李文帥,武國瑞,張茜菁,岳愛琴,杜維俊,趙晉忠,劉定斌

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院,2.農(nóng)學(xué)院,太谷 030800;3.南開大學(xué)化學(xué)學(xué)院,藥物化學(xué)生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300350)

拉曼光譜(Raman spectroscopy)是一種散射光譜,其基于拉曼散射效應(yīng),將光束照射到被檢測物上,光子與被檢測物相互作用產(chǎn)生散射光,通過測量分子振動或轉(zhuǎn)動能級差的特征頻移來反映物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和成分[1].拉曼光譜又稱作分子“指紋”光譜,能夠?qū)悠愤M(jìn)行原位、 非侵入、 無標(biāo)記檢測,應(yīng)用范圍涉及化學(xué)、 物理學(xué)、 生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域,對于定性分析、 定量分析和分子結(jié)構(gòu)測定均具有較大應(yīng)用價值[2].

細(xì)菌是自然界中數(shù)量最多、 分布最廣、 形態(tài)多樣且具有特殊結(jié)構(gòu)的一類微生物.經(jīng)過長期的自然演變,細(xì)菌與各物種之間建立了復(fù)雜的拮抗或共生關(guān)系[3].細(xì)菌不僅會引起寄主發(fā)生某些特定疾病,還能作為條件致病菌,當(dāng)宿主免疫力低下、 機(jī)體屏障被破壞時發(fā)生菌群失調(diào)或細(xì)菌移位,從而釋放多種毒力因子,造成機(jī)體的嚴(yán)重感染[4,5].隨著抗生素應(yīng)用日益增多,細(xì)菌耐藥性問題日趨嚴(yán)重,細(xì)菌性疾病治療失敗率升高,導(dǎo)致發(fā)病率和病死率增高以及用藥費(fèi)用增加.當(dāng)前,細(xì)菌耐藥已經(jīng)成為全球公共健康領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn),也是各國政府和社會廣泛關(guān)注的世界性難題[6].

目前,拉曼光譜在細(xì)菌檢測領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用,能夠進(jìn)行快速、 簡單、 可重復(fù)且無損傷的定性定量分析.本文將拉曼光譜在細(xì)菌檢測領(lǐng)域的應(yīng)用分為以下3個方面: (1) 鑒別細(xì)菌表面特異性分子,直接獲取細(xì)菌拉曼光譜信息,簡單快速實(shí)現(xiàn)細(xì)菌分型; (2) 依賴不同種類細(xì)菌的代謝和生理差異,通過檢測細(xì)菌攝取和代謝物質(zhì)間接實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的鑒別; (3) 借助具有靶向性的貴金屬納米探針,顯著提升細(xì)菌檢測的靈敏度和分辨率.拉曼光譜檢測憑借其高特異性、 無需樣本處理的優(yōu)勢,在臨床檢測、 工業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境監(jiān)測等方面顯示出巨大發(fā)展?jié)摿?

1 拉曼光譜檢測的原理及應(yīng)用

拉曼散射是由光照射到物質(zhì)表面引發(fā)的非彈性散射現(xiàn)象.如圖1所示,當(dāng)單色光束的入射光光子與被檢測物分子相互作用時,可同時產(chǎn)生彈性碰撞和非彈性碰撞,在彈性碰撞過程中,光子運(yùn)動方向改變而頻率不變,且光子與被檢測物分子不發(fā)生能量交換,這種散射叫做瑞利散射; 而在非彈性碰撞過程中,光子與被檢測分子進(jìn)行了能量交換,在光子改變運(yùn)動方向的同時,其一部分能量傳遞給被檢測分子(斯托克斯散射),或者被檢測分子的振動和轉(zhuǎn)動能量傳遞給光子(反斯托克斯散射),從而改變了光子的頻率,這種散射就叫作拉曼散射[7].

Fig.1 Rayleigh(elastic) and Raman(inelastic) scattering at a molecule,and scattering intensity dependence on the wavelength of the scattered light(for ease of comparison,the scattering intensity is arbitrarily set to 1 at a wavelength of 532 nm)[7] Copyright 2013,Annual Reviews.

拉曼檢測技術(shù)的發(fā)展存在二次重大變革.由于拉曼散射光子數(shù)約為瑞利散射的千分之一,導(dǎo)致拉曼檢測的信號極其微弱,研究初期甚至難以得到一張較為完整的拉曼譜圖.上個世紀(jì)60年代激光器的問世為拉曼檢測提供了具有優(yōu)異單色性、 方向性、 亮度高以及相干性好的光源,顯著提高了檢測靈敏度,縮短了信號采集時間.此外,1974年Fleischmann等[8]發(fā)現(xiàn)吸附在粗糙Ag電極表面的吡啶分子具有顯著的拉曼散射效應(yīng),加之活性載體表面選擇吸附分子對熒光發(fā)射的抑制,使激光拉曼光譜分析的信噪比大大提高,表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface-enhanced Raman scattering,SERS)技術(shù)就此誕生(圖2).利用在可見光-近紅外波段具有很強(qiáng)表面等離激元共振效應(yīng)的Ag及Au等納米結(jié)構(gòu),可顯著增強(qiáng)吸附在納米結(jié)構(gòu)表面分子的拉曼信號,從而以超高檢測靈敏度獲得樣品自身的指紋特征.納米科技的迅猛發(fā)展促進(jìn)了SERS和針尖增強(qiáng)拉曼光譜(Tip enhanced Raman scattering,TERS)的發(fā)展,推動其在高靈敏甚至單分子水平檢測方面的應(yīng)用[9～11].目前,最常用的拉曼檢測技術(shù)可分為顯微共聚焦拉曼光譜技術(shù)、 表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)、 共振增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)和傅里葉變換拉曼光譜技術(shù).

Fig.2 Representative electric field distribution of SERS-active Au nanoparticles Note that the SERS “hot-spot” is generated in the gap between two closely arranged nanoparticles(A)[9],and collective oscillations of electrons in a spherical nanoparticle under the action of the external electric field(B)[10].(A) Copyright 2018,Wiley-VCH;(B) Copyright 2017,MDPI.

拉曼光譜技術(shù)因其制樣簡單、 檢測快速、 信息豐富及可在水溶液中測試等優(yōu)勢,而在化學(xué)、 物理、 高分子材料、 生物、 醫(yī)藥與地質(zhì)等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用.(1) 在有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域,拉曼光譜主要作為分子結(jié)構(gòu)鑒定的手段.拉曼位移的大小、 強(qiáng)度及拉曼峰的形狀是表征化學(xué)鍵、 官能團(tuán)的重要依據(jù).值得一提的是,利用拉曼光譜的偏振特性還可判別物質(zhì)的順反式結(jié)構(gòu).與紅外光譜互為補(bǔ)充,可以鑒別特殊的結(jié)構(gòu)特征或特征基團(tuán)[12～14].(2) 在無機(jī)化學(xué)領(lǐng)域,金屬離子與配體形成的共價鍵通常具有拉曼活性,通過拉曼光譜檢測可得到其配位化合物的組成、 結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性等信息[15].(3) 在催化化學(xué)領(lǐng)域,拉曼光譜可以實(shí)時監(jiān)測反應(yīng)過程中各種物質(zhì)的動態(tài)變化[16].(4) 在電化學(xué)領(lǐng)域,拉曼光譜是研究電極/溶液界面結(jié)構(gòu)和性能的重要手段,有利于在分子層面研究電化學(xué)界面結(jié)構(gòu)、 吸附和反應(yīng)等基礎(chǔ)問題[17～20].(5) 在高分子材料領(lǐng)域,拉曼光譜可以提供聚合物材料結(jié)構(gòu)信息.在確定異構(gòu)體的研究中具有其獨(dú)特的作用,且拉曼譜峰的寬度可以直接反映高分子材料的純度[21].(6) 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,拉曼光譜是研究生物大分子的有力手段,由于水幾乎沒有拉曼峰,被檢測物可以在自然狀態(tài)下直接進(jìn)行研究和檢測,無光漂白,能實(shí)時監(jiān)測生物大分子的結(jié)構(gòu)及其變化,包括蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊、 無規(guī)卷曲及β-回轉(zhuǎn))、 蛋白質(zhì)主鏈及側(cè)鏈構(gòu)像(酰胺Ⅰ和Ⅲ,C—C,C—N伸縮振動)、 脂類和核酸[22～25]等.(7) 在中草藥研究領(lǐng)域,可應(yīng)用于中草藥化學(xué)成分分析、 中草藥的無損鑒別、 中草藥的穩(wěn)定性研究(監(jiān)測藥物衰敗過程)以及藥理研究[26].(8) 在寶石和文物的研究和鑒定領(lǐng)域,拉曼光譜能夠快速、 無損鑒定寶石的類別和純度,或在文物鑒定過程中提供科學(xué)依據(jù)[27].

拉曼光譜的產(chǎn)生是入射光子與被測分子相互碰撞時,分子的振動能量或轉(zhuǎn)動能量與光子能量疊加的結(jié)果,利用拉曼光譜可以把處于紅外區(qū)的分子能譜轉(zhuǎn)移至可見光區(qū)來觀測.因此,拉曼光譜作為紅外光譜的補(bǔ)充,是研究分子結(jié)構(gòu)的有力武器.其優(yōu)勢體現(xiàn)在用拉曼光譜研究水溶液比較方便,而生命科學(xué)的許多研究通常需要水溶液環(huán)境.與經(jīng)典的熒光分析方法相比,拉曼光譜沒有光漂白現(xiàn)象,其信號產(chǎn)生不受復(fù)雜生理環(huán)境的影響,無需進(jìn)行樣品前處理,可直接在水或生物流體中檢測,能進(jìn)行多靶標(biāo)同時檢測和單分子檢測.共振拉曼光譜、 表面增強(qiáng)拉曼光譜和非線性拉曼光譜及其聯(lián)用將成為生命科學(xué)前沿領(lǐng)域的重要研究方法.

2 細(xì)菌檢測的意義及現(xiàn)狀

細(xì)菌最早是由荷蘭人列文虎克在一位從未刷過牙的老人牙垢上發(fā)現(xiàn)的,隨后由德國科學(xué)家埃倫伯格在1828年命名.細(xì)菌按形狀可分為球菌、 桿菌以及螺旋菌.在人類活動過程中細(xì)菌扮演著不同的角色: 一方面,細(xì)菌是許多疾病的病原體,包括肺結(jié)核、 淋病、 炭疽病、 梅毒、 鼠疫和沙眼等; 另一方面,人類也利用細(xì)菌進(jìn)行乳酪和酸奶等發(fā)酵食物的制作、 抗生素的生產(chǎn)以及廢料、 廢水的處理等.細(xì)菌廣泛分布于土壤和水中,也可寄生或者與其它生物共生.人體內(nèi)及表皮上的細(xì)菌總數(shù)約是人體細(xì)胞總數(shù)的10倍[28].很多細(xì)菌均具有致病性,在宿主免疫力低下、 機(jī)體屏障功能被破壞時,宿主就會被細(xì)菌感染.革蘭氏陰性菌通過鞭毛的運(yùn)動,黏附、 定植在宿主細(xì)胞表面,進(jìn)而通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)將毒力蛋白轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞,造成機(jī)體感染.革蘭氏陽性菌及部分革蘭氏陰性菌能夠分泌致病性強(qiáng)、 致死性強(qiáng)和組織親和性高的可溶性蛋白質(zhì),可侵入人體特定的器官和組織,進(jìn)而在機(jī)體內(nèi)環(huán)境中擴(kuò)散,激活T淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子,造成不同程度的臨床癥狀和病變[29].最常見的致病菌為革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌、 化膿性鏈球菌、 肺炎鏈球菌,以及革蘭氏陰性的如大腸桿菌、 流感嗜血桿菌等.細(xì)菌感染是導(dǎo)致發(fā)病和死亡的主要原因,是幾乎所有醫(yī)學(xué)學(xué)科中最常見的問題.由于人口日益老齡化引起的平均免疫力降低,不斷增加的生物材料、 生物制劑的需求及更加頻繁的器官移植,尤其是細(xì)菌對抗生素的抗藥性增強(qiáng),均導(dǎo)致細(xì)菌感染發(fā)病率不斷上升.迄今,抗菌藥物耐藥性(Antimicrobial resistance,AMR)已成為 21 世紀(jì)主要的公共衛(wèi)生健康問題,是對人類健康的最大威脅之一[30].在過去50年里,臨床醫(yī)學(xué)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中濫用抗生素加速了細(xì)菌耐藥性的傳播,導(dǎo)致全球每年有超過70萬人死亡,醫(yī)療費(fèi)用和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)每年增加350億美元.預(yù)計到2050年,每年死于耐藥菌感染的人數(shù)將增加到1000萬人,花費(fèi)約100萬億美元[31].細(xì)菌檢測對現(xiàn)代醫(yī)療實(shí)踐至關(guān)重要,快速診斷耐藥感染和藥敏試驗(yàn)(Antimicrobial susceptibility test,AST)是正確使用抗生素的保證,也是減緩細(xì)菌耐藥性蔓延的重要途徑.體外抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)是指在體外測定藥物抑菌或殺菌能力的實(shí)驗(yàn)方法,主要有紙片擴(kuò)散法、 稀釋法(包括瓊脂和肉湯稀釋法)、 抗生素濃度梯度法(E-test法)和自動化儀器法等[32].

目前,科學(xué)家已開發(fā)出多種細(xì)菌檢測新技術(shù),如質(zhì)譜分析法[33,34]、 聚合酶連鎖反應(yīng)[35,36]及熒光原位雜交技術(shù)[37,38]等,并將其廣泛用于微生物的表型鑒定,但這些檢測方法存在成本高、 操作復(fù)雜、 對操作者要求較高及耗時長等缺點(diǎn)[39,40].因此,傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)和表型鑒定技術(shù)依然占據(jù)主導(dǎo)地位,但其缺點(diǎn)在于: (1) 細(xì)菌培養(yǎng)耗時長(24～72 h),在臨床上往往錯過最佳治療時間.例如,在膿毒性休克患者中,有效的抗生素治療每推遲1 h存活率將下降7.6%[41].(2) 對于某些厭氧菌和難以體外培養(yǎng)的致病菌,將無法進(jìn)行鑒定.因此,開發(fā)快速、 準(zhǔn)確的細(xì)菌鑒定新技術(shù)尤為緊迫.拉曼光譜具備無損檢測、 高分辨、 無需細(xì)菌培養(yǎng)、 制樣簡單和檢測速度快等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)成為了一種非常有效的細(xì)菌檢測方法.拉曼光譜相比于熒光分析具備無損檢測的特性,可對細(xì)菌特定的生理過程進(jìn)行監(jiān)測,為細(xì)菌異質(zhì)性研究和細(xì)菌感染治療提供了技術(shù)手段.在日常的生產(chǎn)生活中,可借助手持拉曼儀對細(xì)菌進(jìn)行檢測,通過對比細(xì)菌拉曼光譜數(shù)據(jù)庫得到檢測報告,無需昂貴的設(shè)備和專業(yè)的測試人員,真正實(shí)現(xiàn)簡單、 快速的細(xì)菌檢測.

3 拉曼光譜檢測細(xì)菌的3種方式

3.1 無標(biāo)記拉曼光譜檢測細(xì)菌表面特異性分子

細(xì)菌的外膜攜帶著與菌株生長、 刺激表達(dá)、 甚至地理差異有關(guān)的特定分子信息.在拉曼光譜發(fā)展的早期階段,就有學(xué)者陸續(xù)報道了多種生物分子的拉曼信號.Bronk等[42]首次報道了細(xì)菌的SERS譜圖,顯示革蘭氏陰性菌和陽性菌細(xì)胞表面的SERS信號存在差異,正式開啟了利用拉曼光譜技術(shù)檢測細(xì)菌的研究(圖3).

Fig.3 Exemplary SERS spectra of Gram-negative(a) and Gram-positive(b) bacterial cells[42] Copyright 2002,Elservier.

Fig.4 Difference in Raman spectra of sulfur bacteria(a) and sulfur-deficient bacteria(b)[45] Copyright 2015,Oxford University Press.

由于細(xì)菌表面化學(xué)成分存在差異,直接利用細(xì)菌的原位檢測信號來鑒別細(xì)菌無疑是最直接和理想的方法.但是,直接檢測細(xì)菌表面拉曼信號弱,峰多且峰形、 峰位相近,裸眼區(qū)別率低,無法獲得理想的鑒別效果.況且,同種屬細(xì)菌的拉曼信號亦有差別,如Maquelin等[46]將腐生葡萄球菌在波數(shù)1180～1090 cm-1處的拉曼峰指認(rèn)為蛋白質(zhì)的信號; 而對于表皮葡萄球菌,更多是DNA和RNA的分子振動.同時,不同的培養(yǎng)條件和拉曼測試方法獲得的細(xì)菌拉曼光譜也存在明顯差異.細(xì)菌的拉曼譜圖包含了細(xì)菌所有組成成分的振動光譜信息,當(dāng)所處的環(huán)境狀態(tài)發(fā)生改變時,會影響拉曼光譜的重現(xiàn)性.若測定對象為單個菌落時,單菌落的異質(zhì)性也會影響結(jié)果的重現(xiàn)性.Choo-Smith等[47]分別研究了培養(yǎng)6,10和24 h的菌落,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)6 h的菌落不存在異質(zhì)性.Kunapareddy等[48]利用多波長共振拉曼光譜研究了培養(yǎng)條件對細(xì)菌分類結(jié)果的影響,發(fā)現(xiàn)檢測對數(shù)生長期的細(xì)菌比穩(wěn)定期的更容易得到正確結(jié)果.培養(yǎng)基中金屬離子發(fā)生改變會使細(xì)菌表面化合物的空間構(gòu)型發(fā)生變化,造成其拉曼信號發(fā)生偏移[49～51],從而導(dǎo)致細(xì)菌的直接拉曼檢測結(jié)果重復(fù)率低、 應(yīng)用范圍較窄.

新型SERS基底的開發(fā)是增強(qiáng)拉曼信號的主要手段,通過優(yōu)化細(xì)菌拉曼檢測的基底,使之在拉曼激發(fā)波段內(nèi)樣品表面附近的電磁場增強(qiáng),從而使細(xì)菌表面分子的拉曼散射信號顯著增強(qiáng).常用的方法是在細(xì)菌外表面沉積納米金/銀膠體顆粒,從而產(chǎn)生SERS增強(qiáng)信號[52](圖5).Christian等[53]發(fā)現(xiàn),幾種與外傷感染相關(guān)的細(xì)菌細(xì)胞壁的表面生物結(jié)構(gòu)能夠引起單色光頻率變化.通常在水溶液環(huán)境中,親水的金黃色葡萄球菌和鮑曼不動桿菌很容易測得穩(wěn)定的拉曼光譜.而對于疏水性的綠膿假單胞菌、 肺炎克雷伯菌和大腸桿菌則需要通過比較拉曼峰的強(qiáng)弱進(jìn)行分類鑒別.

Fig.5 Schematic display of different approaches for SERS based detection of bacteria Whole cells can be measured on a solid substrate(A) or in a colloid suspension(B) and it is also possible to attach or deposit metallic nanoparticles directly on the bacterial cell wall(C) or to apply with SERS tags(D)[52]Copyright 2015,Elsevier.

由于磁性基底具有樣品富集功能,其與拉曼增強(qiáng)基底結(jié)合,在痕量檢測方面獲得了廣泛關(guān)注.如Silva等[54]制備了多功能的電磁等離子體Fe3O4-Au核殼納米粒子,通過施加外部磁場,在快速濃縮細(xì)菌樣本的同時顯著增強(qiáng)了細(xì)菌表面拉曼信號,提高了細(xì)菌檢測的靈敏度.該技術(shù)使用3 g/mL的Au-MNPs探針可在5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對10 μL 105 cfu/mL細(xì)菌樣本的捕獲.Wang等[55]提出了電化學(xué)表面增強(qiáng)拉曼光譜(EC-SERS)技術(shù),將金納米粒子沉積到ITO電極表面,在電場驅(qū)動下細(xì)菌可聚焦到電極附近,使其拉曼信號被金納米粒子增強(qiáng).通過對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行多種抗生素刺激,實(shí)現(xiàn)了2種細(xì)菌的藥敏檢測(圖6).

Fig.6 Schematics of the condensation process of Au-MNPs and bacteria(left) and the biomolecular characteristics of the bacterial cell wall that can possibly be detected by SERS(right)(A)[54] and schematic illustration for bacteria detection by using nanostructured Au based biosensor(B)[55] (A) Copyright 2019,Elsevier; (B) Copyright 2014,American Chemical Society.

3.2 拉曼光譜檢測細(xì)菌特異性代謝物

細(xì)菌的代謝方式繁多,根據(jù)其營養(yǎng)方式可分為自養(yǎng)型和異養(yǎng)型.部分細(xì)菌只需要二氧化碳作為它們的碳源,或者通過光合作用獲取能量,被稱作自養(yǎng)生物; 其它細(xì)菌依賴于氧化有機(jī)物獲取能量,稱為化能自養(yǎng)生物[56,57].不同的細(xì)菌擁有不同的酶系統(tǒng),在生長過程中對營養(yǎng)物質(zhì)的需求和代謝廢物存在差異,將這些不同化合物的生物化學(xué)差異作為細(xì)菌鑒別的依據(jù),為細(xì)菌鑒別和檢測開辟了一條新途徑.細(xì)菌的糖代謝過程是先將多糖降解成單糖進(jìn)而氧化為丙酮酸,而丙酸酮分解則因菌而異.如,大腸埃希氏菌先將丙酮酸降解成甲酸,進(jìn)而在甲酸解氫酶作用下分解成CO2和H2,而傷寒桿菌只能將丙酮酸轉(zhuǎn)化為甲酸[58,59].完整的蛋白質(zhì)不能直接被菌體吸收,必須先由細(xì)菌的胞外酶把蛋白質(zhì)分解成多肽或氨基酸,才能運(yùn)轉(zhuǎn)通過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)入菌細(xì)胞內(nèi)被利用.細(xì)菌分解蛋白質(zhì)可分為5個階段: 蛋白質(zhì)、 蛋白、 蛋白胨、 多肽和氨基酸.不同細(xì)菌降解蛋白質(zhì)的方式不同,可生成吲哚、 硫化氫和尿素等[60～63].利用細(xì)菌在營養(yǎng)需求和代謝廢物方面的差異,可間接進(jìn)行細(xì)菌鑒別.無標(biāo)記的細(xì)菌特異性代謝產(chǎn)物檢測是最理想的細(xì)菌鑒別手段,但受限于被檢測菌能否產(chǎn)生特異性的代謝產(chǎn)物.Bell等[64]將細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物二甲基二硫化合物(Dimethyl disulfide,DMDS)作為細(xì)菌活性的衡量指標(biāo),先將Au納米薄膜固定在細(xì)菌培養(yǎng)皿內(nèi)蓋上,當(dāng)DMDS吸附到Au納米膜表面即可產(chǎn)生SERS信號,整個過程可以在15 min內(nèi)完成,真正意義上實(shí)現(xiàn)了耐藥細(xì)菌的快速藥敏檢測.Bodelón等[65]將銅綠假單胞桿菌特異性分泌的綠膿素作為檢測指標(biāo),構(gòu)建全新的Au@pNIPAM SERS增強(qiáng)基底,實(shí)現(xiàn)了對耐藥銅綠假單胞桿菌種群生物膜之間信息傳遞機(jī)制的研究(圖7).

Fig.7 SERS spectra of the headspace(A)[64] and Raman and SERS spectra of pyocyainn(B)[65] (A) Copyright 2018,John Wiley and Sons Ltd.; (B) Copyright 2016,Springer Nature.

利用同位素標(biāo)記待測細(xì)菌是目前進(jìn)行代謝物檢測的主要方式.Cui等[66]將大腸桿菌對重水的攝取能力作為衡量大腸桿菌活力的指標(biāo),只需測定碳氘鍵(C—D)的拉曼譜峰就能監(jiān)測7種纖維素降解菌對羥甲基纖維素的代謝反應(yīng).另外,將固氮細(xì)菌通過15N2培養(yǎng)基培養(yǎng),能夠得到明顯差異的14N2和15N2共振拉曼光譜,其成像結(jié)果表明固氮菌存在明顯的異質(zhì)性[67].在細(xì)菌耐藥性檢測方面,發(fā)展了利用重水標(biāo)記的單細(xì)胞拉曼光譜檢測技術(shù),作為一種快速AST實(shí)驗(yàn)可直接適用于臨床尿樣檢測.從接受尿液到拿到敏感/耐藥(Sensitivity/resistance,S/R)讀數(shù)的總時間縮短到2.5 h,克服了微生物活性檢測與微生物生長緩慢的矛盾,并根據(jù)相對C-D比值建立了一個新的S/R臨界值.這項(xiàng)工作提高了拉曼光譜檢測細(xì)菌耐藥性的臨床實(shí)用性和準(zhǔn)確性[68](圖8).

Fig.8 Probing and Raman imaging of N2-fixing bacteria in artfcial communities(A)[67] and flow chart of rapid Raman drug sensitivity test based on heavy water labeling(B)[68] (A) Copyright 2018,American Chemical Society; (B) Copyright 2019,American Chemical Society.

Huang等[69]將單細(xì)胞拉曼顯微光譜與氘同位素探測(Raman-Deuterium isotope detection)相結(jié)合,以氘代萘作為唯一碳源,運(yùn)用激光共聚焦拉曼光譜對耐藥銅綠假單胞菌進(jìn)行半定量分析并揭示了苯丙氨酸在耐藥銅綠假單胞菌中的代謝過程.Cheng等[70]利用高光譜受激拉曼散射(Stimulated Raman scattering,SRS)成像技術(shù)在單細(xì)胞水平上監(jiān)測活菌對藥物的敏感性,該研究以萬古霉素敏感和耐藥腸球菌為模型,將細(xì)菌對氘化葡萄糖的攝取能力作為細(xì)菌活力指標(biāo),在無需培養(yǎng)的情況下實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌對藥物的敏感性檢測(圖9).

Fig.9 Time lapse of C-D component concentration map in bacteria cultivated in glucose-d7 medium C-D component concentration map in VSE(A) and VRE(B),in the presence and absence of 20 μg/mL vancomycin[70].Copyright 2018,American Chemical Society.

3.3 基于標(biāo)記型拉曼探針的細(xì)菌檢測

無標(biāo)記的SERS活性納米粒子可以直接增強(qiáng)細(xì)菌本身的拉曼指紋譜圖,但在實(shí)際檢測環(huán)境(如尿液、 血液或污水)中選擇性較差,同時缺少標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌拉曼指紋光譜數(shù)據(jù)庫,嚴(yán)重限制了拉曼光譜在細(xì)菌檢測領(lǐng)域的應(yīng)用.將拉曼探針靶向細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞外膜,對待測菌進(jìn)行標(biāo)記是現(xiàn)階段拉曼光譜檢測細(xì)菌的主要手段.與傳統(tǒng)非標(biāo)記探針相比,標(biāo)記型 SERS探針有如下優(yōu)點(diǎn): 靈敏度高,可對痕量物質(zhì)進(jìn)行分析檢測; 無光漂白,可對被標(biāo)記的細(xì)菌進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測以研究更深層的生物學(xué)現(xiàn)象; 可設(shè)計并制備拉曼沉默區(qū)探針,提高檢測信號的信噪比[71,72](圖10).因此,在復(fù)雜介質(zhì)中,為了提高選擇性和檢測限,關(guān)鍵在于發(fā)展專一性和高性能的探針.典型的SERS探針由3部分組成: SERS基底(如AuNPs[73],AgNPs[74]和Au-AgNPs[75]等)、 拉曼報告分子和識別分子.由于金屬納米顆粒暴露的表面很容易結(jié)合生物基質(zhì)中的其它干擾分子,造成不穩(wěn)定的SERS信號,故將各種保護(hù)涂層包裹到貴金屬納米顆粒表面,以提高SERS信號的穩(wěn)定性.目前使用的保護(hù)劑包括聚合物、 脂質(zhì)體和無機(jī)硅層等[76,77].

Fig.10 Schematic illustration of label based and label-free based SERS method for bacteria detection[73] Copyright 2017,Elsevier.

標(biāo)記型SERS探針的信號來源于拉曼報告分子,通常使用含硫或含氮的有機(jī)染料分子,其對Ag和Au基底具有很高的親和力,能夠保證拉曼探針的穩(wěn)定性.目前,4-巰基苯甲酸(4-MBA)[78]、 4-氨基硫酚(4-ATP)[79]、 羅丹明6G(Rh6G)[80]、 4-巰基吡啶(4-MPY)[81]和5,5-二硫雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)[82]已成功應(yīng)用到基于SERS的細(xì)菌檢測中.特別是在拉曼探針中引入拉曼沉默區(qū)報告分子,能夠提高檢測結(jié)果的信噪比,提高對炔基、 氰基染料[83]的檢測靈敏度.

SERS探針的特異性取決于識別分子能否特異性靶向被檢測物,是拉曼檢測準(zhǔn)確性和靈敏度的重要保障.Nguyen等[84]發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞桿菌可排放特異性的鐵載體(Pyoverdine,Pvd),用來富集周圍環(huán)境中的鐵離子,細(xì)菌通過細(xì)胞壁上特異性Pvd受體識別并將負(fù)載鐵離子的Pvd轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中.利用該策略將特異性Pvd固定在鋁箔上,對不同的銅綠假單胞桿菌進(jìn)行捕獲后,直接進(jìn)行拉曼檢測.結(jié)果表明,對耐藥銅綠假單胞桿菌的檢測成功率高達(dá)90.7%,檢測限為5×103cfu/mL(圖11).

Fig.11 Structure of the pyoverdine iron complex of P. fluorescens DSM 50090(A),scheme illustrating the proposed isolation strategy for Pseudomonas spp.(B) and Raman detection of P. fluorescens and P. aeruginosa(C)[84] (B) The (3-glycidyloxypropyl)-trimethoxysilane modified surface(Ⅰ) is functionalized with an pyoverdine iron complex(Ⅱ),subsequently the chip can be used for capturing various Pseudomonas species(Ⅲ).Copyright 2016,American Chemical Society.

Wang等[85]設(shè)計了用于檢測致病菌的雙識別生物傳感器,在金納米粒子表面結(jié)合萬古霉素和核酸適配體對致病菌進(jìn)行雙重識別,顯著提高了探針對細(xì)菌的捕獲率; 同時與Fe3O4磁性納米材料結(jié)合,最低可捕獲3 cfu/mL濃度的細(xì)菌(圖12).

Fig.12 Schematic illustration of the synthesis of Au-Van SERS tags(A),the synthesis of aptamer-modified Fe3O4@AuMNPs(B),and the operating procedure for S. aureus detection via the dual-recognition SERS biosensor(C)[85]Copyright 2019,Elsevier.

Wang等[86]開發(fā)了一種Au包覆磁性納米粒子的新型拉曼基底,將MnFe2O4納米顆粒在超聲作用下均勻組裝到聚乙烯亞胺層上,再通過靜電作用吸附金納米顆粒形成金納米殼,該結(jié)構(gòu)具有極強(qiáng)的SERS活性和強(qiáng)磁響應(yīng)性,將金黃色葡萄球菌抗體負(fù)載到納米結(jié)構(gòu)表面,可用于細(xì)菌的捕獲和檢測.在激發(fā)光(波長785 nm)照射下,1330 cm-1處會產(chǎn)生極強(qiáng)的拉曼信號,從而實(shí)現(xiàn)對低濃度細(xì)菌的檢測,檢測限可達(dá)10 cfu/mL.

Petti等[87]設(shè)計了一種基于多層八極納米結(jié)構(gòu)的細(xì)菌拉曼傳感器,以噬菌體作為細(xì)菌識別分子,具有極高的拉曼增強(qiáng)效果,并顯著提高了檢測的特異性,實(shí)現(xiàn)了在1 h之內(nèi)對單個細(xì)菌的檢測(圖13).

Fig.13 Phage specifically recognizes the bacteria and then immobilizes the bacteria to the surface of a nano substrate with SERS activity,able to get extremely strong Raman signals[87]Copyright 2017,American Chemical Society.

將以上3種方式進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn),直接檢測細(xì)菌表面特有的報告分子,無需樣品前處理即可快速獲得檢測報告,但目前掌握的特異性報告分子較少,無法達(dá)到大量樣本準(zhǔn)確檢測的需求.細(xì)菌自身拉曼光譜信號弱,且存在明顯的異質(zhì)性,導(dǎo)致檢測重現(xiàn)性不佳、 靈敏度較低,嚴(yán)重限制了其應(yīng)用.檢測細(xì)菌代謝產(chǎn)物或代謝途徑是鑒別細(xì)菌活力、 實(shí)時監(jiān)測細(xì)菌生理狀態(tài)的有效方法,利用拉曼檢測無損的優(yōu)勢,可監(jiān)測細(xì)菌對外源物質(zhì)的響應(yīng),揭示特定的生理學(xué)過程,是一項(xiàng)非常有潛力的檢測技術(shù).利用細(xì)菌的異質(zhì)性可以研究種群中單個細(xì)菌的分工和信息傳遞,從而發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)現(xiàn)象.利用具有靶向性的標(biāo)記探針進(jìn)行細(xì)菌檢測,能顯著提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性,而其與貴金屬納米粒子結(jié)合則可大幅增強(qiáng)拉曼信號,以至于實(shí)現(xiàn)單細(xì)菌檢測[88].但由于探針的加入導(dǎo)致操作復(fù)雜,同時可能會影響細(xì)菌的正常生理狀態(tài),仍難以大范圍應(yīng)用和推廣.

4 總結(jié)與展望

準(zhǔn)確、 快速的細(xì)菌鑒定和藥敏測試技術(shù)對細(xì)菌耐藥性相關(guān)的基礎(chǔ)研究和臨床抗菌治療至關(guān)重要.近年來,細(xì)菌檢測技術(shù)取得了長足進(jìn)步,但檢測耗時長的缺陷仍未得到有效解決,嚴(yán)重影響對患者的診斷和治療.鑒于此,可考慮從以下幾個方面發(fā)展快速、 高效的拉曼光譜細(xì)菌檢測方法: (1) 利用拉曼光譜技術(shù)具備的無需細(xì)菌培養(yǎng)、 痕量檢測的優(yōu)勢,可大力開發(fā)特異性強(qiáng)、 SERS活性高的拉曼探針; (2) 在SERS探針中引入氰基、 炔基等拉曼沉默區(qū)信號,提高檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度; (3) 發(fā)展無標(biāo)記、 可激活響應(yīng)型拉曼探針,無需擔(dān)心光漂白,實(shí)時監(jiān)測細(xì)菌生理生化過程,研究細(xì)菌侵染、 耐藥等生理現(xiàn)象,從而為細(xì)菌治療提供新思路; (4) 發(fā)展便攜式拉曼檢測儀,并結(jié)合快速診斷技術(shù)(如試紙條、 微流控等),用于細(xì)菌的現(xiàn)場快速檢測; (5) 著力于細(xì)菌耐藥現(xiàn)狀,開發(fā)高靈敏耐藥菌檢測技術(shù)以及快速藥敏測試新策略.