陳杰 徐嬌 張進(jìn)強(qiáng)

摘要 為了解藥用植物川續(xù)斷中熱激蛋白基因的分布情況及序列特征，以不同海拔川續(xù)斷轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，利用生物信息學(xué)方法鑒定和分析川續(xù)斷HSP70和HSP90基因家族成員。結(jié)果表明，川續(xù)斷中至少包含36個(gè)HSP70和18個(gè)HSP90基因，各成員在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中均有分布，15類保守基序長度介于15～50個(gè)氨基酸之間;系統(tǒng)進(jìn)化樹揭示DaHSP90基因與擬南芥親緣關(guān)系更近。初步篩選了10個(gè)響應(yīng)溫度脅迫的熱激蛋白基因，為進(jìn)一步探索川續(xù)斷HSP基因家族的功能奠定重要理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為研究影響其活性成分川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量因素提供參考。

關(guān)鍵詞 川續(xù)斷;熱激蛋白;基因;鑒定;生物信息學(xué)

Abstract In order to understand the distribution and sequence characteristics of heat shock protein genes in D. asper，which was a medicinal plant， bioinformatics methods were used to identify and analyze the members of the DaHSP70 and DaHSP90 gene families based on transcriptome databases of D. asper at different altitudes. The results showed that a total of 36 HSP70 and 18 HSP90 genes were identified from D. asper. The members were distributed in cytoplasm， nucleus or endoplasmic reticulum. The length of 15 conserved motifs of family members ranged from 15 to 50 amino acids. Phylogenetic tree revealed that DaHSP90 was closer to Arabidopsis thaliana. In this study， ten heat shock protein genes were preliminarily screened. The results provided an important theoretical foundation to explore the function of HSP gene family and study the factors affecting the content of active ingredient asperosaponin Ⅵ in D. asper.

Key words Dipsacus asper;Heat shock protein;Gene;Identification;Bioinformatics

中藥續(xù)斷來源于川續(xù)斷科川續(xù)斷（Dipsacus asper Wall.ex Henry）植物的干燥根，藥材具有行血消腫、生肌止痛、續(xù)筋接骨、安胎等功效，常用于治療骨損傷、骨質(zhì)疏松、腰膝酸軟、習(xí)慣性流產(chǎn)等疾病[1]。2015版《中國藥典》規(guī)定以川續(xù)斷皂苷Ⅵ作為續(xù)斷藥材的質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)。原植物川續(xù)斷喜寒、忌高溫[2]，常見于海拔700～1 500 m的山地或林緣的草叢中，有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性。研究發(fā)現(xiàn)[3]，川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量變化與海拔呈正相關(guān)，在實(shí)際人工種植生產(chǎn)中亦采取高海拔育苗、低海拔栽培方式。海拔作為重要的環(huán)境因子，包含光、溫、水等氣候條件因子，其中溫度是影響較大的因子之一，在一般情況下，海拔越高，溫度越低[4]。因此，推測川續(xù)斷中川續(xù)斷皂苷Ⅵ合成積累與溫度相關(guān)。

熱激蛋白（heat shock proteins，HSPs）是生物體遭遇高溫脅迫時(shí)，迅速并大量產(chǎn)生的一類蛋白，是生物適應(yīng)環(huán)境溫度變化的一個(gè)重要媒介。HSPs既是植物的防御蛋白又是必需蛋白，普遍存在于生物體中，具有高保守性、短時(shí)性、種類豐富等特點(diǎn)[5]。在不同生命進(jìn)程中，熱激蛋白有組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解蛋白等功能，對穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)和膜系統(tǒng)，維持植物正常生長發(fā)育有著重要的作用[6]。隨著地球溫室效應(yīng)的加劇，植物的耐熱性研究也越來越受到人們的關(guān)注。據(jù)報(bào)道，在擬南芥、水稻[7]、玉米[8]等多種植物中均發(fā)現(xiàn)存在熱激反應(yīng)且伴有HSPs的產(chǎn)生，同時(shí)也證實(shí)熱激蛋白不僅受高溫誘導(dǎo)，在高鹽、干旱、過氧化、重金屬離子等脅迫下也可瞬間大量表達(dá)[9]。HSPs種類繁多，通常分為5個(gè)家族（HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子sHSP），每個(gè)家族都是超基因家族。其中HSP90和HSP70是研究最多的兩大家族，深入研究該蛋白有利于新種質(zhì)資源的創(chuàng)新。迄今，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘川續(xù)斷熱激蛋白的研究鮮見報(bào)道。因此，該研究通過進(jìn)一步挖掘川續(xù)斷轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對獲得的熱激蛋白基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在全面了解川續(xù)斷熱激蛋白基因HSP70和HSP90的基本性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化及功能作用等信息，為開展川續(xù)斷熱激蛋白的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

所選材料來源于貴州省威寧縣（海拔1 000～2 500 m，26°31′24″N，108°17′37″E），于1 000、2 350 m處采集一年生川續(xù)斷植株，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室江維克教授鑒定，提取川續(xù)斷根的總RNA，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，轉(zhuǎn)錄組從頭拼接獲得131 311個(gè)轉(zhuǎn)錄本，包含58 925個(gè)unigene，其中，40 000多個(gè)unigenes分別被Nr、Swissprot、Pfam、GO、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫比對注釋成功。

2.6 系統(tǒng)進(jìn)化分析

以不同物種中的HSP70和HSP90蛋白序列構(gòu)建進(jìn)化樹，系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，川續(xù)斷熱激蛋白在每個(gè)大支上均有分布，其中DaHSP70-17/22/28/30與酵母菌YDL229W_YS9聚為一亞支，DaHSP70-14/32與水稻Os12g38180.1聚為一亞支，DaHSP70-2/3與擬南芥At3G12580.1聚為一亞支（圖3A）。DaHSP90-13與酵母菌聚為一亞支，DaHSP90-4/7/10與擬南芥親緣關(guān)系更近（圖3B）。綜上所述表明，DaHSP70和DaHSP90與擬南芥、水稻等物種中的熱激蛋白親緣關(guān)系存在較大的差異。進(jìn)化關(guān)系上歸為一類的熱激蛋白基因在功能上可能較為相似，因此可以結(jié)合模式植物中已知功能的HSP基因和進(jìn)化親緣關(guān)系，推測川續(xù)斷DaHSP70和DaHSP90基因的功能。

2.7 基因家族表達(dá)分析

根據(jù)已完成的川續(xù)斷轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，找出篩選出的54個(gè)HSP基因相應(yīng)的表達(dá)量，均一化處理后作圖。從圖4可以看出，不同基因有其獨(dú)特的表達(dá)模式，同時(shí)也有其表達(dá)共性。低海拔與高海拔相比，在高海拔中，表達(dá)量變化大的基因有DaHSP70-2、DaHSP70-16、DaHSP70-31、DaHSP90-4、DaHSP90-7、DaHSP90-8、DaHSP90-12、DaHSP90-14、DaHSP90-15、DaHSP90-18，推測以上這10條基因編碼的蛋白屬于誘導(dǎo)型熱激蛋白，主要響應(yīng)低溫調(diào)控的。

3 討論與結(jié)論

隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，其技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組水平上也越來越普遍，且非常適合基因組尚未完成及遺傳數(shù)據(jù)匱乏的物種。目前，已經(jīng)從多個(gè)植物中鑒定出HSP70和HSP90的同源基因[10-12]，它們都是以基因家族形式存在。該研究在川續(xù)斷中共鑒定出36個(gè)DaHSP70和18個(gè)DaHSP90基因，根據(jù)亞細(xì)胞定位，DaHSP70和DaHSP90編碼蛋白有4種類型，包括細(xì)胞質(zhì)型、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型、細(xì)胞核型、葉綠體/線粒體型，其中細(xì)胞質(zhì)型為主要，與已研究的擬南芥、水稻主要定位在細(xì)胞質(zhì)中一致[2]。

不同物種相同細(xì)胞器的同源性大于同一物種不同細(xì)胞器，葉用萵苣、擬南芥、番茄等細(xì)胞質(zhì)型HSP70氨基酸的同源性達(dá)80%[9]。該研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥、水稻和川續(xù)斷中細(xì)胞質(zhì)型HSP70和HSP90氨基酸的同源性達(dá)70%～80%。HSP70和HSP90蛋白序列的N端和C端分別具有ATPase區(qū)和多肽結(jié)合區(qū)，不同之處在于HSP70蛋白序列末端是8個(gè)氨基酸殘基（GPTIEEVD），而HSP90蛋白序列末端是五肽結(jié)構(gòu)（MEEVD）。該研究結(jié)果顯示，在川續(xù)斷中，細(xì)胞質(zhì)型蛋白序列亦有以上結(jié)構(gòu)，表明HSP70和HSP90基因家族成員在川續(xù)斷中同樣高度保守。系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果顯示，每大支均有不同物種的熱激蛋白家族成員，且分布不均，進(jìn)一步表明HSP70和HSP90基因家族成員之間存在廣泛的多樣性。在擬南芥中細(xì)胞質(zhì)型HSP90基因響應(yīng)氧化脅迫[13]，該研究發(fā)現(xiàn)DaHSP90基因家族成員與擬南芥親緣關(guān)系更近，推測DaHSP90基因家族中編碼的同類型蛋白參與川續(xù)斷逆境下的氧化脅迫。

熱激基因的表達(dá)調(diào)節(jié)主要在轉(zhuǎn)錄水平，在川續(xù)斷轉(zhuǎn)錄組中，DaHSP70-2、DaHSP70-16等10個(gè)基因在高海拔中的表達(dá)量明顯較低海拔高或低，由此推測它們編碼的蛋白為誘導(dǎo)型蛋白，響應(yīng)低溫脅迫?；虻谋磉_(dá)與基因功能密切相關(guān)。在黃瓜幼苗中，通過上調(diào)HSP70，減少植株體內(nèi)H2O2的積累，從而提高耐熱性，而HSP90不僅具有效提高干旱能力，還具有緩沖作用，當(dāng)生物遇到脅迫時(shí)，會暴露存在的隱藏突變，有助于植物的進(jìn)化適應(yīng)[14]。推測以上10個(gè)熱激蛋白在川續(xù)斷抗逆作用中發(fā)揮主要作用。川續(xù)斷中活性成分川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量與生長環(huán)境溫度有一定的關(guān)聯(lián)，因此，亦可以作為后期篩選影響川續(xù)斷皂苷Ⅵ合成積累的候選基因。

該研究基于轉(zhuǎn)錄組水平的鑒定從川續(xù)斷中篩選獲得36個(gè)DaHSP70基因和18個(gè)DaHSP90基因，并對其進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)和表達(dá)特征分析，為深入研究DaHSP基因家族在川續(xù)斷中的相關(guān)功能奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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