曹小方，方祥位,1b，劉漢龍,1b，張楠，張娟

(1.重慶大學(xué) a.土木工程學(xué)院；b.山地城鎮(zhèn)建設(shè)與新技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c.產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，重慶 400045； 2.重慶工商大學(xué) 通識(shí)學(xué)院，重慶 400020)

石油作為重要的能源之一，在開采、運(yùn)輸、加工和產(chǎn)品的使用過(guò)程中由于操作不慎或偶然事故容易造成相當(dāng)量的石油進(jìn)入自然界，這已經(jīng)成為世界性環(huán)境問題，土壤汽油污染是石油在生產(chǎn)過(guò)程中造成的污染之一[1]。

近年來(lái)，隨著人們環(huán)保意識(shí)的不斷增強(qiáng)，加強(qiáng)土壤生態(tài)環(huán)境的保護(hù)，進(jìn)行石油污染土壤修復(fù)的研究已經(jīng)成為決策層和科研工作者的共識(shí)[2]。通常用于石油污染土壤的修復(fù)技術(shù)包括物理修復(fù)法(如焚燒法、隔離法、換土法、超聲清洗法等)，化學(xué)修復(fù)法(如化學(xué)淋洗技術(shù)、化學(xué)鈍化技術(shù)等)，利用豆科、禾本科或觀賞植物修復(fù)法，微生物修復(fù)法，植物和微生物聯(lián)合修復(fù)法等[3-7]。微生物修復(fù)法即利用微生物的代謝活動(dòng)來(lái)降解污染物，減少或最終消除污染的過(guò)程[8-9]。與物理、化學(xué)方法相比，生物修復(fù)對(duì)人和環(huán)境造成的影響小，且修復(fù)費(fèi)用僅為傳統(tǒng)物理、化學(xué)修復(fù)的30%～50%，是一種高效、經(jīng)濟(jì)和環(huán)境友好的修復(fù)技術(shù)[10]。已有研究表明，利用土著微生物降解土壤中的汽油效率低且時(shí)間長(zhǎng)，在處理汽油污染土的過(guò)程中，僅靠土壤中的土著微生物無(wú)論是修復(fù)效果還是修復(fù)時(shí)間都不夠理想，往往需要人為投入高效降解菌劑或者人為投放改性表面活性劑。微生物修復(fù)法是目前最有前途的方法之一，通過(guò)這種有效和環(huán)保的方式來(lái)減少污染，既能降低石油烴在生產(chǎn)、運(yùn)輸、消費(fèi)過(guò)程中對(duì)公眾健康和自然資源產(chǎn)生的危害，且成本低，又能減少二次污染[11]。

卞立紅等[12]利用石油污染土中提取的D和H兩種菌，研究了兩種菌的混合菌對(duì)油田采出水中聚丙烯酰胺和石油烴的降低效果，試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)復(fù)合菌接種量體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，合成培養(yǎng)基的降解效果最好。楊洋等[13]通過(guò)對(duì)西南印度洋中脊與印度洋中部深海沉積物中石油降解菌的富集培養(yǎng)和分離鑒定，發(fā)現(xiàn)有很多細(xì)菌對(duì)石油烴都有降解效果。宜慧等[14]通過(guò)單因素試驗(yàn)和多因素正交試驗(yàn)得出各因素對(duì)TPH降解率影響程度的大小次序和最適處理?xiàng)l件下菌株SC-6的TPH降解率，并且通過(guò)原油污染土壤生物修復(fù)試驗(yàn)得出，高效石油烴降解菌的投加有利于土壤TPH降解率和酶活性的提高。彭懷麗等[15]以正十六烷作為唯一碳源從石油污染土中篩選出一株能夠很好地降解正十六烷的菌株TZSX2，菌株的最適生長(zhǎng)和降解溫度在28～36 ℃之間，在低溫15 ℃以下和高溫45 ℃時(shí)對(duì)正十六烷的降解率仍在10%以上。

以上研究表明，土著微生物對(duì)石油烴污染有降解能力，經(jīng)過(guò)人為提純、改性和誘變等手段使土著微生物成為專性降解菌更有利于污染物的降解。但僅靠微生物自身的降解能力有時(shí)很難滿足修復(fù)中所要達(dá)到的降解效果，往往需要人為投加生物表面活性劑(BS)。將表面活性劑(SAA)技術(shù)應(yīng)用于修復(fù)石油污染土壤的微生物治理技術(shù)是近些年興起的一種工程技術(shù)。表面活性劑強(qiáng)化土壤洗滌是一種快速有效的PAHs污染土壤修復(fù)方法[16-18]。Pourfadakeri等[19]、孫霞等[20]、榮璐閣[21]、吳雪茜[22]均通過(guò)降解試驗(yàn)證實(shí)，通過(guò)人為加入表面活性劑，降解菌的降解效果得到了較大提升。

無(wú)論以石油污染土、潤(rùn)滑油污染土、礦物油污染土還是柴油污染土為試驗(yàn)對(duì)象，已有的試驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)人為投入高效降解菌劑和人為投放改性表面活性劑這兩種方式均有利于污染土的降解。在石油烴污染土微生物技術(shù)修復(fù)方面已有較多研究成果，但關(guān)于汽油污染土混合降解菌的降解試驗(yàn)卻鮮有報(bào)道。筆者以人為拌制的汽油污染土為研究對(duì)象，通過(guò)向其中加入實(shí)驗(yàn)室自行提取的5種石油烴降解菌的混合菌懸液，研究pH值、溫度、土壤含水率及降解菌接種量等對(duì)混合降解菌降解汽油污染土能力的影響，得到降解的優(yōu)化環(huán)境條件，為汽油污染土的微生物修復(fù)技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)概況

1.1 菌種的提取與鑒定

用于菌種提取的石油污染土取自甘肅省成縣油氣管道轉(zhuǎn)換站地表層以下2～15 cm處。菌種提取所用培養(yǎng)基配方如下：

1)LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.00 g，酵母粉0.50 g，NaCl 1.00 g，蒸餾水定容至100 mL，用2 mol/L NaOH和1 mol/L HCL調(diào)節(jié)pH值為7，高溫蒸汽滅菌20 min(固態(tài)培養(yǎng)基需加瓊脂粉2.00 g)。

2)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：NaCl 0.1 g，NH4Cl 0.05 g，KCl 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，CaCl2和FeCl3·6H2O痕量，蒸餾水定容到100 mL，高溫蒸汽滅菌30 min。

3)降油培養(yǎng)基：NaCl 10 g，NH4Cl 0.50 g，KH2PO40.50 g，K2HPO41.0 g，MgSO40.50 g，CaCl20.1 g，KCl 0.10 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水定容至1000 mL，95號(hào)汽油4 g，pH值7.2，121 ℃滅菌20 min。

石油污染土中菌種提取的步驟為：稱取石油污染土1.0 g放入裝有9.0 mL無(wú)菌生理鹽水的試管內(nèi)，利用梯度稀釋法對(duì)其進(jìn)行稀釋，從10-3、10-4和10-5這3個(gè)梯度中用移液器吸取20 μL的稀釋液，經(jīng)接種、滅菌、涂布、培養(yǎng)等步驟后，觀察并記錄菌落形態(tài)，挑取不同形態(tài)的單菌落接種到固體培養(yǎng)基中，重復(fù)多次，對(duì)菌種進(jìn)行純化后，分別進(jìn)行生理、生化實(shí)驗(yàn)，然后將純化后的菌株接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基斜面，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，保存于4 ℃的冰箱內(nèi)。

從石油污染土中共分離出9株菌株，對(duì)每株菌株的DNA進(jìn)行提取，利用細(xì)菌的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1 500 bp條帶后，通過(guò)Sanger法進(jìn)行測(cè)序(擎科興業(yè)生物有限公司完成)，將得到的序列利用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，從而確定菌株的類別。具體的鑒定結(jié)果為：菌1為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，菌2為假單胞菌屬(Pseudomonas)，菌3為蒼白桿菌屬(Phytophthora)，菌4為博得特氏菌屬(Bordetella)，菌5為戈登氏菌屬(Gordonia)，菌6為同溫層芽孢桿菌(Bacillus)，菌7為洛菲不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)，菌8為瓊氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjunii)，菌9為暹羅芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，以上提取的9種降解菌均為石油污染土中原有的細(xì)菌，均不是致病菌，對(duì)環(huán)境無(wú)危害。

根據(jù)單一降解菌在降油培養(yǎng)基內(nèi)降解汽油污染土6 d的試驗(yàn)結(jié)果，菌1、2、3、4和5的汽油降解率均超過(guò)69%。證明菌1、2、3、4和5降解汽油的能力較好，選取前5種降解菌配制試驗(yàn)所需混合菌懸液。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)土樣取自重慶大學(xué)B區(qū)操場(chǎng)地下車庫(kù)基坑，將取得的土樣去除碎石、樹枝、樹葉等雜質(zhì)，自然風(fēng)干、碾碎，依次通過(guò)30目標(biāo)準(zhǔn)篩，將處理后的土壤人工加入95#汽油，配制成5%的汽油污染土，在陰涼通風(fēng)處放置一周，期間定時(shí)、定量噴灑蒸餾水，以保證污染土20%的特定含水率，且每天定時(shí)翻土。將處理后的土壤放入烘干箱內(nèi)，105 ℃烘干3 d，待土壤溫度降到室溫，將土壤樣品封裝，放入干燥器保存待用。

試驗(yàn)采用10%混合菌懸液，采用濕重法配制，具體方法為：取出保存的純菌種復(fù)活于LB平板，挑取單菌落培養(yǎng)于LB液體培養(yǎng)基，在32 ℃、200 r/min的搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)24 h(菌5振蕩培養(yǎng)48 h)，4 000 r/min離心15 min，去上清液，稱菌體濕重，用質(zhì)量濃度為0.85%的無(wú)菌生理鹽水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的菌懸液。5種降解菌的菌懸液組成混合菌懸液，每種菌均占混合菌懸液體積的1/5。

1.3 試驗(yàn)方案

單因素試驗(yàn)：以自制5%的汽油污染土為對(duì)象，以pH值為7、溫度為32 ℃、含水率為20%、降解菌接種量為1 mL為基礎(chǔ)，分別改變pH值、溫度、土壤含水率及降解菌接種量4個(gè)因素，在恒濕恒溫培養(yǎng)箱中降解11 d后，進(jìn)行汽油污染土降解率的測(cè)定與分析，為排除汽油的揮發(fā)性對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，試驗(yàn)中設(shè)置空白對(duì)照組。

多因素正交試驗(yàn)：以自制5%的汽油污染土為對(duì)象，選擇pH值、溫度、土壤含水率及降解菌接種量4個(gè)因素，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果各取3個(gè)較優(yōu)水平，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，在恒濕恒溫培養(yǎng)箱中降解11 d后，進(jìn)行汽油污染土降解率的測(cè)定與分析，為排除汽油的揮發(fā)性對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，試驗(yàn)中設(shè)置空白對(duì)照組。

1.4 測(cè)試方法

定性試驗(yàn)測(cè)試方法：采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)進(jìn)行測(cè)試，GC-MS是由氣相色譜(GC)和質(zhì)譜檢測(cè)器(MS)兩部分結(jié)合起來(lái)所組成的。GC-MS主要用于分析極性小、易揮發(fā)、分子量較小(質(zhì)荷比1 000以內(nèi))的有機(jī)化合物。用于試驗(yàn)的污染土樣為汽油污染土，汽油的主要成分為C5～C12的脂肪烴和環(huán)烷烴類，以及一定量的芳香烴，均為小分子量的有機(jī)物，滿足氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的測(cè)試條件。

定量試驗(yàn)測(cè)試方法：采用紫外分光光度法測(cè)定汽油污染土降解率。土壤中汽油含量測(cè)定：取降解后污染土于離心管中，加入石油醚，進(jìn)行超聲萃取，100 W萃取30 min，萃取后進(jìn)行離心，4 000 r/min離心10 min，用1 mol/L鹽酸進(jìn)行酸化，提取上清液保存、待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性試驗(yàn)結(jié)果

峰面積比是指在色譜圖中，背景線以上部分的總面積，一般表示待測(cè)物的含量，面積越大，含量越高。選取單因素試驗(yàn)條件下相對(duì)分子質(zhì)量分別為56.1、57.1、71.7和191.1的4種化合物為分析對(duì)象，由GC-MS所得數(shù)據(jù)，提取相對(duì)分子質(zhì)量為56.1、57.1、71.7和191.1的4種化合物的峰積分面積比并計(jì)算其相對(duì)峰積分面積比。不同條件、同一時(shí)間下，4種化合物的相對(duì)峰積分面積比如圖1所示。圖中試驗(yàn)編號(hào)19為汽油污染土的空白樣(CK)，試驗(yàn)編號(hào)1～6為以pH值為唯一變量試驗(yàn)組的柱狀圖，試驗(yàn)編號(hào)7～11為以含水率為唯一變量試驗(yàn)組的柱狀圖，試驗(yàn)編號(hào)12～13為以溫度為唯一變量試驗(yàn)組的柱狀圖，試驗(yàn)編號(hào)14～18為以降解菌接種量為唯一變量試驗(yàn)組的柱狀圖。

圖1 不同條件同一時(shí)間下四種化合物的相對(duì)峰積分面積比Fig.1 Relative peak integral area ratio of four compounds at the same time under different conditions

由圖1可以發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組4種不同化合物的含量與空白組(CK)相對(duì)應(yīng)4種不同化合物的含量之間有顯著差異。編號(hào)13的試驗(yàn)組相對(duì)于編號(hào)19的空白組，4種不同化合物的含量均有大幅度增長(zhǎng)。不同化合物含量的顯著變化側(cè)面反映了降解菌在編號(hào)為13所對(duì)應(yīng)的降解條件下，可以通過(guò)降解汽油污染土中某種化合物合成這4種不同化合物。編號(hào)13、14、15、16和17的5個(gè)試驗(yàn)組的柱狀圖與空白組的柱狀圖相比，4種不同化合物含量變化比其他試驗(yàn)組更加顯著，說(shuō)明溫度與降解菌接種量相對(duì)于含水率和pH值這兩個(gè)因素對(duì)汽油污染土的降解效果影響更為顯著。

2.2 定量試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 單因素優(yōu)化試驗(yàn)

1)pH值 pH值大小對(duì)微生物代謝過(guò)程影響顯著。石油烴降解菌與大多數(shù)微生物一樣，一般情況下，適宜生長(zhǎng)的pH值范圍為6～8。極端pH值環(huán)境不利于微生物的生長(zhǎng)，易影響生物修復(fù)效果，pH值過(guò)低會(huì)影響N的轉(zhuǎn)化，略高于中性時(shí)，對(duì)硝化作用有利。pH值對(duì)汽油污染土降解效果的影響如圖2所示。

由圖2可知，混合菌懸液在pH值為7時(shí)，汽油污染土的降解率最高，為44.78%。當(dāng)pH值低于或高于7時(shí)，混合菌懸液對(duì)汽油污染土的降解率均呈下降趨勢(shì)，強(qiáng)酸情況下，降解率下降更為明顯。由此可見，此混合菌懸液更適合在中性或者弱堿性環(huán)境中生存，強(qiáng)堿和強(qiáng)酸均會(huì)影響其降解能力。這是由于pH值除了與微生物的生命活動(dòng)有關(guān)外，還能對(duì)環(huán)境中有機(jī)物(如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和有機(jī)污染物)的離子化程度產(chǎn)生影響，進(jìn)而間接影響微生物對(duì)汽油污染土的降解。酸性條件下，H+會(huì)影響微生物膜的結(jié)構(gòu)，pH值越低，微生物的膜結(jié)構(gòu)越不穩(wěn)定。堿性條件下，過(guò)多的OH-會(huì)引起細(xì)胞膜上的電荷變化，阻礙細(xì)胞膜對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸過(guò)程。此外，由于微生物對(duì)污染物的降解依賴于其產(chǎn)生的活性物質(zhì)(酶)，過(guò)多的H+和OH-均會(huì)對(duì)酶活性產(chǎn)生影響，阻礙其正常代謝。因此，所研究混合菌懸液的最適pH值范圍為7～8，適宜在中性以及弱堿的土壤環(huán)境中生長(zhǎng)。

圖2 pH值對(duì)汽油污染土降解效果的影響Fig.2 Effect of pH value on degradation of gasoline contaminated soil

2)溫度 溫度不僅影響石油烴的物理狀態(tài)，還對(duì)微生物的活性以及汽油污染土的揮發(fā)性有著直接的影響。適宜的溫度是混合菌懸液降解土壤汽油的重要條件。溫度主要通過(guò)影響汽油的物性和微生物自身活性來(lái)影響降解過(guò)程[23]。由單因素試驗(yàn)得知，溫度是影響所用混合降解菌降解效果的重要因素。溫度對(duì)汽油污染土降解率的影響如圖3所示。

圖3 溫度對(duì)汽油污染土降解率的影響Fig.3 Effect of temperature on degradation rate of gasoline contaminated soil

由圖3可以看出，溫度對(duì)汽油污染土降解率的影響較大。在所研究溫度范圍(20～40 ℃)內(nèi)，隨著溫度的不斷升高，混合菌懸液對(duì)汽油污染土的降解率整體呈先增大后減小的規(guī)律，但在溫度范圍為25～32 ℃內(nèi)，降解率增加速率較緩慢，原因可能是在降解溫度接近30 ℃時(shí)，雖然混合降解菌的降解速率很高，但由于在此溫度范圍內(nèi)汽油的揮發(fā)量也很大，因此，此溫度范圍內(nèi)，汽油的降解率增長(zhǎng)緩慢。在32 ℃左右，混合菌懸液對(duì)汽油污染土的降解率達(dá)到最大，為42.24%。當(dāng)溫度低于25 ℃時(shí)，混合菌懸液對(duì)汽油污染土的降解率普遍不高。這是因?yàn)檩^低溫度往往容易導(dǎo)致微生物酶活性的降低，進(jìn)而抑制了微生物的生長(zhǎng)。此外，低溫使汽油黏度增大，難以揮發(fā)和被微生物充分利用。當(dāng)溫度高于32 ℃時(shí)，混合菌懸液對(duì)汽油污染土的降解率快速降低。這是因?yàn)檩^高溫度條件下，由于汽油的大量揮發(fā)，使得污染土中容易被混合菌懸液降解的小分子烴類幾乎全部揮發(fā)。另外，細(xì)菌蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜及酶類因熱力作用發(fā)生變性或凝固，活性消失，代謝發(fā)生障礙，導(dǎo)致細(xì)菌死亡，且當(dāng)外界溫度明顯高于細(xì)菌的最適生長(zhǎng)溫度，細(xì)菌可能更易被殺死。因此，當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，混合降解菌降解的汽油量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于汽油揮發(fā)的量。由此可知，溫度過(guò)高或者過(guò)低均會(huì)導(dǎo)致混合菌懸液對(duì)汽油污染土的降解率下降。

3)含水率 土壤濕度是影響微生物降解石油烴的主要環(huán)境因素之一。微生物的新陳代謝均需要水分來(lái)維持，但濕度過(guò)高又會(huì)導(dǎo)致土壤空隙變小，通透性和氧氣供給不足。此外，土壤中的水分會(huì)在土壤顆粒表面形成水膜，降低污染物在土壤顆粒上的吸附，增加微生物與污染物的接觸幾率，提高降解效率。土壤含水率對(duì)汽油污染土降解率的影響如圖4所示。

圖4 土壤含水率對(duì)汽油污染土降解率的影響Fig.4 Effect of soil water content on degradation rate of gasoline contaminated soil

由圖4可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)土壤含水率由0升高到15%時(shí)，降解菌的降解率增長(zhǎng)速率較快，由此可知，水分是降解菌降解不可或缺的因素。隨著土壤含水率的不斷升高，降解率曲線增長(zhǎng)逐漸趨于平緩，當(dāng)含水率為25%時(shí)，降解率曲線出現(xiàn)一個(gè)快速下降的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，分析原因可能是土壤含水率超過(guò)土壤液限，含水率過(guò)高導(dǎo)致土壤空隙變小，通透性和氧氣供給不足。由圖中含水率為0%的試驗(yàn)組與后面含水率不為0試驗(yàn)組汽油污染土的降解率比較可知，含水率對(duì)降解效果影響較大。

4)降解菌接種量 當(dāng)初始接種少量的微生物時(shí)，初始的降解效果可能不太明顯，但隨著后期微生物的生長(zhǎng)繁殖，微生物的降解效果會(huì)逐漸明顯，由于試驗(yàn)設(shè)計(jì)的降解環(huán)境為一個(gè)總營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為定量的土壤環(huán)境，總的降解效果可能很理想。當(dāng)初始接種大量的微生物時(shí)，則初始降解效果會(huì)很明顯，但隨著后期菌體的過(guò)度繁殖，菌體對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的相互競(jìng)爭(zhēng)將導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)短缺，致使微生物的新陳代謝和生長(zhǎng)速率減緩，影響了混合菌懸液對(duì)石油烴的吸收降解，可能導(dǎo)致總的降解效果不是很理想。因此，對(duì)于降解菌總的降解效果還需對(duì)最佳降解菌接種量進(jìn)行測(cè)定。降解菌接種量對(duì)汽油污染土降解率的影響如圖5所示。

圖5 降解菌接種量對(duì)汽油污染土降解率的影響Fig.5 Effect of inoculation amount of degradingbacteria on degradation rate of gasoline contaminated soil

由圖5可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)混合降解菌接種量為0時(shí)，汽油污染土的降解率為0，這與已有的研究結(jié)果不符，原因可能是在對(duì)未受污染的土壤進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，將土壤放于溫度為105 ℃的烘干箱中烘干時(shí)，汽油污染土中的土著微生物均被高溫殺死。當(dāng)混合降解菌接種量為0.3 mL時(shí)，汽油污染土的降解率為29.2%，并且在混合降解菌接種量達(dá)到2 mL前，隨混合降解菌接種量的不斷增加，汽油污染土的降解曲線呈上升趨勢(shì)。因此，若想通過(guò)微生物修復(fù)方式取得相對(duì)明顯的降解效果則需要人為投放高效降解菌。當(dāng)降解菌接種量在0～1 mL范圍內(nèi)時(shí)，隨降解菌接種量逐漸增大，混合菌懸液對(duì)汽油污染土的降解率增長(zhǎng)速率較快。但在降解菌接種量大于2 mL后，隨降解菌接種量不斷增大，降解率開始逐漸減小。

2.2.2 多因素正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)pH值在6～8、降解溫度在30～35 ℃、含水率在15%～25%和降解菌接種量在1～2.5 mL范圍內(nèi)時(shí)，混合菌懸液的降解效果相對(duì)明顯。因此，選取6.5、7、8這3個(gè)pH值水平，30、32、35 ℃這3個(gè)培養(yǎng)溫度水平，1、2、2.5 mL這3個(gè)降解菌接種量水平和15%、20%、25%這3個(gè)含水率水平作為四因素三水平正交試驗(yàn)的試驗(yàn)條件，采用L9(34)正交表安排試驗(yàn)方案。表1為四因素三水平正交表及試驗(yàn)結(jié)果。

為了進(jìn)一步分析多因素正交試驗(yàn)中不同條件下混合降解菌對(duì)汽油污染土降解率的變化趨勢(shì)，圖6給出了多因素正交試驗(yàn)降解率的折線圖。

圖6 正交試驗(yàn)降解率分析Fig.6 Analysis of degradation rate by orthogonal test

由圖6可以發(fā)現(xiàn)，正交試驗(yàn)組編號(hào)為2和8兩組的降解率相對(duì)較高，均超過(guò)60%。正交試驗(yàn)組編號(hào)為2的降解條件為降解菌接種量為1 mL、pH值為7、降解溫度為32 ℃、土壤含水率為20%，混合菌懸液對(duì)汽油污染土的降解率為63.12%；正交試驗(yàn)組編號(hào)為8的降解條件為降解菌接種量為2.5 mL、pH值為7、降解溫度為30 ℃、土壤含水率為25%，降解率最高可達(dá)60.28%。由圖6可知，無(wú)論是溫度因素還是混合降解菌接種量因素均未表現(xiàn)出對(duì)汽油污染土的降解率有明顯的影響。因此，為了進(jìn)一步比較各因素水平對(duì)汽油污染土降解率的影響水平，圖7給出了混合菌懸液對(duì)汽油污染土的降解率的極差分析圖(縱坐標(biāo)為降解率極差的平均值，橫坐標(biāo)為各個(gè)因素水平)。

圖7 基于降解率的極差分析Fig.7 Range analysis based on degradation rate

從圖7可知，降解菌接種量為A1、pH值為B2、溫度為C2、含水率為D3分別為各因素的最優(yōu)降解水平。綜上所述，混合菌懸液對(duì)汽油污染土降解的最優(yōu)條件是A1B2C2D3，即當(dāng)降解菌接種量為1 mL、pH值為7、降解溫度為32 ℃和含水率為25%時(shí)，混合菌懸液對(duì)汽油污染土的降解效果達(dá)到最佳狀態(tài)。

3 結(jié)論

1)利用實(shí)驗(yàn)室提取的5種降解菌對(duì)汽油污染土進(jìn)行降解試驗(yàn)，通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)前后有機(jī)物組分發(fā)現(xiàn)，5種降解菌的混合菌懸液對(duì)汽油污染土有良好的降解能力。

2)單因素試驗(yàn)條件下，當(dāng)pH值在6～8、降解溫度在30～35 ℃、含水率在15%～25%和降解菌接種量在1～2.5 mL范圍內(nèi)時(shí)，混合菌懸液對(duì)汽油污染土的降解效果相對(duì)明顯。

3)多因素正交試驗(yàn)條件下，當(dāng)溫度為32 ℃、pH值為7、降解菌接種量為1 mL和含水率為25%時(shí)，混合菌懸液對(duì)汽油污染土的降解效果最佳。

由于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下篩選馴化的高效優(yōu)勢(shì)微生物菌株在實(shí)際污染的土壤環(huán)境中可能不能完全發(fā)揮其有效活性。因此，為了得到本文石油烴混合降解菌對(duì)于實(shí)際汽油污染土壤的降解效果，需要進(jìn)行田間的修復(fù)試驗(yàn)并優(yōu)化，以用于實(shí)際工程。