陳頔 張華 殷劍 田曉鑫 侯世芳 趙明 楊莉萍

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是由乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AChR)抗體介導(dǎo)，累及神經(jīng)肌肉接頭突觸后膜的自身免疫性疾病。若病情控制不佳極易導(dǎo)致呼吸肌無力，出現(xiàn)肌無力危象，危及生命。他克莫司為一種強(qiáng)效免疫抑制劑，適用于不能耐受糖皮激素以及糖皮質(zhì)激素依賴型MG患者。但由于他克莫司的治療窗窄、個(gè)體差異大，需要根據(jù)血藥濃度調(diào)整用藥劑量，而患者的病理生理狀態(tài)、遺傳特征、合并用藥等諸多因素均可影響其血藥濃度與治療效果。因此，探討他克莫司的藥物基因多態(tài)性以及藥物相互作用具有重要意義，是當(dāng)今研究的前沿和熱點(diǎn)。目前關(guān)于MG患者他克莫司的個(gè)體化治療研究相對(duì)較少。本研究通過對(duì)MG患者他克莫司血藥濃度及藥物基因檢測(cè)進(jìn)行分析，旨在為臨床用藥提供參考。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象收集2015年1月至2018年12月在北京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科經(jīng)他克莫司治療的住院MG患者258例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)MG診斷明確[1]；(2)連續(xù)應(yīng)用他克莫司 2周以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重肝、腎功能不全患者；(2)惡性腫瘤患者。本研究經(jīng)北京醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均知情同意。

1.2 方法

1.2.1資料收集：收集患者性別、年齡、身高、體重等一般資料；他克莫司用藥劑量、血藥濃度結(jié)果；與他克莫司存在藥物相互作用的藥物使用情況，包括糖皮質(zhì)激素、鈣離子通道阻滯劑(calcium channel blocker，CCB)、他汀類藥物(如阿托伐他汀及辛伐他汀)、質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitor，PPI；如奧美拉唑及艾司奧美拉唑)以及其他可能明顯影響他克莫司血藥濃度的藥物；CYP3A5 基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果。

1.2.2他克莫司血藥濃度監(jiān)測(cè)：他克莫司血藥濃度達(dá)穩(wěn)態(tài)后(維持劑量1周左右)，采血當(dāng)天于服藥前用EDTA抗凝管取靜脈血2 mL測(cè)定他克莫司谷濃度。主要檢測(cè)步驟：將血標(biāo)本緩慢翻轉(zhuǎn)混勻后，取200 μL全血置于離心管中，加入200 μL 他克莫司全血沉淀劑，快速混勻樣本5～10 s，待充分混勻后以13 000 r/min離心4 min(離心半徑50 mm)，取上清液置于他克莫司預(yù)處理管中，輕輕混勻5～10 s，上機(jī)檢測(cè)。采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法(雅培，Architect I1000)測(cè)定他克莫司的全血谷濃度。再根據(jù)血藥濃度結(jié)果調(diào)整他克莫司用藥劑量，使MG患者的穩(wěn)態(tài)谷濃度維持在治療窗范圍內(nèi)(5～10 ng/mL)。為便于比較，排除服藥劑量對(duì)血藥濃度的影響，將他克莫司血藥濃度除以患者每天劑量，得到劑量標(biāo)準(zhǔn)化谷濃度(C/D)，單位ng/(mL·mg)。

1.2.3CYP3A5基因多態(tài)性檢測(cè)：使用EDTA抗凝管取靜脈血2 mL，緩慢翻轉(zhuǎn)混勻后，按照以下步驟處理：將1000 μL NH4Cl加入1.5 mL離心管，加入200 μL全血，混勻后室溫放置5 min，以3000 r/min離心5 min(離心半徑50 mm)，棄上清。向離心管中加入150 μL耀金保試劑，用200 μL移液器反復(fù)吹打混勻，室溫放置20～30 min，期間緩慢顛倒混勻2次。將經(jīng)上述處理后的白細(xì)胞保存液1.0 μL，加入測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒(耀金分)中，上機(jī)檢測(cè)。采用熒光染色原位雜交檢測(cè)方法，使用配套的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、微測(cè)序基因分析系統(tǒng)，檢測(cè)CYP3A5*3 6986 A>G基因位點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩均數(shù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)；C/D值與患者年齡、體重的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析；采用多重線性回歸方法逐步篩選影響血藥濃度的因素。以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本資料共納入258例MG患者，其中男129例，女129例，年齡14～87歲，平均(56.3±16.7)歲，體重40～115 kg，平均(68.6±13.3)kg，身高150～195 cm，平均 (166.3±8.5)cm。他克莫司的用藥量為0.5～5.5 mg/d，平均(2.73±0.97)mg/d。

2.2 他克莫司血藥濃度分布情況258例MG患者共進(jìn)行378例次他克莫司谷濃度測(cè)定，平均濃度為(6.02±4.93)ng/mL。根據(jù)他克莫司治療MG的治療窗(5～10 ng/mL)，將患者血藥濃度分為低(<5 ng/mL)、正常(5～10 ng/mL)、高(>10 ng/mL)3組。血藥濃度低、正常、高組檢測(cè)例次分別為208例次(55.02%)、126例次(33.33%)和44例次(11.64%)，平均用藥劑量分別為(2.54±1.00)、(2.91±0.83)、(2.79±0.98)mg/d，3組間平均用藥劑量比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.158)，提示MG患者他克莫司的血藥濃度不完全由用藥劑量決定。

2.3 CYP3A5基因?qū)ρ帩舛鹊挠绊懝灿?27例患者進(jìn)行CYP3A5基因檢測(cè)，其中CYP3A5*1*1者27例(11.89%)、CYP3A5*1*3者94例(41.41%)、CYP3A5*3*3者106例(46.70%)。經(jīng)Hardy-Weinberg檢驗(yàn)分析，P>0.05，提示各基因頻率達(dá)到遺傳平衡，資料具有群體代表性。

2.3.1不同基因型患者C/D值比較：227例患者住院期間共進(jìn)行275例次他克莫司血藥濃度檢測(cè)，其中CYP3A5*1*1、CYP3A5*1*3、CYP3A5*3*3患者分別檢測(cè)41、118、116例次，C/D值分別為 (1.11±0.23)、(1.54±0.76)、(3.43±0.61)ng/(mL·mg)，3組間C/D值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=38.497，P<0.01)，兩兩比較結(jié)果顯示，CYP3A5*1*1和CYP3A5*1*3患者C/D值低于CYP3A5*3*3患者(均P<0.05)，而CYP3A5*1*1和CYP3A5*1*3患者間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表1 不同基因型MG患者他克莫司達(dá)治療窗時(shí)用藥劑量及達(dá)治療窗時(shí)不同用藥量患者分布比較

注：MG：重癥肌無力，表2同

2.3.2不同基因型患者血藥濃度比較：我國指南中他克莫司的推薦劑量為3 mg/d，本研究對(duì)采用此劑量治療的MG患者共78例次的他克莫司血藥濃度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，其中CYP3A5*1*1型12例次，CYP3A5*1*3型39例次，CYP3A5*3*3型27例次，平均血藥濃度分別為(2.73±1.09)、(4.35±2.67)、(8.25±6.02)ng/mL，3組間血藥濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.629，P<0.01)。兩兩比較結(jié)果顯示，CYP3A5*1*1和CYP3A5*1*3患者血藥濃度水平低于CYP3A5*3*3患者(均P<0.05)，而CYP3A5*1*1和CYP3A5*1*3患者間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。提示按照他克莫司3 mg/d劑量治療，CYP3A5*1*1和CYP3A5*1*3型患者血藥濃度低于治療窗，CYP3A5*3*3型患者可達(dá)治療窗。

2.3.3不同基因型患者用藥劑量及達(dá)治療窗分布：在275例次檢測(cè)中，共91例次血藥濃度達(dá)治療窗。3種基因型患者他克莫司血藥濃度達(dá)治療窗時(shí)用藥劑量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，兩兩比較結(jié)果顯示，CYP3A5*1*1患者達(dá)治療窗時(shí)用藥劑量高于CYP3A5*1*3者(P<0.05)，CYP3A5*1*3者高于CYP3A5*3*3者(P<0.01)。根據(jù)我國指南中他克莫司推薦用藥劑量3 mg/d作為分類標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)不同基因型患者達(dá)治療窗時(shí)例次情況，結(jié)果顯示，在血藥濃度達(dá)標(biāo)患者中，CYP3A5*1*1型患者達(dá)標(biāo)的4例次中用藥劑量全部>3 mg/d，CYP3A5*1*3型患者中18例次(52.9%)用藥劑量>3 mg/d，而CYP3A5*3*3型患者中31例次(58.5%)用藥劑量<3 mg/d。結(jié)果見表1。

2.4 人口學(xué)特征對(duì)血藥濃度的影響男性與女性MG患者平均血他克莫司 C/D值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(2.50±1.94)ng/(mL·mg)比(2.41±2.08)ng/(mL·mg)；t=1.667，P=0.097〕。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，C/D值與年齡(r=-0.054，P=0.297)和體重(r=-0.017，P=0.743)無相關(guān)性。

2.5 合并用藥情況及其對(duì)血藥濃度的影響在378例次的血藥濃度監(jiān)測(cè)中，其中187例次合并使用可能影響他克莫司血藥濃度的藥物，包括糖皮質(zhì)激素、他汀類藥物、CCB、PPI及其他影響他克莫司血藥濃度的藥物。僅聯(lián)合使用1種可能影響他克莫司濃度藥物的檢測(cè)為135例次，其中聯(lián)合使用糖皮質(zhì)激素者63例次，聯(lián)合使用他汀類藥物者35例次，聯(lián)合使用CCB者29例次，聯(lián)合使用PPI者8例次，血他克莫司 C/D值分別為(1.91±1.58)、(1.75±0.72)、(2.31±1.32)、(2.49±1.63)ng/(mL·mg)，與未合并使用影響他克莫司用藥患者〔191例次，(2.72±1.91)ng/(mL·mg)〕比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

2.6 多因素線性回歸分析他克莫司劑量、CYP3A5基因型、合并使用PPI(奧美拉唑或艾司奧美拉唑)與他克莫司血藥濃度存在相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 影響MG患者他克莫司血藥濃度的多因素線性回歸分析結(jié)果

注：/：表示無數(shù)據(jù)；激素：糖皮質(zhì)激素；他?。核☆愃幬?；CCB：鈣離子通道阻滯劑；PPI：質(zhì)子泵抑制劑

3 討論

他克莫司作為強(qiáng)效免疫抑制劑，于1997年開始應(yīng)用于MG的動(dòng)物模型研究[2]。此后，國內(nèi)、外多位學(xué)者相繼對(duì)他克莫司治療MG開展了臨床研究。一項(xiàng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)共納入了12個(gè)研究[3]，結(jié)果顯示他克莫司可降低MG患者定量MG評(píng)分(quantitive MG score，QMG)，減少激素依賴性患者激素的用量，且安全性較好。由于他克莫司個(gè)體差異大，諸多因素影響他克莫司的血藥濃度。首先，在遺傳特征方面，CYP3A5*3為主要影響他克莫司血藥濃度的基因，系統(tǒng)評(píng)價(jià)及Meta分析證實(shí)在腎移植或肝移植患者中，CYP3A5*3突變與他克莫司用藥量之間存在基因-劑量關(guān)系[4-5]。其次，在人口學(xué)方面，研究表明，器官移植患者他克莫司的血藥濃度與患者的年齡、性別、體重指數(shù)等人口生物學(xué)因素有關(guān)，但尚無確切定論。有文獻(xiàn)報(bào)道與男性腎移植患者相比，女性腎移植患者他克莫司的藥時(shí)曲線下面積、谷濃度及濃度/劑量比均較低[6-7]。第三，在藥物相互作用方面，他克莫司由CYP3A4、3A5及P-糖蛋白介導(dǎo)，與多種藥物存在藥物相互作用。有研究[7-8]表明合用抗真菌藥、PPI、CCB、大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥、糖皮質(zhì)激素藥物可使移植患者他克莫司的C/D值發(fā)生改變。然而，目前關(guān)于他克莫司的血藥濃度影響因素的研究絕大多數(shù)以器官移植患者為研究對(duì)象，而MG患者的治療方案與給藥劑量與移植患者存在很大差異，而針對(duì)MG患者的相關(guān)研究十分匱乏。

本研究依據(jù)治療窗將患者血藥濃度分為低、正常、高3組，結(jié)果顯示雖然血藥濃度差異較大，但各組患者用藥劑量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明MG患者他克莫司的代謝個(gè)體差異較大；進(jìn)一步分析影響他克莫司血藥濃度的影響因素發(fā)現(xiàn)：首先，CYP3A5基因多態(tài)性檢測(cè)的結(jié)果顯示，CYP3A5*1*1組和CYP3A5*1*3的C/D值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而CYP3A5*1*1組和CYP3A5*1*3組的C/D值低于CYP3A5*3*3組，并且通過分析不同基因型血藥濃度的達(dá)標(biāo)情況和用藥劑量顯示，CYP3A5*1*1型患者他克莫司達(dá)標(biāo)適宜劑量為4.0 mg/d、CYP3A5*1*3型約為3.47 mg/d、CYP3A5*3*3型約為2.54 mg/d，因此如果按照予以MG患者3 mg/d的常規(guī)推薦劑量，CYP3A5*1*1和CYP3A5*1*3型患者可能難以達(dá)到治療窗。因此，CYP3A5基因的檢測(cè)有利于預(yù)測(cè)患者的適宜用藥劑量。其次，人口學(xué)因素方面，本研究結(jié)果顯示，MG患者的年齡、性別、體重對(duì)他克莫司 C/D值的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，盡管對(duì)于移植患者需要按照體重計(jì)算給藥劑量，但是對(duì)于MG患者，是否需要按照體重計(jì)算給藥劑量有待商榷，仍需要更多研究證實(shí)。再次，本研究對(duì)合并用藥是否影響他克莫司血藥濃度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，糖皮質(zhì)激素、他汀類藥物、CCB、PPI并未影響他克莫司的C/D比值。這與上述文獻(xiàn)關(guān)于合并用藥影響血藥濃度的結(jié)果不一致，其原因可能為：本研究為回顧性研究，多個(gè)混雜因素影響了單因素的分析；另外，患者合并用藥的劑量存在較大差異，特別是糖皮質(zhì)激素的劑量，如甲潑尼龍從每天4～1000 mg。因此，進(jìn)一步多重線性回歸分析結(jié)果顯示，用藥劑量、CYP3A5基因多態(tài)性、合并使用PPI是影響他克莫司血藥濃度的因素，而糖皮質(zhì)激素未影響他克莫司的血藥濃度，這與既往研究顯示的糖皮質(zhì)激素可影響他克莫司血藥濃度的結(jié)果存在差異[9]。其原因可能與這兩項(xiàng)研究均未對(duì)合并用藥劑量進(jìn)行定量分析有關(guān)。因此，開展針對(duì)多因素的定量分析可較好地彌補(bǔ)現(xiàn)有研究的不足，例如通過定量藥理學(xué)研究可較好地解決此問題，該方法可綜合患者性別、年齡、體重、遺傳基因分型、疾病狀況、合并用藥等多個(gè)變量，定量分析患者的個(gè)體差異對(duì)血藥濃度的影響。對(duì)于MG患者，檢索到1篇他克莫司群體藥代動(dòng)力學(xué)的研究，該研究將MG患者的人口學(xué)因素、病生理狀態(tài)、用藥情況等多因素納入群體藥代動(dòng)力學(xué)模型，定量考察各個(gè)變量對(duì)血藥濃度的影響，但是此研究未將影響血藥濃度的重要因素-藥物基因多態(tài)性納入模型[10]，因此針對(duì)MG患者他克莫司的個(gè)體化治療仍需要開展更多研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，MG患者他克莫司血藥濃度可能與他克莫司劑量、合并用藥、基因多態(tài)性有相關(guān)性。由于影響他克莫司血藥濃度的因素較多，如患者肝腎功能等，本研究納入患者無嚴(yán)重肝腎功能不全者。因此在臨床中存在肝腎功能不全者，應(yīng)給予注意。關(guān)于MG患者他克莫司血藥濃度的確切影響因素仍需深入研究。