劉劍鋒 陳杉杉 馮偉 周壽紅

神經(jīng)炎癥是參與兒童缺氧性腦病發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)[1]。小膠質(zhì)細(xì)胞是介導(dǎo)神經(jīng)炎癥的主要功能細(xì)胞。研究結(jié)果顯示在兒童缺氧性腦病中存在小膠質(zhì)細(xì)胞異常激活[2]。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞有兩種極化類(lèi)型，M1型極化有促炎和神經(jīng)毒性作用，而M2型極化則有抗炎和促進(jìn)組織修復(fù)作用[3]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞激活的經(jīng)典刺激物[4]。蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase 2，JAK2)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[5-6]。硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)被稱(chēng)為第三種氣體信號(hào)分子[7]，在全身各器官系統(tǒng)均有廣泛的分布。H2S生理作用廣泛，參與了許多疾病的發(fā)生發(fā)展[8]。研究發(fā)現(xiàn)H2S可通過(guò)抑制神經(jīng)炎癥而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[9]，但其對(duì)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞極化介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥是否具有調(diào)控作用尚不清楚。本研究采用硫氫化鈉(sodium hydrogen sulfide，NaHS)作為H2S的供體，觀(guān)察H2S對(duì)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響，并從JAK2/STAT3信號(hào)通路的角度探討H2S抗神經(jīng)炎癥的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要藥品與試劑小鼠源性小膠質(zhì)細(xì)胞系N9小膠質(zhì)細(xì)胞購(gòu)自上海斯信生物科技有限公司；MEM(minimum eagle’s medium)培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen技術(shù)有限公司；胎牛血清購(gòu)自中國(guó)杭州四季青生物科技公司；胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、LPS、 NaHS、JAK2/STAT3信號(hào)通路特異性拮抗劑α-氰基-(3，4-羥基)N-芐苯乙烯胺〔α- cyano-(3，4-hydroxy)n-benzylstyramine，AG-490〕為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；BCA法蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；兔抗小鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthetase，iNOS)，精氨酸 酶1(arginase 1，Arg1)，JAK2、STAT3、p-JAK2、 p-STAT3單克隆抗體，β-actin一抗以及相應(yīng)二抗均為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組采用MEM培養(yǎng)基〔含5%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清〕培養(yǎng)N9小膠質(zhì)細(xì)胞，置37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，隔天換液，細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)70%左右時(shí)用0.5%胰酶(質(zhì)量濃度)消化后進(jìn)行傳代，以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將培養(yǎng)的細(xì)胞分為6組：(1)LPS組：以2 mg/L LPS處理細(xì)胞6 h；(2)NaHS組：以500 μmol/L NaHS處理細(xì)胞6.5 h；(3)LPS+NaHS組：先用500 μmol/L NaHS處理N9小膠質(zhì)細(xì)胞0.5 h，再加入2 mg/L LPS處理6 h；(4)AG-490組：以100 μmol/L AG-490處理細(xì)胞7 h；(5)LPS+NaHS+AG-490組：先用100 μmol/L AG-490處理N9小膠質(zhì)細(xì)胞0.5 h，加入500 μmol/L NaHS處理0.5 h，再加入2 mg/L LPS處理6 h；(6)對(duì)照組。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.3 方法

1.3.1MMT法檢測(cè)細(xì)胞活力：各組細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)和相關(guān)干預(yù)因素處理后，吸除培養(yǎng)液，以PBS清洗3次，每個(gè)培養(yǎng)孔加入20 μL MTT工作液繼續(xù)孵育4 h，然后再加入150 mL DMSO溶液。將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于搖床上，振動(dòng)搖晃10 min。采用酶標(biāo)儀測(cè)量570 nm處吸光度值。

1.3.2ELISA法檢測(cè)炎癥因子水平：各組細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)和相關(guān)干預(yù)因素處理后，經(jīng)胰酶消化，離心收集細(xì)胞，采用超聲裂解細(xì)胞，制備細(xì)胞勻漿。采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞勻漿上清中白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、IL-4、IL-10水平，以μg/g蛋白表示。

1.3.3Western-blot檢測(cè)總蛋白水平：提取各組細(xì)胞總蛋白，采用BCA法定量總蛋白濃度。將總蛋白樣品添加至加樣緩沖液中，用電爐燒開(kāi)煮沸，使蛋白質(zhì)完全充分變性。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳方法將已完全變性的蛋白質(zhì)分離，再通過(guò)電轉(zhuǎn)移方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinyl fluoride，PVDF)膜上。為阻斷非特異性抗原，將PVDF膜與5%(質(zhì)量濃度)脫脂牛奶在室溫下孵育2 h。加入兔抗小鼠JAK2(1∶400)、STAT3(1∶200)、p-JAK2(1∶300)、p-STAT3(1∶300)和β-actin(1∶300)一抗，4 ℃過(guò)夜。采用TBST液清洗PVDF膜3次，然后加入二抗，繼續(xù)在4 ℃條件下孵育4 h，以TBST液清洗PVDF膜3次。經(jīng)曝光、顯影、定影后，采用圖像分析軟件對(duì)膠片進(jìn)行掃描，核蛋白的檢測(cè)以組蛋白為內(nèi)參照，其他以β-actin作為內(nèi)參照，對(duì)目的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NaHS抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化對(duì)照組、LPS組、NaHS組和LPS+NaHS組細(xì)胞Arg1和iNOS蛋白表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.11，P<0.05；F=10.37，P<0.05)。與對(duì)照組比較，LPS組細(xì)胞Arg1蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，而iNOS蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+NaHS組細(xì)胞Arg1蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，而iNOS蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖1～2。

對(duì)照組、LPS組、NaHS組和LPS+NaHS組細(xì)胞及培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-10、IL-1β和IL-6水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與對(duì)照組比較，LPS組細(xì)胞及培養(yǎng)上清液中IL-4和IL-10水平降低(均P<0.05)，而IL-1β和IL-6水平增加(均P<0.05)；與LPS組比較，LPS+NaHS組細(xì)胞及培養(yǎng)上清液中IL-4和IL-10水平增加，而IL-1β和IL-6水平降低(均P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

注：Arg1：精氨酸酶1，iNOS：誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；圖2、5～6同。LPS：脂多糖，NaHS：硫化氫；圖2～6、表1～2同 圖1 不同處理?xiàng)l件下N9小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞Arg1和iNOS蛋白表達(dá)電泳圖(Western-blot法) 注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與LPS組比較，bP<0.05 圖2 不同處理?xiàng)l件下N9小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞Arg1和iNOS蛋白表達(dá)比較(Western-blot法)

表1 各組N9小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞及培養(yǎng)上清液中炎性因子水平表達(dá)比較

組別小膠質(zhì)細(xì)胞(μg/g蛋白)IL-1βIL-6 IL-4IL-10對(duì)照組18.37±1.5423.16±3.2924.36±3.2364.34±4.93LPS組43.52±6.37a51.33±4.81a10.22±2.42a22.81±3.54aNaHS組17.05±2.7121.04±3.0625.73±3.1668.11±7.06LPS+NaHS組27.79±3.62b30.23±3.87b21.82±2.43b53.96±5.17bF值12.139.6313.7612.33P值<0.05<0.05<0.05<0.05組別培養(yǎng)上清液(pg/mL)IL-1βIL-6IL-4IL-10對(duì)照組9.12±0.6514.13±1.5817.89±2.0437.69±3.22LPS組34.76±1.24a43.76±1.94a5.31±0.69a15.94±1.02aNaHS組10.24±1.1112.96±0.8719.84±2.7439.07±3.57LPS+NaHS組15.37±0.86b19.86±2.23b13.88±1.56b30.94±2.91bF值15.8816.7212.3917.03P值<0.05<0.05<0.05<0.05

注：IL：白細(xì)胞介素，表2同；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與LPS組比較，bP<0.05

2.2 LPS和NaHS對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞JAK2和STAT3表達(dá)的影響對(duì)照組、LPS組、NaHS組和LPS+NaHS組細(xì)胞p-JAK2(F=9.67，P<0.05)和p-STAT3(F=10.83，P<0.05)表達(dá)及p-JAK2/t-JAK2(F=11.37，P<0.05)和p-STAT3/t-STAT3比值(F=8.49，P<0.05)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而t-STAT3蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.71，P>0.05)。與對(duì)照組比較，LPS組細(xì)胞p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)以及p-JAK2/t-JAK2和p-STAT3/t-STAT3比值均明顯升高(均P<0.05)；與LPS組比較，LPS+NaHS組細(xì)胞p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)以及p-JAK2/t-JAK2和p-STAT3/t-STAT3比值均降低(均P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖3～4。

2.3 JAK2/STAT3通路抑制劑AG-490對(duì)NaHS作用的影響對(duì)照組、AG-490組、LPS+NaHS組、LPS+NaHS+AG-490組細(xì)胞Arg1(F=8.33，P<0.05)和iNOS(F=10.21，P<0.05)蛋白表達(dá)及IL-4、IL-10、IL-1β、IL-6水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與LPS+NaHS比較，LPS+NaHS+AG-490組細(xì)胞Arg1蛋白表達(dá)及IL-4和IL-10水平下調(diào)，而iNOS蛋白表達(dá)及IL-1β和IL-6水平上調(diào)(均P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖5～6、表2。

注：STAT3：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子，p-STAT3：磷酸化STAT3，t-STAT3：總的STAT3，JAK2：蛋白酪氨酸激酶，p- JAK2：磷酸化JAK2，t-JAK2：總的JAK2；圖4同 圖3 不同處理?xiàng)l件下N9小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞STAT3和JAK2蛋白表達(dá)電泳圖(Western-blot法)

2.4 細(xì)胞活力和細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察對(duì)照組、LPS組、NaHS組、AG-490組細(xì)胞活力分別為0.87±0.04、0.85±0.07、0.90±0.12和0.89±0.11，各組間細(xì)胞活力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.43，P>0.05)。對(duì)照組小膠質(zhì)細(xì)胞呈分支狀，經(jīng)LPS處理后小膠質(zhì)細(xì)胞突起變短，呈現(xiàn)阿米巴樣，而NaHS和AG-490處理均未影響細(xì)胞形態(tài)(結(jié)果未顯示)。

注：AG-490：α-氰基-(3，4-羥基)N-芐苯乙烯胺，圖6、表2同 圖5 不同處理?xiàng)l件下N9小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞Arg1和iNOS蛋白表達(dá)電泳圖(Western-blot法) 注：與LPS+NaHS組比較，aP<0.05 圖6 不同處理?xiàng)l件下N9小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞Arg1(A)和iNOS(B)蛋白表達(dá)比較(Western-blot法)

組別小膠質(zhì)細(xì)胞(μg/g蛋白)IL-1βIL-6 IL-4IL-10對(duì)照組17.82±2.4124.97±2.525.06±3.4461.38±5.93AG-490組16.16±1.1925.32±4.0723.06±1.8157.32±6.45LPS+NaHS組26.57±3.6233.12±3.8719.08±2.4348.22±5.17LPS+NaHS+AG-490組38.68±5.16a50.16±5.37a13.77±2.55a31.93±2.49aF值15.3916.7414.2812.47P值<0.05<0.05<0.05<0.05組別培養(yǎng)上清液(pg/mL)IL-1βIL-6IL-4IL-10對(duì)照組10.92±0.8615.07±1.3318.94±1.5836.11±4.07AG-490組9.34±1.1514.85±1.7719.63±2.3137.71±2.97LPS+NaHS組16.82±2.0618.93±1.6714.55±1.3929.51±3.18LPS+NaHS+AG-490組30.55±2.83a39.57±3.61a6.17±0.78a17.94±1.68aF值13.7115.0315.7613.29P值<0.05<0.05<0.05<0.05

注：與LPS+NaHS組比較，aP<0.05

3 討論

H2S在機(jī)體內(nèi)有兩種形式，即NaHS和H2S。在液體環(huán)境中H2S和NaHS可以保持一種動(dòng)態(tài)平衡[10]。由于NaHS比H2S更容易維持溶液中穩(wěn)定的H2S濃度，因此被用作H2S的供體[11]。H2S在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管、腎臟和肝臟等組織器官中均有大量分布。近年來(lái)有關(guān)H2S的神經(jīng)保護(hù)作用備受人們的關(guān)注[12]，特別是對(duì)神經(jīng)炎癥的抑制作用方面。Cao等研究發(fā)現(xiàn)H2S通過(guò)抑制STAT3和組織蛋白酶S的激活而抑制ATP誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和Aβ1-42的合成[13]。Ghanbari等研究也表明H2S可通過(guò)抑制神經(jīng)炎癥抑制甲基苯丙胺對(duì)海馬神經(jīng)元的神經(jīng)毒性[14]。

介導(dǎo)神經(jīng)炎癥的重要功能細(xì)胞是小膠質(zhì)細(xì)胞，由于小膠質(zhì)細(xì)胞具有異質(zhì)性，因而具有不同的極化功能表型[3]。M1型極化小膠質(zhì)細(xì)胞具有促炎反應(yīng)，分泌腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、IL-1β、IL-6、IL-12和趨化因子-2等促炎細(xì)胞因子。在M1反應(yīng)表型下，小膠質(zhì)細(xì)胞也表達(dá)iNOS，將Arg轉(zhuǎn)化為一氧化氮，因此iNOS也成為小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化的標(biāo)志物。而M2型極化小膠質(zhì)細(xì)胞具有抗炎作用，可分泌IL-4、IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)等抗炎細(xì)胞因子，同時(shí)可誘導(dǎo)Arg1表達(dá)，促進(jìn)精氨酸轉(zhuǎn)化成多巴胺，Arg1也成為小膠質(zhì)細(xì)胞M2型極化的標(biāo)志物[15]。兩種小膠質(zhì)細(xì)胞極化表型之間的平衡在神經(jīng)炎癥的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。H2S對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞極化具有調(diào)控作用。Du等研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)藤酮可能通過(guò)觸發(fā)ROS的形成、抑制CBS-H2S途徑從而促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M1炎癥表型分化[16]。Zhang等研究結(jié)果亦表明胱硫醚β-合酶/H2S途徑參與腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥[17]。本研究結(jié)果顯示，H2S可明顯降低LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中Arg1蛋白及IL-4和IL-10表達(dá)水平，而增加iNOS蛋白及IL-1β和IL-6表達(dá)水平，提示H2S可抑制LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的M1型極化，進(jìn)而可能抑制神經(jīng)炎癥。

小膠質(zhì)細(xì)胞極化的調(diào)控涉及到多條信號(hào)通路。近年來(lái)研究顯示JAK2/STAT3信號(hào)通路在小膠質(zhì)細(xì)胞極化的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[18]。JAK/STAT信號(hào)通路由JAK和STAT兩大家族組成，JAK家族是一組蛋白酶，由JAK1-3和TYK2組成；STAT家族是位于染色體內(nèi)的一組轉(zhuǎn)錄因子，由STAT1-4，STAT5a、b和STAT6組成，是JAK的下游底物，每個(gè)成員由750～850個(gè)氨基酸組成[19]。JAK2/STAT3信號(hào)通路是JAK/STAT信號(hào)通路的重要成員，參與細(xì)胞的增殖與分化、細(xì)胞凋亡以及免疫反應(yīng)等生理過(guò)程。當(dāng)胞外的信號(hào)分子與其膜上的受體識(shí)別并結(jié)合后，可誘導(dǎo)產(chǎn)生JAK2結(jié)合位點(diǎn)。JAK2與之結(jié)合后，誘導(dǎo)其發(fā)生磷酸化，從而暴露STAT3的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)STAT3與JAK2結(jié)合后可導(dǎo)致STAT3磷酸化并發(fā)生核轉(zhuǎn)移，入核后對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。因此JAK2和STAT3磷酸化水平可反映JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活狀況。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥可導(dǎo)致JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活[20-21]，而H2S對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路具有調(diào)控作用[22-23]。本研究結(jié)果顯示，LPS可明顯增加小膠質(zhì)細(xì)胞中p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)，提高p-JAK2/t-JAK2和p-STAT3/t-STAT3比值，而NaHS可逆轉(zhuǎn)這種變化，進(jìn)一步采用AG-490抑制JAK2/STAT3通路發(fā)現(xiàn)H2S抑制神經(jīng)炎癥的作用被減弱，提示H2S可抑制LPS誘導(dǎo)的JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活，這可能是H2S發(fā)揮抑制神經(jīng)炎癥作用的機(jī)制。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，H2S可抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路激活實(shí)現(xiàn)。