王瑞莉 王劉艷 葉 桑 郜歡歡 雷 維 吳家怡 袁 芳 孟麗姣 唐章林 李加納 周清元 崔 翠

鋁毒脅迫下甘藍(lán)型油菜種子萌發(fā)期相關(guān)性狀的QTL定位

王瑞莉 王劉艷 葉 桑 郜歡歡 雷 維 吳家怡 袁 芳 孟麗姣 唐章林 李加納 周清元*崔 翠*

西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院, 重慶 400715

隨著土壤酸化的日益加重, 鋁毒已成為影響作物種子萌發(fā)質(zhì)量以及作物產(chǎn)量的重要脅迫因子之一。作物耐鋁相關(guān)性狀的QTL定位和候選基因篩選已有許多報道, 但鋁脅迫下甘藍(lán)型油菜萌發(fā)期相關(guān)性狀的QTL定位報道較少。本文以80 μg mL-1的鋁脅迫濃度處理重組自交系(10D130×中雙11號)群體進行種子萌發(fā)試驗, 處理3 d時調(diào)查發(fā)芽勢, 7 d時調(diào)查發(fā)芽率, 測定其根長、芽長和干重, 并計算各性狀相對值?；?K SNP芯片, 結(jié)合高密度遺傳連鎖圖譜對油菜萌發(fā)期的5個性狀進行QTL定位, 共檢測到23個QTL。其中與相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對根長、相對芽長和相對干重相關(guān)的QTL分別有9個、1個、4個、5個和4個, 覆蓋了A、C基因組, LOD值介于3.00~5.26, 可解釋的表型變異為7.70%~13.10%。根據(jù)各QTL置信區(qū)間序列篩選, 與鋁脅迫相關(guān)的候選基因共30個?；蚝突蚺c有機酸的合成和分泌有關(guān), 主要通過蘋果酸、檸檬酸和草酸等有機酸的分泌來增強植物的耐鋁性;基因、基因和基因均屬于轉(zhuǎn)錄激活因子, 通過誘導(dǎo)耐鋁基因的表達(dá)增強植株的抗性; ABC轉(zhuǎn)運蛋白、膜蛋白轉(zhuǎn)運體、GDSL脂肪酶通過減少有毒物質(zhì)在質(zhì)膜上的積累或?qū)⒂卸疚镔|(zhì)排出體外等途徑增強植物的耐鋁性; 過氧化物酶和細(xì)胞色素P450均屬于氧化脅迫相關(guān)基因, 具有防止植物細(xì)胞氧化損傷、抵御逆境脅迫的功能; 另外, 還有部分編碼逆境蛋白的基因, 均在各種脅迫反應(yīng)中起重要作用。本研究的結(jié)果將為培育耐鋁油菜品種及后續(xù)基因的功能研究提供理論依據(jù)。

甘藍(lán)型油菜; 萌發(fā)期; 單核苷酸多態(tài)性; 鋁脅迫; QTL; 候選基因篩選

鋁毒是酸性土壤中制約植物生長的重要因素之一[1]。在酸性土壤條件下(pH<5), 結(jié)合態(tài)鋁解離成有毒離子態(tài)從而降低土壤中養(yǎng)分利用率, 抑制植物生長[2], 使植物表現(xiàn)萎蔫矮小, 葉片黃化卷曲易老化、壞死等缺素癥狀[3]。我國油菜種植區(qū), 尤其是長江以南地區(qū)每年因為鋁毒危害造成的油菜減產(chǎn)相當(dāng)嚴(yán)重[4]。在甘藍(lán)型油菜的耐鋁毒研究中, 前人主要分析甘藍(lán)型油菜幼苗期或成株期的一些生理生化的變化, 包括油菜根系分泌的檸檬酸、蘋果酸、有機酸以及相關(guān)代謝酶的活性[5]、葉片的光合作用和有機物運輸、抗逆生理指標(biāo)[6]等。種子萌發(fā)期作為作物生長發(fā)育重要的起始階段, 直接影響作物的收獲及其經(jīng)濟效益。郜歡歡等[7]研究表明, 不同品種(系)油菜萌發(fā)期對鋁毒的耐性具有顯著性差異, 采用多種方法綜合性評價鋁毒對油菜相關(guān)性狀的影響, 成功篩選出萌發(fā)期耐鋁毒較強的油菜種質(zhì)。針對油菜萌發(fā)期耐鋁毒進行相關(guān)遺傳因子研究和挖掘耐逆基因, 有助于了解油菜對鋁脅迫的響應(yīng)機制, 對篩選和培育耐鋁油菜品種具有重要意義。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展, 分子標(biāo)記遺傳圖譜廣泛應(yīng)用于數(shù)量性狀基因研究。近年來, 研究者們利用分子標(biāo)記技術(shù), 通過全基因組關(guān)聯(lián)分析和QTL定位, 對多種作物相關(guān)性狀遺傳機制進行研究, 并取得巨大進展[8-13]。SNP標(biāo)記具有數(shù)量多, 分布廣和規(guī)模化等優(yōu)點, 已成功地應(yīng)用于油菜復(fù)雜性狀的QTL檢測。在農(nóng)藝性狀方面, Yang等[8]采用SNP分子標(biāo)記技術(shù), 對167個油菜品系的雙單倍體群體進行QTL分析, 鑒定出45個與油菜長角果相關(guān)性狀的QTL。薦紅舉等[9]利用2795個SNP位點的遺傳圖譜, 準(zhǔn)確定位了5種環(huán)境條件下甘藍(lán)型油菜千粒重的QTL, 共檢測到影響油菜千粒重的14個QTL, 并在置信區(qū)間內(nèi)篩選到16個與粒重相關(guān)的基因。Liu等[10]利用油菜60K SNP芯片技術(shù)構(gòu)建高密度遺傳圖譜, 在4種不同環(huán)境中, 對種子顏色與細(xì)胞壁纖維組分進行QTL定位, 共鑒定出與之相關(guān)的11個QTL。另外, SNP標(biāo)記也常被應(yīng)用于逆境脅迫下油菜相關(guān)性狀的QTL定位。Wan等[11]對214份油菜自交系萌發(fā)期的發(fā)芽率、根長、鮮重進行了耐鹽性評價, 利用GWAS共鑒定出110個SNP位點和56個可能與鹽脅迫相關(guān)的候選基因。侯林濤等[12]利用高密度SNP連鎖遺傳圖譜, 采用復(fù)合區(qū)間法, 對鹽脅迫環(huán)境下油菜幼苗的鮮重和干重進行QTL定位, 共檢測到與鹽脅迫相關(guān)的6個QTL, 并篩選到耐鹽基因8個。Zhang等[13]在油菜種子苗期利用SNP標(biāo)記對相對根長進行耐鎘性檢測, 通過GWAS找到4個與耐鎘性狀相關(guān)的QTL, 并挖掘出7個與耐鎘相關(guān)的候選基因。關(guān)于作物耐鋁毒分子機制的研究是當(dāng)今的熱點問題, 緩解和克服作物鋁毒害的最有效途徑是篩選耐鋁基因及培育耐鋁性強的作物。植物上獲得的第一個耐鋁毒基因是Sasaki等[14]用差減雜交技術(shù), 在鋁毒脅迫下從小麥(L.)根尖中分離得到的蘋果酸轉(zhuǎn)運蛋白基因。Huang等[15]從鋁敏感水稻(L.)突變體中克隆到一種屬于ABC家族的蛋白復(fù)合體基因, 該基因是植物耐鋁性相關(guān)的最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一。Liu等[16]發(fā)現(xiàn)了1個與鋁脅迫相關(guān)的基因,該基因是編碼多藥及毒性復(fù)合物排出轉(zhuǎn)運蛋白家族MATE, 且能夠促進檸檬酸的分泌從而增強植株的耐鋁性。鋁毒是影響作物產(chǎn)量的重要因素。盡管前人通過種質(zhì)資源篩選[7]、生理指標(biāo)測定[5-6]、耐鋁基因挖掘[14-16]等方法揭示鋁脅迫下油菜萌發(fā)期相關(guān)性狀的遺傳機理, 而利用SNP分子標(biāo)記技術(shù)定位鋁脅迫下油菜萌發(fā)期相關(guān)性狀QTL及篩選抗性基因, 迄今還未見報道。本研究利用油菜6K SNP芯片構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜, 通過QTL作圖法對鋁脅迫下油菜萌發(fā)期的相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對根長、相對芽長和相對干重進行定位, 并將油菜基因序列與擬南芥序列比對分析, 根據(jù)基因功能注解篩選可能與鋁脅迫相關(guān)的基因, 以期為選育和篩選油菜耐鋁品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為182份重組自交系(recombinant inbred lines, RILs)及其親本10D130和中雙11號(簡稱: ZS11)。該群體以10D130為母本, ZS11為父本進行雜交, 采用單粒傳法連續(xù)自交7代獲得。ZS11是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所選育的常規(guī)優(yōu)質(zhì)油菜品種, 10D130是由西南大學(xué)油菜工程技術(shù)研究中心通過羽衣甘藍(lán)和芥菜型油菜種間雜交, 在后代中選育獲得的衍生品系。2017—2018年在重慶市北碚區(qū)歇馬鎮(zhèn)油菜試驗基地種植實驗材料, 在油菜初花期套袋自交, 種子完全成熟后收取每株系5株正常植株的種子, 自然風(fēng)干后保存。所有材料均由西南大學(xué)油菜工程技術(shù)研究中心提供。

1.2 適宜鋁脅迫濃度篩選

配制溶液的試劑為A1Cl3·6H2O, 設(shè)0(CK)、20、40、60、80、100、120和140 μg mL-18個鋁脅迫濃度。分別從ZS11與10D130兩個親本中選擇大小均勻, 籽粒飽滿的20粒種子進行鋁脅迫試驗。首先用75%濃度乙醇對供試種子消毒, 用蒸餾水清洗3次。然后將其均勻擺放在鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中, 分別加入3 mL不同濃度的鋁毒溶液。每處理重復(fù)3次。每隔2 d更換培養(yǎng)皿中濾紙并補充相應(yīng)濃度的鋁脅迫溶液。將培養(yǎng)皿置光照培養(yǎng)箱萌發(fā)生長, 箱內(nèi)溫度25℃, 相對濕度85%, 光暗時間16 h /8 h。7 d后測定其胚根長度, 通過根長篩選耐鋁脅迫的適宜濃度。

1.3 重組自交系群體耐鋁性篩選

按照濃度篩選時的方法和培養(yǎng)條件對182份甘藍(lán)型油菜用篩選出來的鋁濃度進行種子萌發(fā)脅迫試驗。處理3 d時統(tǒng)計發(fā)芽勢, 7 d時從每個培養(yǎng)皿中隨機選擇10株長勢基本一致的幼苗統(tǒng)計發(fā)芽率、根長和芽長(下胚軸長), 并將這10株幼苗在105℃下殺青10 min, 75℃烘干24 h后測量干重。用于計算相對發(fā)芽勢(relative germination vigor, RGV), 相對發(fā)芽率(relative germination rate, RGR)、相對根長(relative root length, RRL)、相對芽長(relative bud length, RBL)及相對干重(relative dry weight, RDW)值, 求取平均值。以蒸餾水處理種子萌發(fā)作為對照, 且對照和處理均設(shè)置3次重復(fù)。

各性狀的相對值=脅迫下的性狀測定值/對照性狀測定值。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

運用DPS 19.0[17]對處理后的數(shù)據(jù)進行方差分析、相關(guān)性分析, 運用SPSS 17.0[18]對重組自交系的表型數(shù)據(jù)進行描述性統(tǒng)計, 計算其最大值、最小值、均差、標(biāo)準(zhǔn)差等。

1.5 遺傳圖譜的構(gòu)建及QTL定位分析

從每個株系5個幼嫩植株取葉片混合樣0.15 g, 利用DNA提取試劑盒DP321-03 (天根, 中國北京)提取DNA并稀釋至50 ng μL-1用于SNP標(biāo)記分析。嚴(yán)格按照Infinium HD Assay Ultra操作說明書(Illumina Inc公司)進行DNA樣品的預(yù)處理(等位擴增、片段化及富集)、與芯片雜交、洗滌、安裝流動室、單堿基延伸、染色及包埋。芯片準(zhǔn)備好后運用Illumina HiScan掃描儀的iScan Control Software軟件掃描, 然后利用GenomeStudio genotyping software v2011軟件分析掃描結(jié)果, 獲取各個樣本的SNP基因型數(shù)據(jù), 并為獲得的SNP標(biāo)記命名, 命名方法以A-9550556為例, A表示SNP, 95505568代表GenomeStudio genotyping software生成的相應(yīng)SNP位點索引號。構(gòu)建連鎖圖譜采用JoinMap 4.0軟件[19], 選用Kosambi[20]函數(shù)將重組值轉(zhuǎn)換為圖距單位(cM), 取最小閾值LOD2.0對所有標(biāo)記分組, 每個染色體上標(biāo)記順序通過兩兩標(biāo)記之間最小重組頻率計算, 構(gòu)建用于QTL定位的遺傳連鎖圖譜。

采用軟件Map QTL對相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對根長、相對芽長、相對干重進行QTL定位及效應(yīng)檢測。LOD≥3時, 即認(rèn)為該區(qū)間可能存在一個QTL。QTL按照McCouch等[21]的方法命名, 即小寫字母“q”加上性狀縮寫名字、染色體和QTL序號。其中QTL的序號是指同一條染色體上多個QTL按LOD值的大小為標(biāo)準(zhǔn)進行排序, 如表示相對發(fā)芽勢在A01染色體上的第1個QTL。

1.6 候選基因分析

將檢測到的QTL的置信區(qū)間在甘藍(lán)型油菜基因組上查詢到對應(yīng)的序列, 然后與TAIR網(wǎng)站上的擬南芥基因組序列進行Blast比對, E-value閾值設(shè)置為E–20[22], 篩選出可能與鋁脅迫相關(guān)的候選基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜鋁脅迫濃度的篩選

由圖1可以看出, 隨著鋁脅迫濃度增加, 兩親本的相對根長均呈下降趨勢, 但兩親本的下降幅度不同。鋁脅迫濃度為20 μg mL-1、40 μg mL-1、60 μg mL-1時, 兩親本的相對根長下降幅度相近, 無顯著差異。鋁脅迫濃度為120 μg mL-1、140 μg mL-1時, 10D130受到嚴(yán)重抑制, 部分根和芽萎蔫縮小甚至腐爛死亡, 不利于品種間耐鋁性差異篩選。但鋁脅迫濃度在80 μg mL-1、100 μg mL-1時, ZS11對鋁脅迫的耐受能力明顯比10D130強, 根系的生長在親本間受到的影響不同并能夠較好地區(qū)分品種間耐鋁性差異。但是油菜在鋁脅迫濃度80 μg mL-1時的根長較100 μg mL-1時易觀察, 更有利于后期試驗。故選擇80 μg mL-1鋁脅迫濃度為油菜萌發(fā)期耐鋁毒種質(zhì)資源篩選的適宜濃度。

圖1 不同濃度鋁對油菜相對根長的影響

2.2 親本及重組自交系群體表型性狀分析及相關(guān)性分析

在80 μg mL-1鋁脅迫條件下測定182份油菜的5個性狀, 并統(tǒng)計其相對值, 結(jié)果如表1。各性狀變異系數(shù)為13.40%~31.30%, 其中相對發(fā)芽率變異系數(shù)最小, 為13.40%, 相對根長的變異系數(shù)最大, 為31.30%。由圖2可以看出, 重組自交系群體各性狀相對值均連續(xù)變化, 適合于QTL分析。

鋁脅迫下, 相對發(fā)芽勢與相對發(fā)芽率呈顯著正相關(guān), 相關(guān)系數(shù)為0.404; 相對根長與相對發(fā)芽率極顯著負(fù)相關(guān), 相關(guān)系數(shù)為0.252; 相對干重與相對發(fā)芽勢顯著負(fù)相關(guān), 相關(guān)系數(shù)為0.148。相對芽長與其他相關(guān)性狀指標(biāo)相關(guān)不顯著(表2)。

2.3 遺傳連鎖圖譜

利用包含5058個標(biāo)記的6K SNP芯片對186個RILs材料進行基因型鑒定, 從中篩選出1897個高質(zhì)量多態(tài)性的SNP標(biāo)記, 約占37.5%?；谶@些標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。獲得用于QTL定位的圖譜覆蓋甘藍(lán)型油菜基因組3214.19 cM, 平均圖距為1.69 cM。每條染色體長度范圍為86.51~98.72 cM, 平均長度為169.17 cM。染色體標(biāo)記數(shù)目在24~153之間, 平均數(shù)目為99.84個。但各染色體分布不均, 其中染色體A03、C03和C04上標(biāo)記分布較多, 分別為139、147和153個; 而染色體C05、C08和C09上的標(biāo)記數(shù)目較少, 分別只有48、26和24個。此外各染色體標(biāo)記密度也有較大差異, C04密度最大, 平均間距僅1.10 cM, 而密度最小的C08平均間距達(dá)6.13 cM。

2.4 油菜耐鋁相關(guān)性狀QTL分析

檢測到與鋁脅迫相關(guān)的QTL 23個(圖3和表3), 分別位于A01、A02、A03、A08、A09、A10、C01、C03、C04和C08染色體上, A基因組與C基因組分別有17個和6個, LOD值介于3.00~5.26, 能夠解釋的表型變異為7.70%~13.10%。

2.4.1 相對發(fā)芽勢與相對發(fā)芽率的QTL 鋁脅迫條件下, 檢測到9個與相對發(fā)芽勢相關(guān)的QTL, 分別位于A01、A03、A08、C01、C03染色體, 可解釋的表型變異為7.70%~13.10%。其中可解釋的表型最高, 為13.10%, 位于A08染色體, 加性效應(yīng)為-0.0402, 增效基因來自于ZS11。檢測到1個與相對發(fā)芽率相關(guān)的QTL, 分布在C04染色體上, 貢獻(xiàn)率為8.00%。

表1 重組自交系群體及親本油菜在鋁脅迫環(huán)境下各性狀的分布特征

*和**表示各性狀間分別在0.05和0.01水平上顯著相關(guān)。

*and**show significant correlations among cultivars at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively. RGV: relative germination vigor; RGR: relative germination rate; RRL: relative root length; RBL: relative bud length; RDW: relative dry weight.

圖2 最適鋁脅迫處理下油菜品系各性狀相對值的頻率分布圖

RGV: 相對發(fā)芽勢; RGR: 相對發(fā)芽率; RRL: 相對根長; RBL: 相對芽長; RDW: 相對干重。

RGV: relative germination vigor; RGR: relative germination rate; RRL: relative root length; RBL: relative bud length; RDW: relative dry weight.

表2 油菜種子鋁脅迫處理后各性狀間的相關(guān)性分析

**表示在0.01水平差異顯著。

**Significance at the 0.01 probability level.

RGV: relative germination vigor; RGR: relative germination rate; RRL: relative root length; RBL: relative bud length; RDW: relative dry weight.

2.4.2 相對根長與相對芽長的QTL 檢測到與相對根長相關(guān)的QTL 4個, 分布在A03、A09、C03染色體上, 可解釋的表型變異為8.00%~8.60%。其中,可解釋的表型最高, 位于A09染色體上。此外, 檢測到與相對芽長相關(guān)的QTL有5個, 分布在A03、A08、A09、C08染色體上, 表型變異為8.00%~11.90%。其中, 貢獻(xiàn)率最大為11.9%,位于C08染色體上, 加性效應(yīng)值為0.0115。

2.4.3 相對干重的QTL 檢測到與相對干重相關(guān)的QTL有4個, 分布在A09、A10染色體上, 可解釋表型變異7.80%~10.30%。其中,可解釋的表型變異最大, 貢獻(xiàn)率為10.30%, 位于A10染色體上。

表3 利用復(fù)合區(qū)間作圖法檢測到油菜萌發(fā)期在鋁脅迫下的QTL

RGV: relative germination vigor; RGR: relative germination rate; RRL: relative root length; RBL: relative bud length; RDW: relative dry weight. PVE:phenotypic variance explained. effect.

2.5 候選基因的篩選

根據(jù)已經(jīng)公布的甘藍(lán)型油菜基因組測序結(jié)果, 將23個QTL置信區(qū)間內(nèi)的甘藍(lán)型油菜序列與擬南芥的序列比對, 并注釋和分析候選基因功能, 共篩選出30個可能與鋁毒脅迫相關(guān)的候選基因(表4)。

相對發(fā)芽勢區(qū)間內(nèi)篩出12個與鋁毒脅迫相關(guān)的候選基因。A01染色體上的基因BnaA01g26740D和A08染色體上的基因BnaA08g26970D分別與擬南芥基因AT3G18440和AT1G08430同源, 均為多種酸的轉(zhuǎn)運蛋白, 主要通過分泌蘋果酸來增強植株的耐鋁性。A08染色體上的基因BnaA08g30510D和基因BnaA08g01910D分別與擬南芥基因AT1G24620和AT2G19600同源, 均參與植物生長發(fā)育中非生物脅迫的調(diào)控。A03染色體上的基因BnaA03g57410D 和C01染色體上的BnaC01g23380D 分別與擬南芥基因AT3G06130和AT3G51490同源, 均與有害金屬的結(jié)合或解毒有關(guān), 限制植物細(xì)胞的氧化損傷。A03染色體上的基因BnaA03g39800D、BnaA03g 03270D與C03染色體上的基因BnaC03g 08920D分別與擬南芥基因AT5G61240、AT5G11250和AT5G 18370同源, 均可增強植株的抗病性和防御功能。A03染色體上的基因BnaA03g13730D與擬南芥基因AT2G30140同源, 與乙酰氨基葡糖脫乙酰酶有關(guān), 響應(yīng)于抗菌的反應(yīng)。A03染色體上的基因BnaA03g14650D與擬南芥基因AT2G31660同源, 在大多數(shù)植物組織中表達(dá), 參與脫落酸激活反應(yīng)。

相對發(fā)芽勢的QTL置信區(qū)間內(nèi)找到1個與鋁毒脅迫相關(guān)的候選基因。在C04染色體上的基因BnaC04g12580D與擬南芥基因AT2G27780同源, 是一種轉(zhuǎn)錄因子, 通過誘導(dǎo)耐逆基因的表達(dá)增強植株的耐逆性。

圖3 甘藍(lán)型油菜耐鋁脅迫QTL在SNP連鎖群上的分布情況

RGV: 相對發(fā)芽勢; RGR: 相對發(fā)芽率; RRL: 相對根長; RBL: 相對芽長; RDW: 相對干重。

RGV: relative germination vigor; RGR: relative germination rate; RRL: relative root length; RBL: relative bud length; RDW: relative dry weight.

相對根長的QTL置信區(qū)間內(nèi)找到7個與鋁毒脅迫相關(guān)的候選基因。在A03染色體上的基因BnaA03g54580D和C03染色體上的基因BnaC03g 04310D與擬南芥基因AT1G34370和AT5G44050同源, 與有機酸的分泌有關(guān)。位于A09染色體上的基因BnaA09g14610D與擬南芥基因AT3G43570同源, 是GDSL脂肪酶具有廣泛底物特異性的水解酶。位于A09染色體上的基因BnaA09g11920D擬南芥基因AT1G64065同源, 與LEA蛋白有關(guān)。位于A03染色體上的基因BnaA03g35920D擬南芥基因AT3G 20750同源, 屬于鋅指蛋白, 在調(diào)控植物生長發(fā)育和應(yīng)對逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用。位于C03染色體上的基因BnaC03g65810D與擬南芥基因AT4G34710同源, 是一種精氨酸脫羧酶, 催化多胺生物合成, 參與植物的各種非生物脅迫響應(yīng)。

相對芽長的QTL置信區(qū)間內(nèi)找到7個與鋁毒脅迫相關(guān)的候選基因。在A03染色體上的基因BnaA03g 39360D與擬南芥基因AT5G02490同源, 屬于熱擊蛋白。位于A08染色體上的基因BnaA08g 01480D和A09染色體上的基因BnaA09g30790D與擬南芥基因AT1G52490和AT1G22220同源, 為F-box蛋白家族成員。位于A09染色體上的基因BnaA09g02290D和A08染色體上的基因BnaA08g28220D分別與擬南芥基因AT3G28415和AT1G05250同源, 前者屬于ABC轉(zhuǎn)運蛋白的多藥抗性相關(guān)蛋白, 后者是過氧化物酶, 具有較強的防御措施。位于A09染色體上的基因BnaA09g30810D與擬南芥基因AT1G22190同源, 該基因編碼一種假定的轉(zhuǎn)錄因子, 響應(yīng)滲透脅迫及非生物脅迫。位于C08染色體上的基因BnaC08g07240D擬南芥基因AT1G33110同源, 屬于多藥及毒性復(fù)合物排出轉(zhuǎn)運蛋白家族。

相對干重的QTL置信區(qū)間內(nèi)找到3個與鋁脅迫相關(guān)的候選基因。A09染色體上的基因BnaA09g 48330D與擬南芥基因AT1G49360同源, 為F-box蛋白家族成員, 調(diào)控植物的抗逆反應(yīng)。A10染色體上的基因BnaA10g24620D與擬南芥基因AT3G26180同源, 為細(xì)胞色素P450基因家族成員。A10染色體上的基因BnaA10g25760D與擬南芥基因AT5G 04410同源, 該基因作為轉(zhuǎn)錄激活因子可調(diào)節(jié)類黃酮生物合成, 增加植物類黃酮的含量, 能增強植物抵御逆脅迫的能力。

表4 甘藍(lán)型油菜基因組中QTL置信區(qū)間候選基因與擬南芥逆境脅迫相關(guān)基因的比對

RGV: relative germination vigor; RGR: relative germination rate; RRL: relative root length; RBL: relative bud length; RDW: relative dry weight.

3 討論

3.1 表型及QTL定位分析

土壤中積累過多的離子態(tài)鋁對油菜的生長發(fā)育具有顯著影響, 尤其對植物根部損害極大[44]。研究表明不同作物間或同一作物不同品種間的耐鋁性均存在差異[45], 因此適宜的鋁脅迫濃度是篩選油菜萌發(fā)期耐性資源的關(guān)鍵。根據(jù)前人經(jīng)驗[46], 本試驗設(shè)計了8個濃度梯度進行鋁脅迫濃度篩選, 最后篩選出與郜歡歡等[7]研究結(jié)果相近的80 μg mL-1鋁溶液作為種子萌發(fā)期的處理濃度, 并以該溶液處理182份油菜種子, 綜合分析相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對根長、相對芽長、相對干重5個性狀, 這些相對性狀均表現(xiàn)出廣泛的表型變異, 且數(shù)據(jù)呈現(xiàn)連續(xù)性分布, 符合數(shù)量性狀遺傳特征, 適宜于QTL分析。

近年來, 分子標(biāo)記技術(shù)多被用于研究作物耐逆性狀, 在篩選優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗育種中發(fā)揮著重要作用[47]。過去常用于遺傳連鎖圖譜構(gòu)建的第二代分子標(biāo)記主要是RFLP、AFLP、RFLP、ISSR和SSR等, 但這些傳統(tǒng)的標(biāo)記構(gòu)建的高密度遺傳連鎖圖譜是有限的, 而且耗時耗力。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展, SNP因具有良好的多態(tài)性和極高的豐度成為植物遺傳育種研究中的理想遺傳標(biāo)記[48], 眾多研究者利用SNP標(biāo)記對多種作物進行遺傳連鎖圖譜構(gòu)建。如周清元等[49]運用全基因關(guān)聯(lián)分析, 研究苯磺隆殘留對油菜種子萌發(fā)的影響, 檢測到16個SNP位點, 篩選出了25個可能與苯磺隆相關(guān)的候選基因。衛(wèi)銀可等[50]利用SNP標(biāo)記研究了鹽脅迫下甘藍(lán)型油菜種子萌發(fā)的影響, 共檢測到24個與表型相關(guān)的位點。

關(guān)于作物響應(yīng)鋁脅迫的分子機理方面, 研究者已經(jīng)利用分子標(biāo)記在水稻(L.)[51]、小麥(L.)[52]、玉米(L.)[53]中檢測到多個耐鋁毒相關(guān)的QTL和候選基因, 這些結(jié)果為多方面挖掘耐鋁基因, 完善作物耐鋁毒評價體系提供一定的參考。本研究利用高密度SNP遺傳圖譜, 對鋁毒脅迫處理下的182份油菜種子的相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對根長、相對芽長、相對干重進行QTL定位分析, 共檢測到23個QTL, 分布于A01、A02、A03、A08、A09、A10、C01、C03、C04和C08染色體上。其中, 在A03染色體上同時檢測到相對發(fā)芽勢、相對芽長以及相對根長相關(guān)QTL。同樣, A08、A09、C01、C03染色體上的同一區(qū)域均存在2個或2個以上相對性狀的QTL, 即熱區(qū)現(xiàn)象[54]。另外, 本研究在A08染色體2.275~12.834 cM處連續(xù)檢測到相對發(fā)芽勢與相對發(fā)芽率位點, 在A03染色體179.611~ 222.454 cM處檢測到的相對發(fā)芽勢和相對根長重疊, 表明這些QTL具有“一因多效”作用。

3.2 候選基因篩選

植物的耐鋁性能主要與外部排斥和內(nèi)部耐受機制有關(guān)。外部排斥主要通過細(xì)胞壁與鋁的結(jié)合形成沉淀物[55]、質(zhì)膜對鋁的選擇透性[56]、根際周圍較高的pH值[57]、根冠細(xì)胞分泌出的粘性物及根系磷酸的分泌[58]等阻止植株吸收大量的鋁從而減輕鋁毒害,內(nèi)部耐受機制主要與細(xì)胞內(nèi)有機酸鰲合[59]、逆境蛋白質(zhì)[60]、抗鋁酶的誘導(dǎo)及酶活性的提高[61]有關(guān), 使植物根系將已吸收的離子態(tài)鋁轉(zhuǎn)化成結(jié)合態(tài)的鋁, 從而緩解體內(nèi)鋁毒害作用。目前, 有機酸的分泌被認(rèn)為是植物耐鋁最重要的一個機制[62]。鋁脅迫下植物分泌的有機酸主要有蘋果酸、檸檬酸和草酸。本文中,和基因在多個QTL區(qū)間內(nèi)出現(xiàn)。在相對發(fā)芽勢的物理區(qū)間內(nèi)檢測到基因, 其主要通過分泌的蘋果酸來增強植株的抗逆性[14]。相對根長和相對芽長的物理區(qū)間內(nèi)檢測到的基因?qū)儆诙嗨幖岸拘詮?fù)合物排出轉(zhuǎn)運蛋白家族, 該基因主要通過控制Al3+激活檸檬酸的釋放來增強植株的耐鋁性[16]。相對根長的物理區(qū)間內(nèi)檢測到的基因, 在植株受到鋁脅迫時被活化, 激活的蛋白進一步誘導(dǎo)植物體內(nèi)其他的耐鋁基因轉(zhuǎn)錄分泌更多的有機酸來增強植株的抗性[15]。

植物受到逆境脅迫時會激活一系列分子途徑并調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)和生理反應(yīng)來適應(yīng)逆境[63]。如植物體內(nèi)會誘導(dǎo)一些酶產(chǎn)生。本文中, 在A09染色體上的基因BnaA09g14610D編碼GDSL脂肪酶[35], 于A08染色體上的基因BnaA08g28220D編碼過氧化物酶[41], 均在多種植物的防御反應(yīng)中起作用。此外, 植物體內(nèi)會通過一些激活因子調(diào)節(jié)某些化合物的生成來維持正常的生理生化代謝。如植物體內(nèi)生成的黃酮類化合物, 通過消耗過剩的磷酸丙糖、ATP和NADPH形成能量安全閥, 從而減輕非生物脅迫造成的損傷[43]。本文在A10染色體上篩選到一個BnaA10g25760D基因, 該基因作為一種轉(zhuǎn)錄激活因子調(diào)節(jié)植物體內(nèi)黃酮類生物合成。此外還找出多種與逆境脅迫相關(guān)的蛋白, 如在A09染色體篩選到的基因BnaA09g30790D編碼F-box蛋白, 該蛋白多數(shù)情況下以SCF復(fù)合體泛素化蛋白降解逆境蛋白的方式調(diào)控植物的抗逆反應(yīng)[38]。位于A09染色體上的基因BnaA09g11920D編碼的LEA蛋白, 是一組含有大量甘氨酸的親水性極強蛋白, 對多種非生物脅迫具有很強的抵抗能力[34]。位于A03染色體上的基因BnaA03g20750和BnaA03g39360D分別編碼熱擊蛋白[32]和鋅指蛋白[37], 均與植物的逆境脅迫有關(guān)。

4 結(jié)論

共檢測到鋁脅迫下23個油菜種子萌發(fā)相關(guān)性狀的QTL, 覆蓋A、C基因組, 貢獻(xiàn)率超過10%的有9個, 最大貢獻(xiàn)率是13.10%。得到30個耐逆相關(guān)基因, 這些基因可能主要通過有機酸的分泌、轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)耐鋁基因的表達(dá)和抗氧化防御來促進油菜對鋁脅迫的抗逆性。

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QTL mapping of seed germination-related traits inL. under aluminum toxicity stress

WANG Rui-Li, WANG Liu-Yan, YE Sang, Gao Huan-Huan, LEI Wei, WU Jia-Yi, YUAN Fang, MENG Li-Jiao, TANG Zhang-Lin, LI Jia-Na, ZHOU Qing-Yuan*, and CUI Cui*

College of Agronomy and Biotechnology, Southwestern University, Chongqing 400715, China

With the aggravation of soil acidification, aluminum toxicity has become one of the important stress factors that affect crop seed germination quality and crop yield. There have been many reports on QTL mapping and candidate gene screening for aluminum tolerance related traits in crops, but few reports on QTL mapping for aluminum tolerance during germination inL. The seed germination test was conducted on the recombinant inbred line population treated with 80 μg mL-1aluminum solution and with distilled water as control. Germination potential was investigated at 3 d, germination rate was investigated at 7 d, root length, bud length and dry weight were measured, and the relative values of various characters were calculated. Based on 6K SNP chip and combined with high density genetic linkage map, we detected 23 QTLs for five traits in rape germination period. QTLs for relative germination potential, relative germination rate, relative root length, relative bud length and relative dry weight were 9, 1, 4, 5, and 4 respectively, covering A and C genomes, with LOD values from 3.00 to 5.26, and interpretable phenotypic variation from 7.70% to 13.10%. According to the confidence interval sequence of each QTL, 30 candidate genes related to aluminum stress were screened.gene andgene are related to the synthesis and secretion of organic acids, which mainly enhance the aluminum tolerance of plants through the secretion of organic acids such as malic acid, citric acid and oxalic acid.gene,gene andgene all belong to transcription activation factors, which enhance the resistance of plants by inducing the expression of aluminum tolerance genes. ABC transporter, membrane protein transporter, GDSL lipase enhance aluminum tolerance of plants by reducing accumulation of toxic substances on plasma membrane or discharging toxic substances out of body. Peroxidase and cytochrome P450 are genes related to oxidative stress, which have the functions of preventing oxidative damage of plant cells and resisting stress. At the same time, many genes encoding stress proteins were found, which play an important role in various stress reactions.The results of this study provide a theoretical basis for the cultivation of aluminum-tolerant rape varieties and the functional research of subsequent genes.

L.; germination;single nucleotide polymorphism;aluminum stress; QTL; candidate gene

10.3724/SP.J.1006.2020.94154

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2018YFD0100500), 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-12)和重慶市技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用發(fā)展(cstc2019jscx-msxmX0383)項目資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2018YFD0100500), the China Agriculture Research System (CARS-12), and the Technological Innovation and Application Development in Chongqing (cstc2019jscx-msxmX0383).

周清元, E-mail: qingyuan@swu.edu.cn; 崔翠, E-mail: cuicui@swu.edu.cn

E-mail: 1525731297@qq.com

2019-10-16;

2020-01-15;

2020-02-19.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200218.1918.005.html