黃勝廣 王玉方 趙卉

摘要 [目的]采用分散固相萃取的前處理技術(shù)，建立了一種UPLC-MS/MS（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry）法同時測定梅花鹿鹿鞭中18種磺胺的檢測方法。[方法]鹿鞭樣品以乙腈為提取劑，100 mg PSA、150 mg C18與50 mg中性氧化鋁為凈化劑。液相色譜條件：ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相A為25 mmol/L甲酸乙腈，B為水，柱溫35 ℃;質(zhì)譜條件：正離子模式（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式。鹿鞭中磺胺含量采用外標(biāo)法定量。[結(jié)果]18種磺胺在0.05～50.00 ng/mL線性關(guān)系良好，決定系數(shù)R2均大于0.999，18種磺胺的檢出限（LOD）為0.05 μg/kg，定量限（LOQ）為0.15 μg/kg。18種磺胺的平均加樣回收率為83.5%～97.7%，RSD均小于5%。[結(jié)論]該方法具有操作簡便、凈化效果顯著、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、檢出限低等優(yōu)點，可用于梅花鹿鹿鞭中18種磺胺的檢測。

關(guān)鍵詞 QuEChERS;UPLC-MS/MS;梅花鹿;鹿鞭;磺胺

Abstract [Objective]A method for the simultaneous determination of 18 sulfonamides in deer whip of Cervus nippon Temminck by UPLCMS/MS was developed by using the pretreatment technology of dispersed solid phase extraction. [Method]Deer whip samples were extracted with acetonitrile and purified with 100 mg PSA， 150 mg C18 and 50 mg neutral alumina. The UPLC analysis was carried out by a 35 ℃ thermostatic Waters Acquity UPLC BEH C18 column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）with a mobile phase composed of 25 mmol/L formic acid acetonitrilewater for gradient elution at 0.3 mL/min. The detection was carried out on MS/MS with ESI in positive ion in the multiple reaction monitoring mode .The content of sulfonamides in pilose deer whip was quantified by external standard method.[Result] 18 kinds of sulfonamides had a good linear relationship between 0.05-50.00 ng/mL， the determination coefficient R2 were all greater than 0.999， LOD of 18 kinds of sulfonamides was 0.05 μg/kg， LOQ was 0.15 μg/kg. The average recovery of 18 sulfonamides was 83.5%-97.7%，RSD was less than 5%. [Conclusion]The method has the advantages of simple operation， remarkable purification effect， high sensitivity， good accuracy and low detection limit. It can be used for the determination of 18 sulfonamides in deer whip of Cervus nippon Temminck.

Key words QuEChERS;UPLCMS/MS;Cervus nippon Temminck;Deep whip;Sulfonamides

鹿鞭（Penis et Testis Cervi），又名鹿腎、鹿沖，系鹿科動物梅花鹿（Cervus nippon Temminck）、馬鹿（Cervuselaphus L.）的干燥帶睪丸的陰莖，其味甘、咸，性溫，具有補腎壯陽、固精益血的功能，可用于治療過度勞累所導(dǎo)致的身體損傷、腰酸腿痛、腎臟精氣陰陽不足、耳鳴、陽疹、宮冷不孕等癥[1]?；前奉愃幬铮╯ulfonamides，SAs）是由化學(xué)合成的一類抗生素，主要用來預(yù)防和治療細菌感染性疾病，具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)、抗菌高效、低毒、價格便宜和使用方便等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用到畜牧業(yè)上，并越來越受到養(yǎng)殖戶的重視。但磺胺類藥物在動物體內(nèi)代謝時間較長，食用含有磺胺類藥物的動物產(chǎn)品易在人體內(nèi)蓄積， 當(dāng)蓄積濃度超過一定值時會對人體健康產(chǎn)生危害[2]。人長期攝入含磺胺類藥物的動物性食品后，藥物不斷在人體內(nèi)蓄積，損害腎臟、耐菌株大量繁殖、破壞腸胃道微生物平衡等[3]。國際食品法典委員會和歐盟等規(guī)定食品中的磺胺總量不能超過100 μg/kg，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部235號文件中規(guī)定磺胺類藥物的總殘留量最高為100 μg/kg[4]。

目前，磺胺類藥物殘留的檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[5-6] 、高效液相色譜法（HPLC）[7-10] 、毛細管電泳法[11-13]、酶聯(lián)免疫分析法[14-16]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS）[17-20]等。HPLC法靈敏度低，抗干擾能力差;GC-MS法樣品需經(jīng)衍生化處理，操作復(fù)雜;毛細管電泳法由于進樣量少，因而制備能力差，靈敏度較低;酶聯(lián)免疫分析法重復(fù)性較低、穩(wěn)定性較差以及存在交叉反應(yīng)等;UPLC-MS法具有選擇性強、靈敏度高、檢測限低等優(yōu)點，是目前最常采用的獸藥殘留的檢測方法。

QuEChERS（quick easy cheap effective rugged safe），是近年來國際上最新發(fā)展起來的一種快速檢測的樣品前處理技術(shù)，具有快速、準(zhǔn)確、高效的特點[21-23]。目前，QuEChERS結(jié)合UPLC-MS法測定鹿鞭中磺胺類藥物的檢測方法鮮見報道。該研究采用QuEChERS法提取鹿鞭中的磺胺類藥物，以PSA、C18和中性氧化鋁為凈化劑，優(yōu)化了最優(yōu)提取和凈化條件，并通過UPLC-MS/MS以外標(biāo)法對市售鹿鞭中的18種磺胺進行了含量測定，以期為鹿茸的質(zhì)量評價研究提供了堅實的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器。

超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（XEVO TQ-MS質(zhì)譜儀，美國Waters公司）;多樣平行蒸發(fā)儀（Syncore101，瑞士步琪公司）;超純水器（美國Milli-Q Advantage A10）;電子天平（XS205DU，梅特勒-托利多公司）;高速冷凍離心機（Sigma3-30k，德國）;渦旋振蕩器（Multi-Tube Vortexer）;超聲波清洗儀（上海易凈超聲波儀器有限公司）。

1.1.2 試劑。

甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯，均購于賽默飛世爾科技公司，純度均大于99.99%;PSA（乙二胺基-N-丙基）粉末、C18粉末、中性氧化鋁粉末，40～63 μm，分析純，上海安譜科技股份有限公司;無水硫酸鈉、氯化鈉，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;磺胺醋酰（sulfacetamide）、磺胺吡啶（sulfapyridine）、磺胺嘧啶（sulfadiazine）、磺胺甲惡唑（sulfamethoxazole）、磺胺噻唑（sulfathiazole）、磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine）、磺胺二甲惡唑（sulfamoxol）、磺胺異惡唑（sulfisoxazole）、磺胺甲噻二唑（sulfamethizole）、磺胺苯酰（sulfabenzamide）、磺胺二甲嘧啶（sulfamethazine）、磺胺甲氧噠嗪（sulfamethoxypyridazine）、磺胺間甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine）、磺胺氯噠嗪（sulfachloropyridazine）、磺胺喹惡啉（sulfachinoxalin）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（sulfadoxine）、磺胺間二甲氧嘧啶（sulfadimethoxypyrimidine）、磺胺苯吡唑（sulfaphenazole），純度均98%以上，德國Dr.Ehrensorfer公司;超純水由超純水機制備，電阻率≥18.25 MΩ。

1.1.3 試材。梅花鹿鹿鞭樣品采集自吉林省，共計60根，將鹿鞭樣品進行編號，切片，置于100 ℃烘箱中烘24 h，粉碎，保存于4 ℃的冰箱中待測。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。

精密稱取各磺胺標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg（精確到0.1 mg）置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成200 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于4 ℃保存。

1.2.2 供試品溶液的制備。

1.2.2.1 提取。

準(zhǔn)確稱取鹿鞭樣品1.0 g（精確到0.01 g），置于50 mL玻璃試管中，加入10 mL乙腈，漩渦2 min，使其充分混勻，置于超聲儀中超聲提取20 min后，靜止3 min后，將提取液倒入50 mL聚丙烯離心管中，殘渣中加入10 mL乙腈重復(fù)上述步驟提取2次，合并提取液，置于離心機中，10 000 r/min離心10 min，取上清液，于蒸發(fā)儀中蒸發(fā)近干，待復(fù)溶凈化。

1.2.2.2 凈化。

加5 mL的甲醇-水（1∶1，V/V）復(fù)溶，加10 mL正己烷除脂，渦旋混勻，靜置待分層后取下清液轉(zhuǎn)移到裝有100 mg的C18、100 mg PSA和50 mg中性氧化鋁的10 mL離心管中，渦旋5 min充分混勻，置于4 ℃的離心機中，以15 000 r/min離心15 min，取上清液經(jīng)0.22 μm水系濾膜超濾后上機測定。

1.2.3 色譜條件。

色譜柱為ACQUITYBEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;柱溫為35 ℃;流速為0.3 mL/min;進樣量3 μL;流動相A為25 mmol/L甲酸乙腈，B為水。梯度洗脫程序見表1。

1.2.4 質(zhì)譜條件。

電離方式：正離子模式（ESI+）;掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）;毛細管電壓：3 kV;離子源溫度：150 ℃;脫溶劑溫度：450 ℃;碰撞氣流量：0.19 mL/min;脫溶劑氣流量：1 000 L/h。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇與優(yōu)化

試驗對乙腈、乙酸乙酯、甲醇、正己烷4種提取溶劑進行考察，結(jié)果表明（圖1），以強極性的甲醇為提取溶劑時，濃縮后瓶上附著有大量蛋白質(zhì)變性產(chǎn)物，形成較大的顆粒狀物質(zhì)，復(fù)溶時無法除盡，說明顆粒狀物質(zhì)包裹了目標(biāo)物，致使回收率下降;用正己烷、乙酸乙酯提取時，凈化后有較多絮狀脂肪難于分離沉淀，不利于過膜超濾;乙腈為提取溶劑時，能很好地分離沉淀蛋白質(zhì)和脂肪，18種磺胺的回收率均高于甲醇、正己烷、乙酸乙酯。因此試驗以乙腈作為提取劑。

2.2 提取條件的選擇與優(yōu)化

黃勝廣等[24]研究發(fā)現(xiàn)以玻璃試管為容器對目標(biāo)物的提取有利，試驗對超聲時間（5、10、15、20 min）進行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2），以20 min提取效果最好。

2.3 凈化劑的選擇與優(yōu)化

常用的凈化劑有PSA、C18、中性氧化鋁、石墨碳化黑和無水硫酸鎂等。無水硫酸鎂常用于吸附水分，石墨碳化黑可以有效地去除色素，對鹿鞭中的脂類無凈化作用;PSA和C18都能除去基質(zhì)中的脂肪、蛋白質(zhì)，中性氧化鋁可以除去一部分的脂肪。該試驗采用分散固相萃取技術(shù)進行凈化，根據(jù)鹿鞭的主要成分及目標(biāo)物的性質(zhì)，以PSA（100、150、200 mg）與C18（100、150、200 mg）、中性氧化鋁（50 mg）組合，通過加樣回收率考察最優(yōu)凈化條件。結(jié)果表明（圖3），以100 mg PSA、150 mg C18、50 mg中性氧化鋁凈化時為最優(yōu)凈化條件，18種磺胺的回收率為86.4%～106.5%，均能滿足試驗需求。隨著PSA用量的增加、C18超過150 mg，18種磺胺的回收率反而降低，這可能是過量的PSA、C18會吸附一部分的磺胺，致使回收率降低。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)磺胺類藥物的結(jié)構(gòu)，通過正離子、負離子掃描模式對比發(fā)現(xiàn)，[M+H]+產(chǎn)生的子離子豐度相對穩(wěn)定，響應(yīng)值比較高，保證了定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用針泵連續(xù)直接進樣，選擇[M+H]+為母離子進行調(diào)諧，分別對碰撞電壓、錐孔電壓等條件進行了優(yōu)化，具體參數(shù)見表2。

2.5 色譜條件的優(yōu)化

試驗考察了乙腈-水、25 mmol/L甲酸乙腈-水、乙腈-25 mmol/L甲酸水3種流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4），以25 mmol/L甲酸乙腈-水按“1.2.3”條件下洗脫時，18種磺胺的響應(yīng)值高、干擾少、峰形好、檢出限低，因此最終選定25 mmol/L甲酸乙腈-水為流動相。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限。

將混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用甲醇進行梯度稀釋，配成濃度為0.025、0.05、0.075、0.25、0.5、1、2、5、10、25、50 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將18種磺胺混合對照品溶液用甲醇逐級稀釋后，以信噪比（S/N）的3倍的溶液濃度為檢出限（LOD），S/N的10倍的溶液濃度為定量限（LOQ）。18種磺胺的回歸方程、線性范圍、 檢出限和定量限見表3。從表3可以看出，18種磺胺在0.05～50.00 ng/mL線性關(guān)系良好，決定系數(shù)R2均大于0.999，18種磺胺的LOD為0.05 μg/kg，LOQ為0.15 μg/kg。

2.6.2 精密度試驗。

精密吸取10 ng/mL的18種磺胺混合對照品溶液3 μL，按“1.2.4”質(zhì)譜條件和“1.2.3”色譜條件進樣分析，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，計算18種磺胺的RSD。結(jié)果表明，18種磺胺的峰面積RSD為3.2%～4.8%，表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗。

精密稱取1.0 g鹿鞭樣品，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、16、24、48 h按“1.2.3”色譜條件和“1.2.4”質(zhì)譜條件進樣分析，每次進樣3 μL，測定峰面積，計算18種磺胺的RSD。結(jié)果表明，18種磺胺的峰面積RSD為2.9%～4.5%，表明儀器穩(wěn)定性良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗。

稱取同一鹿鞭樣品6份，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，按“1.2.4”質(zhì)譜條件和“1.2.3”色譜條件進樣分析，每次進樣3 μL，測定峰面積，計算18種磺胺含量和RSD，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，18種磺胺的RSD為2.7%～4.3%，表明該試驗重復(fù)性良好。

2.6.5 加樣回收試驗。

精密稱取9份已知18種磺胺的鹿鞭樣品1.0 g，按照低、中、高劑量加入適量的18種磺胺標(biāo)準(zhǔn)品，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，按“1.2.4”質(zhì)譜條件和“1.2.3”色譜條件進樣分析，每次進樣3 μL，測定峰面積，計算18種磺胺含量和回收率及RSD。結(jié)果如表4，18種磺胺的平均加標(biāo)回收率為81.2%～98.4%，RSD為1.2%～4.8%，表明該試驗準(zhǔn)確度較高。

2.7 實際樣品檢測

試驗對60根鹿鞭樣品按“1.2.2”進行前處理，按“1.2.4”質(zhì)譜條件和“1.2.3”色譜條件進樣分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1份檢出磺胺甲惡唑，含量為0.14 μg/kg，其余的均未檢出。

3 結(jié)論

該試驗以乙腈為提取溶劑、超聲渦旋提取，PSA、C18與中性氧化鋁凈化，建立以UPLC-MS/MS法檢測梅花鹿鹿鞭中18種磺胺的檢測方法。該方法具有操作簡便、凈化效果顯著、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、檢出限低等優(yōu)點，可用于梅花鹿鹿鞭中18種磺胺的檢測。該方法的建立為鹿鞭的質(zhì)量評價研究提供了堅實的理論基礎(chǔ)。

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