類似物的主要生產(chǎn)菌株，其莢膜多糖（capsular polysaccharide,CPS） 是由UDP-GlcA 和UDP-GalNAc 通過β1→3或者β1→4 糖苷鍵交替連接而成， 并且UDP-GlcA的C-3 位置被果糖基團(tuán)所取代[11]。 近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從生化工程和代謝工程2 個(gè)方向研究軟骨素及其類似物的生產(chǎn)。 Cimini 團(tuán)隊(duì)以E. coliK4 作為出發(fā)菌株進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)條件的優(yōu)化， 選擇葡萄糖和甘油，酪蛋白和大豆蛋白胨分別作為碳源和氮源進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)。 最終選擇甘油和大豆蛋白胨進(jìn)行2-L 罐進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，此時(shí)最大的細(xì)胞密度為56 gcww/L，對(duì)應(yīng)的CPS 產(chǎn)量為1.4 g/L[12]。 Restaino 課題組通過向培養(yǎng)基中添加K4 CPS 的前體物質(zhì)UDP-GlcA 和UDP-GalNAc、果糖，果糖軟骨素的產(chǎn)量提高了68%和57%[13]。 然而這些生化工程策略并不能從根本上解決果糖軟骨素低產(chǎn)量、低產(chǎn)率、低生產(chǎn)強(qiáng)度的問題。 因此，學(xué)者從代謝工程方向?qū). coliK4 菌株進(jìn)行代謝改造提高果糖軟骨素的產(chǎn)量。 K4 CPS 屬于Group II K 抗原， 一共可以分為3 個(gè)功能區(qū)[14]。Region 1 和region 3 作為Group II 保守基因， 主要負(fù)責(zé)多糖的修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)。 Region 2 根據(jù)不同類型的K 抗原而有所差異，K4 CPS 基因簇全長(zhǎng)14 kb，包括7 個(gè)基因（kfoA, kfoB…kfoG）和一個(gè)轉(zhuǎn)座元件IS2，總結(jié)于表1。 其中部分基因已經(jīng)作為代謝工程靶點(diǎn)進(jìn)行改造，例如啟動(dòng)子工程策略：利用不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子Trc 和T7 過量表達(dá)軟骨素合成酶KfoC，工程菌株BK4063 產(chǎn)量較原菌提高了113%[15]；轉(zhuǎn)錄工程策略：利用誘導(dǎo)型表達(dá)載體和組成型表達(dá)載體過表達(dá)全局調(diào)控因子SlyA[16]和轉(zhuǎn)座子策略表達(dá)抗終止子RfaH[17]，果糖軟骨素的產(chǎn)量均有所提高；基因敲除策略： 利用Red 同源重組技術(shù)敲除果糖轉(zhuǎn)移酶KfoE，終產(chǎn)物為軟骨素[18]。 此外，Cimini 課題組還研究了前體UDP-GlcA 合成路徑上的葡萄糖磷酸變位酶PGM 和焦磷酸化酶GalU 對(duì)莢膜多糖合成的影響， 即在重組菌株EcK4r3 中過量表達(dá)pgm和galU。雖然pgm和galU的表達(dá)量較對(duì)照菌株分別提高了1.6 和1.3 倍， 但是莢膜多糖的產(chǎn)量并未發(fā)生變化，然而在添加谷氨酰胺的培養(yǎng)基中，莢膜多糖的產(chǎn)量卻提高了45%[19]， 因此我們推測(cè)前體UDPGalNAc 合成路徑對(duì)莢膜多糖的生產(chǎn)可能具有促進(jìn)作用。

為探究前體UDP-GalNAc 合成路徑對(duì)果糖軟骨素生產(chǎn)的影響， 本研究中選擇關(guān)鍵酶GlmS 和GlmM 強(qiáng)化UDP-GalNAc 路徑（圖1）。 首先分別單獨(dú)過量表達(dá)glmM和glmS基因，為增強(qiáng)底物之間的轉(zhuǎn)化效率，構(gòu)建了融合蛋白glmM-glmS，然后通過利用不同表達(dá)強(qiáng)度的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（Ribosome binding site，RBS） 控制融合蛋白起始翻譯速率，從而控制融合蛋白的表達(dá)強(qiáng)度，最終獲得了最優(yōu)工程菌株E. coliK4-H-glmM-glmS。

表1 K4 CPS 合成涉及的蛋白質(zhì)[14]Table 1 Proteins involved in the biosynthesis of K4 CPS[14]

圖1 K4 CPS 的生物合成路徑Fig. 1 Synthesis pathway of CPS in E. coli K4

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 pTrcHisA 載體， 大腸桿菌JM109 為本實(shí)驗(yàn)室保存；pETM6R1 載體由pETM6載體改變啟動(dòng)子區(qū)域而來；pETM6 載體， 購買于美國(guó)Addgene 公司；大腸桿菌K4，購買于美國(guó)菌種保藏中心（ATCC）。 本研究所用質(zhì)粒和菌株詳見表2。

表2 本研究所用的質(zhì)粒和菌株Table 2 Plasmids and strains used in this study

續(xù)表2

1.1.2 主要試劑和儀器 限制性內(nèi)切酶AvrII、SalI、SpeI、XbaI、XhoI，Taq DNA 聚合酶，T4 DNA 連接酶，DNA marker，購自大連寶生物工程公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、氨芐青霉素（Amp）、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、咔唑、葡萄糖醛酸，購自生工生物工程（上海）公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒，購自天根公司；PCR 引物（表2）由蘇州泓迅生物科技有限公司合成；其他試劑購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。 PCR 擴(kuò)增儀、全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)、電穿孔儀Green Pulser、核酸電泳儀，購自美國(guó)Bio-rad 公司；5-L 發(fā)酵罐，購自上海保興生物有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：MgSO4·7H2O 1.4，（NH4）2HPO41.4，KH2PO413.5，檸檬酸1.7，甘油20，維生素B14.5 mg/L，金屬離子液10 mL/L。

補(bǔ)料培養(yǎng)基（g/L）：甘油500，MgSO4·7H2O 10，維生素B10.2。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃條件下滅菌15 min，維生素B1 過濾除菌。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng)方法 取保存于含體積分?jǐn)?shù)15%甘油的菌液100 μL，接種到裝有培養(yǎng)基25 mL/250 mL的搖瓶中，加入質(zhì)量濃度為100 mg/mL 氨芐青霉素25 μL，在37 ℃、200 r/min 下培養(yǎng)10 h 待用。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵 將種子液按發(fā)酵總體積1%的接種量，接種到裝液量50 mL/500 mL 的搖瓶中，添加質(zhì)量濃度為100 mg/mL 氨芐青霉素50 μL，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)37 h。 當(dāng)OD600達(dá)到0.6～0.8 時(shí)，采用0.2～1.0 mmol/L 的IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度為25～42 ℃。

1.2.35 L 罐補(bǔ)料分批發(fā)酵 采用5 L 發(fā)酵罐進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵。 發(fā)酵罐初始裝液量為2.5 L。 將種子液按總體積10%的接種量接種至發(fā)酵罐中，菌體濃度（OD600）達(dá)到10.0 左右時(shí)，采用0.4 mmol 的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。 初始條件：轉(zhuǎn)速為400 r/min，通氣量為1.0 vvm，pH 為7.0。 發(fā)酵過程中通過流加氨水控制pH 至7.0。 培養(yǎng)7 h，發(fā)酵液的溶氧值陡然上升，20 g/L 的初始甘油消耗完全， 此時(shí)即啟動(dòng)2 種補(bǔ)料模式。當(dāng)采用DO-stat 補(bǔ)料模式時(shí)，先通過調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速將溶氧控制在30%以上，補(bǔ)料時(shí)流加補(bǔ)料培養(yǎng)基將溶氧控制在30%以下；當(dāng)采用恒速補(bǔ)料模式時(shí)，補(bǔ)料培養(yǎng)基的流加速率為20 mL/h，整個(gè)發(fā)酵周期為37 h（見圖5（a），（b））。

1.3 工程菌株的構(gòu)建

1.3.1 表達(dá)載體的構(gòu)建 結(jié)合The RBS calculator v2.0， 在線預(yù)測(cè)得到了3 組不同強(qiáng)度的RBS 序列，如表3 中斜體部分所示[20]。 以RBS-Si(i: L, M, H)/RBS-A 為引物 對(duì)，pET-28a-eGFP 為模板， 擴(kuò)增eGFP基因。分別使用限制性內(nèi)切酶XbaI 和XhoI 對(duì)表達(dá)載體pETM6R1 和經(jīng)瓊脂糖凝膠回收的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切。 酶切產(chǎn)物純化后用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至E. coliJM109 中，得到表達(dá)載體pETM6R1 -RBSL-GFP、pETM6R1 -RBSM-GFP、pETM6R1-RBSH-GFP。

以E. coliK4 基因組為模板，引物對(duì)KZ-glmMS/KZ-glmM-A 和KZ-glmS-S/KZ-glmS-A （表3）分別擴(kuò)增基因glmM和glmS。 分別使用限制性內(nèi)切酶BamHI 和XhoI 對(duì)表達(dá)載體pTrcHisA 和經(jīng)瓊脂糖凝膠回收的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切。 酶切產(chǎn)物純化后用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接， 轉(zhuǎn)化至E. coliJM109中， 得到表達(dá)載體pTrcHisA-glmM、pTrcHisA-glmS。

以E.coliK4 基因組為模板， 引物對(duì)RHglmM-S/RH-glmM-A 和RH-glmS-S/RH-glmS-A（表3）分別擴(kuò)增基因glmM和glmS。然后以glmM 和glmS 為模板，引物對(duì)RH-glmM-S/RH-glmS-A 進(jìn)行融合PCR 得到融合蛋白glmM-glmS，融合蛋白通過寡肽連接子“GGGS”相連[21]。

以融合蛋白glmM-glmS 為模板， 引物對(duì)LglmM -glmS -S/glmM -glmS -A，M -glmM -glmS -S/glmM-glmS-A，H-glmM-glmS-S/glmM-glmS-A PCR擴(kuò)增得到不同表達(dá)強(qiáng)度的融合蛋白glmM-glmS。 分別使用限制性內(nèi)切酶XbaI 和XhoI 對(duì)表達(dá)載體pETM6R1 和經(jīng)瓊脂糖凝膠回收的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物純化后用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至E. coliJM109 中，得到表達(dá)載體pETM6R1-L -glmM -glmS，pETM6R1 -M -glmM -glmS 和pETM6R1-H-glmM-glmS（圖2）。

表3 本研究中所用的引物Table 3 Primers used in this study

圖2 表達(dá)載體的構(gòu)建過程Fig. 2 Process of constructing expression vector

1.3.2 E. coli K4 的轉(zhuǎn)化與重組子的鑒定 E. coli K4 的轉(zhuǎn)化采用電擊轉(zhuǎn)化方式，轉(zhuǎn)化后涂布于含100 mg/mL 氨芐青霉素的篩選平板，挑選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR 驗(yàn)證。 獲得工程菌株E. coli K4-RBSL-GFP、E. coli K4-RBSM-GFP、E. coli K4-RBSH-GFP、E. coli K4-glmM，E. coli K4-glmS，E.coli K4-glmM-glmS，E. coli K4-L-glmM-glmS，E.coli K4-M-glmM-glmS，E. coli K4-H-glmM-glmS。

1.4 果糖軟骨素的定量檢測(cè)

1.4.1 GFP 表達(dá)檢測(cè) 菌體在用0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后，每隔2 h 檢測(cè)一次熒光密度的測(cè)定，具體方法參照Gao et al., 2017[22]。

1.4.2 果糖軟骨素的定量檢測(cè) 采用硫酸咔唑法測(cè)量果糖軟骨素的產(chǎn)量[23]。 發(fā)酵液在10000 r/min條件下離心5 min，取上清液加入一定量乙醇，過夜放置，沉淀雜質(zhì)，離心去除樣品上清液，適當(dāng)烘干去除乙醇后，加入1 mL 超純水復(fù)溶；在冰浴的25 mL具塞比色試管中加入配置好的5 mL 硼酸鹽硫酸溶液（25 mmol/L 四硼酸鈉），再加入1 mL 經(jīng)超純水復(fù)溶的樣品混勻，沸水浴10 min 后冰浴冷卻。 向冷卻的試管中加入100 μL 咔唑-乙醇試劑（0.125 g/dL）混勻，沸水浴15 min 后冰浴冷卻；以超純水為空白對(duì)照，50 mg/L D-葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，按上述方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，再進(jìn)行濃度換算。

2結(jié)果與分析

2.1 路徑酶GlmM、GlmS 的過量表達(dá)對(duì)果糖軟骨素合成的影響

通過在E. coli K4 中表達(dá)磷酸葡糖胺變位酶GlmM 獲得了重組菌株E. coli K4-glmM， 果糖軟骨素的產(chǎn)量、單位細(xì)胞的生產(chǎn)能力、單位甘油的生產(chǎn)能力分別達(dá)到了138.71 mg/L、57.09 mgK4CPS/gDCW、9.96 mgK4CPS/g甘油，較對(duì)照菌株E. coli K4 分別提高了35.98%、42.12%、45.19%（圖3）。 該結(jié)果表明，在胞質(zhì)中過量表達(dá)GlmM 能將更多的碳流導(dǎo)向UDPGalNAc，進(jìn)而提高果糖軟骨素的產(chǎn)量。

通過在E. coli K4 中表達(dá)葡萄糖胺合酶（GlmS）獲得了重組菌株E. coli K4-glmS 中，果糖軟骨素的產(chǎn)量、單位細(xì)胞的生產(chǎn)能力、單位甘油的生產(chǎn)能力分 別 達(dá) 到 了153.63 mg/L、61.86 mgK4CPS/gDCW、10.21 mgK4CPS/g甘油，較重組菌株E. coli K4-glmM 分別提高了10.77%、8.36%、2.51%（圖3）。 該結(jié)果表明，在胞質(zhì)中過量表達(dá)GlmS 能夠有效的疏導(dǎo)碳流至UDPGalNAc，從而提高了果糖軟骨素的產(chǎn)量。

為了增強(qiáng)Fru-6-P 到UDP-GalNAc 的轉(zhuǎn)化效率，構(gòu)建了融合蛋白glmM-glmS，并在野生型E. coli K4 中進(jìn)行過量表達(dá)。 結(jié)果表明， 重組菌株E. coli K4-glmM-glmS 的果糖軟骨素生產(chǎn)能力獲得了較大幅度的提高，達(dá)到了191.23 mg/L，較E. coli K4 和E. coli-glmS 分別提高了87.48%和24.47%（圖3）。該結(jié)果表明， 融合蛋白glmM-glmS 能夠?qū)⒏嗟腇ru-6-P 代謝流導(dǎo)向前體UDP-GalNAc， 從而強(qiáng)化了進(jìn)入果糖軟骨素的碳流。

圖3 工程菌株搖瓶發(fā)酵結(jié)果Fig. 3 Fermentation of engineered strains in shake flask

2.2 融合蛋白glmM-glmS 的表達(dá)水平對(duì)果糖軟骨素合成的影響

為了進(jìn)一步精細(xì)化控制果糖軟骨素合成路徑，通過優(yōu)化融合蛋白glmM-glmS 的表達(dá)水平，提高果糖軟骨素的生物合成能力。 首先，實(shí)驗(yàn)得到的相對(duì)熒光強(qiáng)度分別與預(yù)測(cè)的RBS 序列強(qiáng)度一致（圖4）。通過在引物上添加不同強(qiáng)度的RBS 序列得到不同表達(dá)水平的融合蛋白glmM-glmS，成功構(gòu)建了3 株工程菌株E. coliK4-L-glmM-glmS、E. coliK4-MglmM-glmS、E. coliK4-H-glmM-glmS。

重組菌株E. coliK4-L-glmM-glmS 的果糖軟骨素的生產(chǎn)能力和單位細(xì)胞生產(chǎn)K4CPS 的能力為103.54 mg/L 和46.87 mgK4CPS/gDCW，較對(duì)照菌株E. coliK4-glmM-glmS 下降了45.86%和35.42%。表明低強(qiáng)度的融合蛋白glmM-glmS 不能有效地提高果糖軟骨素的產(chǎn)量。 然而，重組菌株E. coliK4-M-glmMglmS 和E. coliK4-H-glmM-glmS 搖瓶發(fā)酵，果糖軟骨素的產(chǎn)量分別為200.21 mg/L 和334.50 mg/L，較重組菌株E. coliK4-glmM-glmS 分別提高了4.70%、74.92%。 重組菌株E.coliK4-H-glmM-glmS 單位細(xì)胞生產(chǎn)K4CPS 的能力和單位甘油生產(chǎn)K4CPS 的能力分別為114.67 mgK4CPS/gDCW和21.42 mgK4CPS/g甘油，較菌株E. coliK4-glmM-glmS 分別提高了58.80%和69.33%（見表4）。 上述結(jié)果表明， 優(yōu)化融合蛋白glmM-glmS 的起始翻譯速率能夠提高融合蛋白的表達(dá)強(qiáng)度，進(jìn)而強(qiáng)化了果糖軟骨素的合成能力。

圖4 RBS 序列表達(dá)水平的確定Fig. 4 The expression level of RBS sequence

表4 菌株搖瓶發(fā)酵參數(shù)Table 4 The fermentation parameters of engineered strains in shake flask

2.3 誘導(dǎo)策略對(duì)果糖軟骨素產(chǎn)量的影響

為了高效表達(dá)融合蛋白glmM-glmS，借助工程菌株E. coliK4-H-glmM-glmS， 優(yōu)化了誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑濃度。 首先研究了誘導(dǎo)劑IPTG 的濃度對(duì)菌株E. coliK4-H-glmM-glmS 生產(chǎn)果糖軟骨素的影響，結(jié)果如圖5（a）所示。 隨著誘導(dǎo)劑濃度的不斷提高，果糖軟骨素的合成能力不斷增強(qiáng)。 當(dāng)IPTG 濃度為0.4 mmol/L 時(shí)，果糖軟骨素合成能力最強(qiáng)，達(dá)到了340.25 mg/L，當(dāng)超過0.4 mmol/L 時(shí)，K4CPS 的合成能力不斷減弱，并且菌體生長(zhǎng)受到抑制。

其次研究了誘導(dǎo)溫度對(duì)菌株E. coliK4-HglmM-glmS 生產(chǎn)果糖軟骨素的影響，結(jié)果如圖5（b）所示。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為25 ℃時(shí)，K4CPS 合成能力最弱，此時(shí)的OD600為5.32，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為37 ℃時(shí)，K4CPS的合成能力最強(qiáng)，達(dá)到了340.25 mg/L，菌體OD600為7.08，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為42 ℃時(shí)，K4CPS 產(chǎn)量開始下降。上述結(jié)果表明最佳IPTG 濃度和誘導(dǎo)溫度分別為0.4 mmol/L 和37 ℃。

圖5 誘導(dǎo)策略對(duì)菌體生長(zhǎng)和K4CPS 生產(chǎn)的影響Fig. 5 Effects of induction strategy on cell growth and production of K4CPS

圖6 補(bǔ)料模式對(duì)菌株生長(zhǎng)和K4CPS 生產(chǎn)的影響Fig. 6 Effects of feeding mode on cell growth and production of K4CPS.

2.45 L 罐補(bǔ)料分批發(fā)酵

為了進(jìn)一步提高果糖軟骨素的產(chǎn)量，將最優(yōu)工程菌株E. coli K4-H-glmM-glmS 在5-L 發(fā)酵罐上的2 種補(bǔ)料策略優(yōu)化， 即DO-stat 補(bǔ)料模式和恒速補(bǔ)料模式（圖6）。

采用恒速補(bǔ)料策略，發(fā)酵36 h，工程菌株E. coli K4-H-glmM-glmS 的OD600達(dá)到了90.4，K4CPS 的產(chǎn)量、單位細(xì)胞的生產(chǎn)能力和甘油的生產(chǎn)能力分別為為3.39 g/L、91.02 mgK4CPS/gDCW和21.05 mgK4CPS/g甘油，采用DO-stat 補(bǔ)料策略，發(fā)酵37 h，工程菌株E. coli K4-H-glmM-glmS 的OD600達(dá)到了76.4， 較恒速補(bǔ)料策略降低了15.48%；K4CPS 的產(chǎn)量、 單位細(xì)胞的生產(chǎn)能力和甘油的生產(chǎn)能力分別為3.99 g/L、126.12 mgK4CPS/gDCW和29.01 mgK4CPS/g甘油，較恒速補(bǔ)料策略分別提高了17.70%、38.56%和37.81%（見表5）。 此結(jié)果表明，DO-stat 補(bǔ)料模式有利于菌株生產(chǎn)K4CPS，而恒速補(bǔ)料模式更有利于菌體生長(zhǎng)。

2.5 討論

表5 工程菌株E. coli K4-H-glmM-glmS 在不同補(bǔ)料模式下的發(fā)酵情況Table 5 The fermentation parameters of E. coli K4-H-glmM-glmS in the 5 L fermentor

利用果糖軟骨素生產(chǎn)菌株E. coli K4 作為代謝改造的宿主，由于代謝路徑之間的競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致果糖軟骨素的產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)強(qiáng)度較低。 本文以野生型E. coli K4 為出發(fā)菌株， 在原有代謝路徑的基礎(chǔ)之上，分別研究了過量表達(dá)glmM、glmS，結(jié)果表明果糖軟骨素的產(chǎn)量較野生型菌株均有所提高。

果糖軟骨素生物合成路徑中關(guān)鍵酶的融合不僅能夠避免多步代謝路徑中競(jìng)爭(zhēng)性酶對(duì)底物的降解與轉(zhuǎn)化，而且蛋白質(zhì)復(fù)合體的形成能夠拉近不同活性中心位點(diǎn)的空間距離、有利于形成更加有效地底物傳輸通道[21]。 此外，研究還表明，蛋白質(zhì)復(fù)合體的形成可以阻止底物和某些中間代謝物的降解進(jìn)而提高特殊代謝路徑的效率[24]。 關(guān)鍵酶融合表達(dá)策略廣泛用于富馬酸、次丹參酮二烯的生物合成[21，25]。

目標(biāo)產(chǎn)物的合成與微生物的生長(zhǎng)息息相關(guān)。 在搖瓶發(fā)酵過程中，果糖軟骨素的產(chǎn)量與菌株的生物量呈現(xiàn)正相關(guān)性。 最優(yōu)菌株E. coli K4-H-glmMglmS 果糖軟骨素的產(chǎn)量與生物量達(dá)到最大時(shí)，與野生型菌株E. coli K4 相比， 分別提高了227.94%、14.96%。 可能的原因是果糖軟骨素屬于一種莢膜多糖，在菌株細(xì)胞生長(zhǎng)的過程中進(jìn)行釋放，但是莢膜多糖的生物合成受生長(zhǎng)條件和環(huán)境條件嚴(yán)格調(diào)控[12]。重構(gòu)微生物代謝路徑可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)延滯以及中間代謝物積累，進(jìn)而減弱目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成[26-27]。 因此，需要對(duì)代謝路徑上關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化。 為了解決上述問題，一些路徑優(yōu)化的代謝工程策略也應(yīng)運(yùn)而生。本研究通過控制RBS 序列調(diào)控融合蛋白的起始翻譯速率，從而控制融合蛋白的表達(dá)水平。 除RBS 調(diào)控策略外，還有一些常用于路徑優(yōu)化的方法：?jiǎn)?dòng)子工程，通過構(gòu)建廣泛的啟動(dòng)子庫精細(xì)化調(diào)控基因的表達(dá)，替換啟動(dòng)子提高限速步驟酶的表達(dá)[28-29]； 蛋白質(zhì)工程， 包括采用易錯(cuò)PCR、 點(diǎn)突變和交叉延伸技術(shù)改變底物結(jié)合口袋和蛋白編碼序列的方式實(shí)現(xiàn)酶活力的提高[30]。

3結(jié) 語

作者利用代謝工程策略構(gòu)建了工程菌株E. coli K4-H-glmM-glmS，確定了最優(yōu)誘導(dǎo)劑溫度、誘導(dǎo)劑濃度分別為37 ℃和0.4 mmol/L，此時(shí)搖瓶水平果糖軟骨素產(chǎn)量達(dá)到了340.25 mg/L。在最優(yōu)條件下，5-L發(fā)酵罐采用DO-stat 補(bǔ)料策略， 果糖軟骨素的產(chǎn)量達(dá)到了3.99 g/L, 較原始菌株提高了108.9%， 為工業(yè)化生產(chǎn)果糖軟骨素奠定了基礎(chǔ)。 在后續(xù)的研究中，我們計(jì)劃同時(shí)強(qiáng)化軟骨素前體合成路徑，并且采用模塊路徑工程策略組合優(yōu)化前體合成路徑和聚合路徑關(guān)鍵酶的表達(dá)。