張六六 王亞 吳燕

摘要 以自主分離的冠突散囊菌菌（Eurotium cristatum）SL-1為研究對象，對該菌株的固態(tài)發(fā)酵條件及培養(yǎng)基配方進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，以夏秋茶葉作為唯一氮源及發(fā)酵基質(zhì)，SL-1菌株產(chǎn)孢的最佳培養(yǎng)基配方為1%（m/V）葡萄糖+1%（m/V）蔗糖，并添加由KH2PO4+K2HPO4、ZnCl2、MgSO4、CaCl2、MnSO4、FeCl3組成，終濃度為0.5%的無機(jī)鹽。最適發(fā)酵條件如下：最適溫度為25 ℃，最適初始pH為5.0，最適初始含水量為75%，最適接種量為105 CFU/g，最適發(fā)酵時(shí)間為7 d。在最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，獲得SL-1菌株的最高產(chǎn)孢量（8.25×109 CFU/g），可為后續(xù)發(fā)酵工藝研究提供數(shù)據(jù)支撐。

關(guān)鍵詞 冠突散囊菌;固態(tài)發(fā)酵;工藝

Abstract Using E. cristatum SL1 selfisolated as research object， the fermentation conditions and the formula of culture medium were optimized. The results showed that the best medium by using tealeaf as the only nitrogen source and matrix of summerautumn tea were as follows： 1% glucose（m/V）+1% sucrose（m/V）， and adding inorganic salt （composed with KH2PO4+K2HPO4， ZnCl2， MgSO4， CaCl2， MnSO4， FeCl3 ） with the final concentration of 0.5%. The optimal fermentation conditions were as follows： culture temperature 25 ℃， initial pH 5.0， initial water content 75%， inoculation amount of 105 CFU/mL and fermentation for 7 days. Under the optimal medium and culture conditions， the number of viable bacteria reached 8.25×109 CFU/g， which could meet the needs of the subsequent fermentation process.

Key words Eurotium cristatum;Solid fermentation; Process

由于夏秋季節(jié)氣溫普遍偏高，茶樹的碳代謝水平高，氮代謝水平低，使得夏秋茶中的多酚類物質(zhì)含量高，維生素、氨基酸以及芳香成分的含量偏低，制成的茶葉往往口感較差，苦澀味重，缺乏清香氣味，品質(zhì)上遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到春茶的水平[1]。同時(shí)，茶葉采摘的勞動強(qiáng)度較大，成本高，茶農(nóng)采摘后無利可圖，使得夏秋茶的鮮葉采摘少甚至不采，不僅造成了資源極大浪費(fèi)，而且消耗土地肥力，同時(shí)帶來植保問題[2]。因此，如何利用夏秋茶資源對于提高茶葉的生產(chǎn)整體效益、增加茶農(nóng)的收入十分重要。

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）是茯磚茶發(fā)花過程中的優(yōu)勢菌種[3]，其產(chǎn)生的黃色閉囊殼均勻附著在茯磚茶中，俗稱“金花”[4]。目前國內(nèi)對該菌種的研究主要集中在分類鑒定、形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長特性以及發(fā)花工藝控制方面[5]，對其自身發(fā)酵工藝以及發(fā)酵產(chǎn)物鮮有研究及報(bào)道。

筆者前期從茯磚茶中分離篩選出1株冠突散囊菌E.cristatum SL-1，其在茶葉發(fā)酵過程中均有良好的活性及生存優(yōu)勢。筆者對其固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，采用茶葉作為唯一氮源及固態(tài)基質(zhì)，通過加入一定量的營養(yǎng)物質(zhì)來補(bǔ)充發(fā)酵培養(yǎng)基，以產(chǎn)孢量為考察指標(biāo)，探究冠突散囊菌E.cristatum SL-1的最佳固態(tài)發(fā)酵工藝，旨在為該菌種應(yīng)用于夏秋茶的大規(guī)模發(fā)酵提供理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種。

一株冠突散囊菌菌株DP-1，分離自茯磚茶中。經(jīng)菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)鑒定[6]、生理生化鑒定和基因鑒定確定為冠突散囊菌（Eurotium cristatum）[7]，由江蘇省微生物研究所有限公司菌種保藏庫保藏。

1.1.2 茶葉。

研究所用茶葉于夏季（7—8月）采自宜興市曉峰茶廠。

1.1.3 培養(yǎng)基。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL，自然pH。

1.1.4 試劑。

紅糖購自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場，糖蜜購自無錫凱爾化工產(chǎn)品有限公司，其他試劑均購自國藥試劑公司。

1.1.5 儀器與設(shè)備。

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;

SW-CJ-1FD潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)公司）;

LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌器（上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司）;

81·2型磁力恒溫?cái)嚢杵鳎ㄉ虾２苄袩o線電元件廠）;

AL104型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）;

MP1002型電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）;

PHS-3CT實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（上海今邁儀器有限公司）;

DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 孢子懸液的制備。

取一支已培養(yǎng)4 d的E.cristatum SL-1的斜面試管，在無菌條件下倒入滅菌后的去離子水10 mL，用接種環(huán)將黃色閉囊殼刮下，并用已滅菌的濾紙進(jìn)行過濾，過濾后的懸浮液倒入盛有100 mL無菌水的三角瓶中，加入玻璃珠振搖20 min，即獲得E.cristatum SL-1孢子懸液。

1.2.2 鮮茶葉含水量的測定。

分別準(zhǔn)確稱取10份茶葉置于培養(yǎng)皿蓋中，每份10 g，置于干燥箱內(nèi)，120 ℃下烘干至恒重，通過烘干前后的重量差值來計(jì)算茶葉的含水量。

1.2.3 不同碳源對E.cristatum SL-1菌株生長的影響。

采用組合碳源的方式研究碳源對SL-1菌株生長的影響。根據(jù)不同的碳源類型，分別采用以下6種碳源組合進(jìn)行試驗(yàn)：1%葡萄糖+1%蔗糖、1%葡萄糖+1%紅糖、1%葡萄糖+1%糖蜜、1%蔗糖+1%紅糖、1%蔗糖+1%糖蜜、1%紅糖+1%糖蜜。氮源選擇為鮮茶葉、初始含水量為70%、接種量為104 CFU/g。25 ℃下培養(yǎng)5 d后，采用血球計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)三角瓶內(nèi)SL-1菌株的活孢子數(shù)。

1.2.4 不同無機(jī)鹽對E.cristatum SL-1菌株生長的影響。

分別選擇KH2PO4+K2HPO4、ZnCl2、MgSO4、CaCl2、MnSO4、FeCl3 6組無機(jī)鹽進(jìn)行試驗(yàn)，以NaCl為對照，各組無機(jī)鹽的濃度均為0.5%，按“1.2.3”中的最適碳源及其他相同條件培養(yǎng)SL-1菌株，5 d后測定活孢子數(shù)。

1.2.5 E.cristatum SL-1菌株最適培養(yǎng)溫度的確定。

分別選擇20、25、30、35、40 ℃ 5個溫度對SL-1菌株進(jìn)行培養(yǎng)，其他培養(yǎng)條件與“1.2.4”相同。培養(yǎng)5 d后，測定活孢子數(shù)，確定DP-1菌株的最適生長溫度。

1.2.6 E.cristatum SL-1菌株最適初始pH的確定。

用1 mol/L鹽酸或1 mol/L NaOH溶液分別將營養(yǎng)液的初始pH調(diào)至4.0、4.5、5.0、5.5和6.0，其他培養(yǎng)條件與“1.2.5”相同。培養(yǎng)5 d后，測定各初始pH條件下的活孢子數(shù)，確定SL-1菌株的最適生長初始pH。

1.2.7 不同初始含水量對E.cristatum SL-1產(chǎn)孢量的影響。

利用營養(yǎng)液或烘干手段，通過計(jì)算鮮茶葉的初始含水量，將最終發(fā)酵過程中初始含水量分別調(diào)整至60%、65%、70%、75%、80%和85%，其他條件與“1.2.6”相同。培養(yǎng)5 d后，測定各初始含水量條件下的活孢子數(shù)，確定SL-1菌種的最適初始含水量。

1.2.8 不同接種量對E.cristatum SL-1產(chǎn)孢量的影響。

分別將孢子懸液接種量調(diào)至103、104、105、106 CFU/g，接種至固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中，其他條件與“1.2.7”相同。培養(yǎng)5 d后，測定不同接種量下的活孢子數(shù)，確定SL-1菌種的最適接種量。

1.2.9 不同發(fā)酵時(shí)間對E.cristatum SL-1產(chǎn)孢量的影響。

按照“1.2.3”～“1.2.8”中獲得的最適培養(yǎng)條件，對E.cristatum SL-1菌種進(jìn)行培養(yǎng)，從第3天開始，每天對其產(chǎn)孢量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以確定SL-1菌種的最佳發(fā)酵周期。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源

考慮到成本因素，選用價(jià)格低廉、工業(yè)應(yīng)用較為廣泛的葡萄糖、蔗糖等原料及紅糖、糖蜜等天然物質(zhì)作為碳源，通過組合的方式研究不同碳源對SL-1菌株生長的影響，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，選用1%葡萄糖+1%蔗糖的組合方式作為碳源，獲得SL-1菌株的孢子量較其他5種組合更高，測得的活菌數(shù)達(dá)到4.87×108 CFU/g。因此，SL-1菌株培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基碳源為1%葡萄糖+1%蔗糖。

2.2 無機(jī)鹽

6組無機(jī)鹽對DP-1菌株生長的影響如圖2所示。從圖2可以看出，6種無機(jī)鹽對SL-1菌株的產(chǎn)孢促進(jìn)作用均較NaCl有不同程度提高。其中以ZnCl2最為顯著，其活菌數(shù)達(dá)到8.45×108 CFU/g。

由于添加6種無機(jī)鹽獲得的SL-1菌株產(chǎn)孢量都有所提高，表明均是菌株生長所需的無機(jī)鹽離子，因此該研究將6種無機(jī)鹽按需求量的比例進(jìn)行組合，同時(shí)添加EDTA等金屬離子絡(luò)合劑，制成終濃度為0.5%的無機(jī)鹽營養(yǎng)液。采用上述獲得的碳源，并將營養(yǎng)液添加至培養(yǎng)基中對SL-1菌株進(jìn)行培養(yǎng)，5 d后測產(chǎn)孢數(shù)結(jié)果如圖2所示，試驗(yàn)表明添加營養(yǎng)液后SL-1菌株的產(chǎn)孢量有大幅度提高，孢子數(shù)達(dá)到1.15×109 CFU/g。

2.3 培養(yǎng)溫度

不同培養(yǎng)溫度對SL-1菌株生長的影響如圖3所示。從圖3可以看出，當(dāng)培養(yǎng)溫度為25 ℃時(shí)，SL-1菌株的產(chǎn)孢量最大。因此，SL-1菌株的最適溫度為25 ℃。

2.4 初始pH

不同初始pH對SL-1菌株產(chǎn)孢量的影響如圖4所示。從圖4可以看出，當(dāng)初始pH為5.0時(shí)SL-1菌株的產(chǎn)孢量最大，因此可確定SL-1菌株的最適初始pH為5.0。

2.5 初始含水量

經(jīng)測定可知，試驗(yàn)所用的鮮茶葉含水量為70%，不同初始含水量對SL-1菌株產(chǎn)孢量的影響如圖5所示。從圖5可以看出，不同含水量對產(chǎn)孢量有明顯影響。當(dāng)初始含水量為75%時(shí)SL-1菌株產(chǎn)孢量最高，因此SL-1菌株發(fā)酵的最適初始含水量為75%。

2.6 接種量

不同接種量對SL-1菌株產(chǎn)孢的影響如圖6所示。從圖6可以看出，在103～105 CFU/g內(nèi)，隨著接種量的增加，產(chǎn)孢量也逐漸增加，當(dāng)接種量超過105 CFU/g時(shí)對SL-1菌株產(chǎn)孢量幾乎沒有影響。因此，選擇105 CFU/g作為最佳接種量。

2.7 發(fā)酵時(shí)間

不同發(fā)酵時(shí)間對SL-1菌株產(chǎn)孢量的影響如圖7所示。從圖7可以看出，在0～7 d內(nèi)，SL-1的產(chǎn)孢量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而顯著增加，發(fā)酵8 d時(shí)產(chǎn)孢量卻有所降低，原因可能是所產(chǎn)孢子有部分又萌發(fā)，8 d后產(chǎn)孢量又開始增加。從日產(chǎn)孢量及效率方面考慮，選用發(fā)酵7 d作為SL-1菌株的最佳發(fā)酵時(shí)間。

3 討論與結(jié)論

近年來，隨著茶葉種植面積的增加以及物質(zhì)生活水平的提高，我國傳統(tǒng)茶產(chǎn)業(yè)面臨供大于求的關(guān)系，消費(fèi)者更趨向于選擇高品質(zhì)的茶葉[8]。夏秋茶由于內(nèi)含物多酚類物質(zhì)含量高，很難受到廣大消費(fèi)者的青睞[9]。同時(shí)，夏秋茶產(chǎn)量又占用全年總產(chǎn)量的60%以上，利用微生物發(fā)酵夏秋茶是一種夏秋茶開發(fā)利用的新途徑[10]，其發(fā)酵產(chǎn)物不僅是養(yǎng)殖動物的良好飼料添加劑，同時(shí)也可以作為肥料使用，使得資源可循環(huán)利用。

該研究對自主分離篩選的冠突散囊菌E.cristatum SL-1進(jìn)行發(fā)酵夏秋茶條件的研究，確定了SL-1菌株的最適發(fā)酵條件：最適溫度為25 ℃、最適初始pH為5.0、最適初始含水量為75%、最適接種量為105 CFU/g，最適發(fā)酵時(shí)間為7 d。

同時(shí)，對SL-1菌株的培養(yǎng)基配方進(jìn)行了初步優(yōu)化，以夏秋季的鮮茶葉為唯一氮源和固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，確定了培養(yǎng)基的最佳碳源為1%葡萄糖+1%蔗糖，并添加由KH2PO4+K2HPO4、ZnCl2、MgSO4、CaCl2、MnSO4、FeCl3組成，終濃度為0.5%的無機(jī)鹽。此組合由成本低廉的原料及天然物質(zhì)組成，營養(yǎng)更為均衡，既有少量的速效碳源供菌株前期快速生長利用，同時(shí)又有大量的遲效碳源以保證菌株中后期數(shù)量和活力的穩(wěn)定。

該研究對E.cristatum SL-1菌株的發(fā)酵條件及培養(yǎng)基配方僅進(jìn)行了搖瓶階段的初步優(yōu)化，計(jì)劃下一步通過采用脈動試發(fā)酵罐進(jìn)行放大試驗(yàn)確定發(fā)酵的各個參數(shù)，為該菌株的工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用提供理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支持。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年

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