杜亞麗, 徐 凱, 趙慧婷, 劉玉玲, 牛慶生,*, 姜玉鎖,*

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 山西太谷 030801; 2. 吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所, 吉林吉林 132108;3. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山西太谷 030801)

眾所周知，昆蟲通過嗅覺來感知外界環(huán)境中各種氣味物質(zhì)，如信息素、花香物質(zhì)和動(dòng)物體表揮發(fā)物，從而來確定食物來源、選擇產(chǎn)卵場(chǎng)地、尋找同伴、配偶和合適的寄主、躲避捕食者等(Breer, 2003; Fanetal., 2011; Huaetal., 2012)。識(shí)別并解析外界環(huán)境中的化學(xué)信號(hào)是維持昆蟲生命的重要機(jī)制。在嗅覺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)啟動(dòng)之前，外界的疏水性分子必須滲入嗅覺感器(位于觸角上的微小的毛狀多孔表皮結(jié)構(gòu))內(nèi)，穿過親水性的感器淋巴液到達(dá)感覺神經(jīng)元后刺激樹突膜表面特定的嗅覺受體(olfactory receptors, ORs)(Britoetal., 2016)。在這個(gè)過程中，由專門的輔助細(xì)胞合成并被分泌到感器淋巴器中高濃度分布的氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)發(fā)揮著關(guān)鍵作用(Leal, 2013; 張玉等, 2019)。盡管在分子水平上對(duì)嗅覺機(jī)制尚未完全了解，但許多研究表明該類蛋白參與化學(xué)通訊過程，是最先參與嗅覺識(shí)別的嗅覺相關(guān)蛋白。OBPs具有多種生物學(xué)功能，其中研究得最多的是保護(hù)氣味分子免受氣味降解酶(odorant-degrading enzymes, ODEs)降解以及轉(zhuǎn)運(yùn)疏水性化學(xué)物質(zhì)通過感器淋巴液到達(dá)嗅覺受體的作用(Pelosietal., 2018a)。

1 昆蟲的外周嗅覺系統(tǒng)

昆蟲對(duì)氣味分子的識(shí)別過程非常復(fù)雜，可以分為兩個(gè)系統(tǒng)：(1)外周嗅覺系統(tǒng)：對(duì)氣味分子進(jìn)行結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)，將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娚硇盘?hào)并進(jìn)行傳導(dǎo)；(2)中樞神經(jīng)系統(tǒng)：通過軸突傳導(dǎo)至昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)而引發(fā)昆蟲對(duì)氣味分子作出識(shí)別反應(yīng)(杜立嘯等, 2016)。其中，昆蟲外周嗅覺系統(tǒng)涉及多種蛋白，主要包括氣味結(jié)合蛋白(OBPs)、嗅覺受體(ORs)、離子型受體(ionotropic receptors, IRs)、感覺神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins, SNMPs)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)和氣味降解酶(ODEs)等(莫建初等, 2019)。

OBPs是一類可溶性蛋白，主要負(fù)責(zé)外部環(huán)境與ORs之間的連接(Liu Wetal., 2018)。外界環(huán)境中的氣味分子一旦滲入觸角表面的感器微孔，就會(huì)被OBPs結(jié)合從而增加其在感器淋巴液中的可溶性；氣味分子-OBP復(fù)合物穿過感器淋巴液到達(dá)感器樹突，激活樹突膜上表達(dá)的ORs，引起嗅覺神經(jīng)元的興奮(Britoetal., 2016)(圖1)。編碼OBPs的基因數(shù)目因昆蟲種類不同差異很大，有的物種含有幾個(gè)，有的甚至高達(dá)上百個(gè)(Gongetal., 2014; Guetal., 2015; Zhouetal., 2015; Paulaetal., 2016; Heetal., 2017; Kimetal., 2017; Qiuetal., 2018; Quetal., 2019)。昆蟲OBP家族還包括特異結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)信息素到信息素受體(pheromone receptors, PRs)的信息素結(jié)合蛋白(pheromone binding proteins, PBPs)(Dongetal., 2017; Yuetal., 2018)。關(guān)于OBPs的作用模式，目前有兩種假設(shè)：(1)對(duì)蛾類和蚊類的研究表明，OBPs起被動(dòng)載體的作用，且配體可以單獨(dú)激活相應(yīng)的ORs(Dambergeretal., 2007)；(2)在某些情況下，OBPs似乎發(fā)揮更直接的作用，只有形成特定的OBP-配體復(fù)合物才能激活受體(Ronderos and Smith, 2010)。

圖1 昆蟲嗅覺過程的示意圖(改自Brito et al., 2016)Fig. 1 Schematic view of the odorant perception process in insects (adapted from Brito et al., 2016)

CSPs是從多個(gè)目的昆蟲中鑒定發(fā)現(xiàn)的另一類可溶性小蛋白。與OBPs相比，CSPs的分子量更小，組織分布更廣泛，可以結(jié)合多種化學(xué)物質(zhì)(Zhouetal., 2013)。免疫細(xì)胞化學(xué)定位研究表明，在嗅覺感受器淋巴液中的CSPs主要參與昆蟲的化學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)，如紅火蟻SolenopsisinvictaSinvCSP1在觸角中高表達(dá)，在巢內(nèi)同伴信號(hào)的識(shí)別過程中發(fā)揮重要作用(Gonzálezetal., 2009)。然而，一些在非嗅覺器官中表達(dá)的CSPs可能行使其他不同的生理功能(Ozakietal., 2008)。RNAi介導(dǎo)西方蜜蜂ApismelliferaAmelCSP5沉默后，胚胎形態(tài)異常，表明該基因參與蜜蜂胚胎表皮的形成(Maleszkaetal., 2007)；斜紋夜蛾SpodopteralituraSlitCSP3,SlitCSP8和SlitCSP11在中腸中高表達(dá)，與寄主植物的選擇有關(guān)(Yietal., 2017)；東亞飛蝗LocustamigratoriaLmigCSP-II在成蟲翅膀上的毛形感器中表達(dá)，可能參與接觸性化學(xué)感受過程(Zhou SHetal., 2008)；紅火蟻4齡幼蟲中高表達(dá)的SinvCSP9調(diào)控蛻皮過程(Chengetal., 2015)。

與可溶性的OBPs和CSPs相比，SNMPs基因編碼的是一類跨膜蛋白，屬于CD36蛋白家族的一個(gè)亞家族，在昆蟲性信息素的化學(xué)通信中發(fā)揮作用(Pregitzeretal., 2014)。研究表明，黑腹果蠅DrosophilamelanogasterDmelSNMP1是T1感器檢測(cè)性信息素Z11-18OAc(簡(jiǎn)稱cVA)的必需蛋白(Bentonetal., 2007; Jinetal., 2008)，而二化螟ChilosuppressalisCsupSNMP1也與觸角中檢測(cè)性信息素的神經(jīng)元緊密相關(guān)(Liuetal., 2013)。

嗅覺受體(ORs)蛋白含有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，與脊椎動(dòng)物GPCRs受體不同源(Benton, 2015)。昆蟲ORs的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)的GPCR相反，其N末端區(qū)位于細(xì)胞內(nèi)(Bentonetal., 2006)。配體特異性O(shè)Rs通常與高度保守的嗅覺受體共受體(odorant receptor co-receptor, Orco)以異源二聚體的形式組成一個(gè)配體門控離子通道，此結(jié)構(gòu)可能與昆蟲對(duì)外界氣味物質(zhì)及性信息素的識(shí)別和區(qū)分有關(guān)(Vosshall and Hansson, 2011)。氣味分子可以特異性地結(jié)合ORs，因此Orco不直接參與氣味識(shí)別(Guidobaldietal., 2014)。

離子受體(IRs)雖與離子型谷氨酸受體有關(guān)，但這兩個(gè)家族在結(jié)構(gòu)上差異較大，因?yàn)槔ハxIRs沒有谷氨酸結(jié)合位點(diǎn)(Knechtetal., 2016; Yuvarajetal., 2018)。IRs僅在不表達(dá)ORs或Orco的感覺神經(jīng)元中表達(dá)，且與共受體共表達(dá)。目前尚未在異源表達(dá)系統(tǒng)中研究IRs的功能特性，但對(duì)其定位和結(jié)構(gòu)特征分析表明IRs在配體誘導(dǎo)的離子通道過程中發(fā)揮主要作用(Bentonetal., 2009)。

對(duì)于以氣味為導(dǎo)向的昆蟲來說，嗅覺系統(tǒng)動(dòng)力學(xué)要求在毫秒級(jí)的時(shí)間內(nèi)迅速滅活雜散的氣味分子(Szyszkaetal., 2014)。關(guān)于信號(hào)終止目前有兩種假設(shè)：第1種假說為氣味降解酶(ODEs)參與的配體降解，其速度非常快，可快速終止信號(hào)(Ishida and Leal, 2005)；第2種假說認(rèn)為存在一種尚不清楚的負(fù)責(zé)信號(hào)終止的“清道夫”(Kaissling, 2009)。

2 昆蟲OBPs的一般特性及分類

昆蟲OBPs是一類水溶性的小分子蛋白(13～17 kD)，一般由130～150個(gè)氨基酸組成，呈酸性(Ahmedetal., 2017)。但有研究表明，雙翅目的埃及伊蚊Aedesaegypti和半翅目的長(zhǎng)紅獵蝽Rhodniusprolixus基因組中發(fā)現(xiàn)的候選OBPs具有更廣范圍的等電點(diǎn)(pI)(Zhou JJetal., 2008; Mesquitaetal., 2015)。根據(jù)一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的數(shù)量，OBPs可分為長(zhǎng)鏈OBPs(約160個(gè)氨基酸)、中鏈OBPs(約120個(gè)氨基酸)和短鏈OBPs(約100個(gè)氨基酸)。OBPs的氨基酸序列差異很大，同一物種OBPs間的氨基酸同源性可能低于10%，但通常含有6個(gè)位置相對(duì)保守的半胱氨酸(Cys)(張治科等, 2017)。實(shí)驗(yàn)證明，6個(gè)Cys形成了3個(gè)連鎖的二硫鍵，其排列方式有助于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，是昆蟲OBPs的一個(gè)保守特征。這種Cys模式已經(jīng)成為昆蟲OBPs的“典型特征”(Pelosietal., 2014)。雖然脊椎動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了OBPs的存在，但這些蛋白屬于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族，Cys在蛋白穩(wěn)定性方面并未起到關(guān)鍵作用(Bianchietal., 2019)。

根據(jù)功能和氨基酸序列的同源性，鱗翅目OBPs最初被細(xì)分為5類：信息素結(jié)合蛋白PBPs，I型普通氣味結(jié)合蛋白(type 1 general odorant binding proteins, GOBP1s)，II型普通氣味結(jié)合蛋白(type 2 general odorant binding proteins, GOBP2s)，I型觸角結(jié)合蛋白(type 1 antennal binding proteins, ABP1s)和II型觸角結(jié)合蛋白(type 2 antennal binding proteins, ABP2s)(Gong DPetal., 2009)。然而，這種分類并不適用于其他昆蟲。根據(jù)保守Cys的模式，OBPs分為Classical OBPs, Minus-C OBPs, Plus-C OBPs, Dimer OBPs和Atypical OBPs。所謂的Classical OBPs氨基酸序列中含有6個(gè)保守Cys位點(diǎn)，而Minus-C OBPs只有4個(gè)或5個(gè)(Britoetal., 2016)。西方蜜蜂AmelOBP14是第一個(gè)確定晶體結(jié)構(gòu)的Minus-C OBPs，僅含有2個(gè)二硫鍵(Spinellietal., 2012)。Plus-C OBPs至少含有2～3個(gè)額外的Cys，且在第6個(gè)Cys之后有1個(gè)保守的脯氨酸位點(diǎn)(Liu NYetal., 2018)，如煙粉虱BemisiatabaciBtabOBP2就含有9個(gè)保守的Cys(謝紅艷等, 2017)。Dimer OBPs是由2個(gè)典型的Cys基序聚合在一起形成的(Campanini and de Brito, 2016; Zengetal., 2019)。Atypical OBPs的N端區(qū)域比較典型，C端區(qū)域較長(zhǎng)且特征不明顯(Manoharanetal., 2013)。從岡比亞按蚊Anophelesgambiae中鑒定的Atypical OBPs實(shí)際上含有2個(gè)與Classical OBPs相同的結(jié)構(gòu)域，因此又稱為“two-domain OBPs”，但本質(zhì)上還是屬于dimer OBPs亞家族(Vieira and Rozas, 2011)。

3 昆蟲OBPs在嗅覺感受系統(tǒng)中的作用

Vogt和Riddiford(1981)利用同位素標(biāo)記法，在對(duì)鱗翅目多音天蠶蛾Antheraeapolyphemus雄蟲的觸角研究中發(fā)現(xiàn)并鑒定了首個(gè)PBPs，其能夠結(jié)合雌蟲分泌的性信息素。隨后，Breer等(1990)在雌性柞蠶Antheraeapernyi觸角中發(fā)現(xiàn)了一類可以結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)普通氣味分子的GOBPs。生物化學(xué)結(jié)合動(dòng)力學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)，OBPs具有運(yùn)載和滅活氣味物質(zhì)的雙重作用(Vogtetal., 1991; Ziegelberger, 1995)。一項(xiàng)對(duì)黑腹果蠅突變體的研究表明OBPs參與氣味分子向ORs的轉(zhuǎn)運(yùn)過程(Kimetal., 1998)。之后，對(duì)豌豆蚜AcyrthosiphonpisumApisOBP3(Qiaoetal., 2009)、梨小食心蟲GrapholitamolestaGmolGOBP2(Lietal., 2016)、淡足側(cè)溝繭蜂MicroplitispallidipesMpalOBP8(楊安, 2018)等的研究證明，OBPs能夠特異性地識(shí)別和篩選特定的化學(xué)信號(hào)，而不只是被動(dòng)運(yùn)輸。對(duì)果蠅突變體(Swarupetal., 2011)和蚜蟲(Sun YFetal., 2012)的采集和交配行為分析也表明OBPs確實(shí)參與了化學(xué)物質(zhì)的選擇過程。此外，OBPs還可以提高嗅覺系統(tǒng)的敏感性(Vidicetal., 2008; Forstneretal., 2009)。家蠶BmorOR1(蠶蛾性誘醇bombykol受體)和BmorPBP1在黑腹果蠅的神經(jīng)元細(xì)胞中共表達(dá)時(shí)，細(xì)胞對(duì)bombykol的敏感性顯著高于單獨(dú)表達(dá)BmorOR1時(shí)的敏感性(Syedetal., 2010)。類似地，二化螟C.supressalisPBPs與PRs共存時(shí)，PRs對(duì)信息素的敏感性可提高4個(gè)數(shù)量級(jí)(Changetal., 2015)。近幾年的基因敲除、RNA干擾和電生理學(xué)等研究更是直接證明了OBPs是嗅覺系統(tǒng)正常運(yùn)作必不可少的蛋白(Jiaetal., 2015; Pechlaner and Oostenbrink, 2015; Chenetal., 2018; Huetal., 2019)。

大量研究表明，OBPs在昆蟲嗅覺系統(tǒng)中發(fā)揮著多種重要功能，主要包括：(1)特異性地識(shí)別并結(jié)合外界環(huán)境中不同結(jié)構(gòu)的氣味分子，過濾掉那些不需要的或有毒有害物質(zhì)；(2)運(yùn)輸疏水性的氣味分子穿過水溶性的感器淋巴液到達(dá)嗅覺神經(jīng)元樹突膜上的受體蛋白，調(diào)節(jié)其對(duì)氣味物質(zhì)的反應(yīng)強(qiáng)度；(3)保護(hù)氣味分子免受氣味降解酶的降解；(4)在氣味分子刺激受體后迅速地使其失活，避免持續(xù)刺激導(dǎo)致嗅覺神經(jīng)元過度興奮；(5)清除感器淋巴液中不需要的或有毒的物質(zhì)(Fanetal., 2011; 張玉等, 2019)。

4 昆蟲OBPs在非嗅覺組織中的生理功能

研究表明，行使嗅覺功能的大部分昆蟲OBPs基因均在觸角中特異性高表達(dá)，如嘴壺夜蛾OraesiaemarginataOemaPBP1(Fengetal., 2017)、紅棕象甲R(shí)hynchophorusferrugineusRferOBP1768(Antonyetal., 2018)和玉米象SitophituszeamaisSzeaOBP35-36(Tangetal., 2019)。但隨著OBPs基因家族成員的增加，人們發(fā)現(xiàn)并非所有OBPs只表達(dá)和分布于觸角中，在口器、足、中腸、腺體等非嗅覺器官中同樣有廣泛的表達(dá)，暗示它們可能還參與除嗅覺感知以外的其他不同的生理功能。黑花蠅Phormiaregina口器中高表達(dá)的PregOBP56a對(duì)膳食脂肪酸具有增溶作用(Ishidaetal., 2013)；埃及伊蚊卵巢中高表達(dá)的AaegOBP45可能參與卵膜的形成(Costa-da-Silvaetal., 2013)；中華蜜蜂Apisceranacerana足中特異性高表達(dá)的AcerOBP15在采集花蜜和花粉時(shí)參與味覺識(shí)別過程(Duetal., 2019)；黑須庫(kù)蚊Culexnigripalpus(Smartt and Erickson, 2009)和長(zhǎng)紅錐蝽Rhodniusprolixus(Ribeiroetal., 2014)的腸道中發(fā)現(xiàn)的OBPs可能與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或參與腸道功能的其他小分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)；棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraHarmOBP10(Sun YLetal., 2012)和西方蜜蜂AmelOBP21(Lietal., 2013)在合成信息素的腺體中表達(dá)，參與化學(xué)信息素的合成、儲(chǔ)存與釋放過程；PxylOBP13有助于增強(qiáng)小菜蛾P(guān)lutellaxylostella對(duì)菊酯類殺蟲劑的抗性(Bautistaetal., 2015)。此外，吸血昆蟲的OBPs還具有一定的抗炎作用，可作為生物學(xué)標(biāo)記來檢測(cè)蚊和白蛉等引起的流行病(Pelosietal., 2018a)。

昆蟲基因組預(yù)測(cè)獲得的OBPs不一定都是嗅覺相關(guān)蛋白。例如，黑腹果蠅基因組中共有51個(gè)OBPs，但只有7個(gè)在成蟲的嗅覺器官中特異性表達(dá)(Galindo and Smith, 2001)。家蠶基因組包含44個(gè)編碼OBPs的基因，但目前只鑒定出1個(gè)PBP和多個(gè)GOBPs(Danietal., 2011)。岡比亞按蚊基因組中鑒定獲得66個(gè)OBPs，大多數(shù)OBPs除嗅覺器官之外也能在非嗅覺器官中表達(dá)(Amenyaetal., 2010)。OBPs家族中的嗅覺蛋白和非嗅覺蛋白具有相同的結(jié)構(gòu)特性，富含螺旋結(jié)構(gòu)。這些蛋白能將疏水性氣味物質(zhì)和其他配體包裹在形成的空腔內(nèi)，從而具有轉(zhuǎn)運(yùn)揮發(fā)性物質(zhì)穿過水溶性環(huán)境的能力。因此，這種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)可表達(dá)于各種需要在水相中轉(zhuǎn)運(yùn)疏水分子的組織中，保護(hù)化學(xué)物質(zhì)免于降解，確?；瘜W(xué)物質(zhì)緩慢向環(huán)境中釋放(Britoetal., 2016)。鑒于此，有學(xué)者認(rèn)為應(yīng)該將這些蛋白命名為“膠囊”，以暗示其具有結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)配體的一般作用(Leal, 2006)。

5 昆蟲OBPs的三維結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)理

研究蛋白功能最基礎(chǔ)的就是要搞清楚蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，從而在分子水平上進(jìn)行功能研究來闡明其本質(zhì)。目前蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的測(cè)定主要有三大技術(shù)：X-射線晶體學(xué)、核磁共振(NMR)和冷凍電鏡三維重構(gòu)技術(shù)，而昆蟲OBPs的三維結(jié)構(gòu)大多是利用前兩種方法進(jìn)行解析的。自Sander等(2000)首次采用X-射線晶體學(xué)獲得BmorPBP1-bombykol的晶體結(jié)構(gòu)(pH 8.2)以來，已對(duì)鱗翅目、雙翅目、膜翅目、直翅目、半翅目、脈翅目、蜚蠊目等多種昆蟲OBPs的單體或復(fù)合結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析(表1)。昆蟲OBPs通常由6個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)域組成，由3個(gè)二硫鍵兩兩連接，折疊形成非常緊密和穩(wěn)定的疏水性結(jié)合腔，在一定程度上增加了OBPs結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性(胡穎穎等, 2013)。這與脊椎動(dòng)物折疊方式完全不同，其典型結(jié)構(gòu)為8個(gè)反平行的β-折疊和1個(gè)短的α-螺旋(緊靠C端)(Floweretal., 2000; Ramonietal., 2007)。

昆蟲OBPs的構(gòu)象變化具有pH依賴性(Leeetal., 2002; Xuetal., 2010; Tianetal., 2016)。BmorPBP1的6個(gè)α-螺旋由3個(gè)二硫鍵連接，以錐形排列方式形成一個(gè)緊密結(jié)構(gòu)(Sandleretal., 2000)。BmorPBP1的C端區(qū)域主要由非極性氨基酸組成，但位于螺旋表面的Asp132, Glu137和Glu141為酸性氨基酸。在酸性pH下，Asp132(或臍橙螟AtraPBP1的Glu132)和Glu141與質(zhì)子化的組氨酸殘基His形成鹽橋，促進(jìn)C端第7個(gè)α-螺旋形成并占據(jù)結(jié)合腔引起配體釋放，該機(jī)制又被稱為組氨酸質(zhì)子化作用開關(guān)，是OBPs向ORs傳遞信息素的活性機(jī)制(Xu and Leal, 2008; Xuetal., 2010)。中性pH時(shí)，去質(zhì)子化的His使鹽橋破裂，導(dǎo)致第7個(gè)螺旋從結(jié)合腔向外排出，使蛋白核心中的疏水性殘基暴露，與信息素相互作用并結(jié)合(Xu and Leal, 2008)。這種現(xiàn)象并非所有鱗翅目PBPs所共有。多音天蠶蛾ApolPBP1的α3中間存在一個(gè)扭結(jié)，使Asn53的側(cè)鏈成為信息素結(jié)合腔的一部分，中性pH時(shí)一般不結(jié)合配體。酸性pH下組氨酸發(fā)生質(zhì)子化，Asn53遠(yuǎn)離蛋白核心，引起α1, α3和α4重新定向，結(jié)合腔打開釋放出配體(Zubkovetal., 2005; Gongetal., 2010)。此外，對(duì)舞毒蛾LymantriadisparLdisPBPs的配體反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，LdisPBP2首先與配體通過擴(kuò)散控制碰撞形成中間復(fù)合物，然后配體從外部結(jié)合位點(diǎn)重新定位到不同的內(nèi)部結(jié)合位點(diǎn)，從而產(chǎn)生更穩(wěn)定的配體-OBP復(fù)合物，為鱗翅目OBPs配體結(jié)合的另一機(jī)制的存在提供了依據(jù)(Gong Yetal., 2009)。

表1 已解析三維結(jié)構(gòu)的氣味結(jié)合蛋白Table 1 Odorant binding proteins with three-dimensional structures resolved

續(xù)表1 Table 1 continued

QMP: 蜂王上顎腺信息素Queen’s mandibular gland pheromone. 括號(hào)中文字表示X射線衍射的光波長(zhǎng)。The text in brackets indicates the optical wavelength of X-ray diffraction.

與鱗翅目不同，大多數(shù)雙翅目OBPs的C端區(qū)域較短，如同結(jié)合腔上的“蓋子”，不能形成占據(jù)配體結(jié)合腔的新螺旋。比如，岡比亞按蚊AgamOBP1、埃及伊蚊AaegOBP1和致倦庫(kù)蚊CquiOBP1的pH依賴性構(gòu)象變化與結(jié)合親和力的喪失相關(guān)(Wogulisetal., 2006; Leiteetal., 2009; Maoetal., 2010)。這個(gè)“蓋子”是由3個(gè)對(duì)pH變化極其敏感的保守氫鍵在適當(dāng)?shù)奈恢眯纬傻摹４送?，這些OBPs的C末端只有最后1個(gè)氨基酸存在差異，如AgamOBP1和CquiOBP1的Val125、AaegOBP1的Ile125，其羧酸氧基分別與Tyr54的羥基、His23的δ-氮基和Arg23形成氫鍵。當(dāng)OBP-氣味分子復(fù)合物到達(dá)樹突膜附近的時(shí)候，局部pH降低，羧酸鹽質(zhì)子化使氫鍵被破壞，導(dǎo)致C末端遠(yuǎn)離結(jié)合腔，從而“打開蓋子”并促進(jìn)配體釋放(Leiteetal., 2009; Maoetal., 2010)。

西方蜜蜂AmelASP1的配體親和力雖呈pH依賴性，但作用方式與鱗翅目和雙翅目OBPs正好相反。pH 4.0時(shí)，AmelASP1與蜂王信息素的主要成分9-ODA具有很高的結(jié)合親和力，而pH 7.0時(shí)，ASP1疏松的C末端可以與另一個(gè)ASP1分子的N末端聚合形成結(jié)構(gòu)域二聚體，其配體親和力比酸性pH時(shí)低10倍。(Pesentietal., 2008)。該二聚化反應(yīng)可能與Asp35密切相關(guān)，因此突變體Asp35Asn和Aps35Ala在不同pH條件下的單體結(jié)構(gòu)完全相同(Pesentietal., 2009)。

雖然在NCBI GenBank中注冊(cè)的半翅目昆蟲OBPs已達(dá)到300多個(gè)，但直到最近才解析了蚜蟲OBPs的晶體結(jié)構(gòu)(Northeyetal., 2016)。巢菜修尾蚜Megouraviciae和萵苣蚜NasonoviaribisnigriOBP3的結(jié)構(gòu)與Classical OBPs相似：6個(gè)保守的Cys形成3個(gè)二硫鍵，6個(gè)螺旋由延伸的環(huán)狀結(jié)構(gòu)連接。但這2個(gè)蛋白表面都有一個(gè)結(jié)合凹槽，主要由N端區(qū)域和部分螺旋α1和α2形成，沒有明顯的內(nèi)部結(jié)合腔(Northeyetal., 2016)。分子動(dòng)力學(xué)表明，兩蛋白的Tyr30與配體間的互作及其結(jié)合前后的取向在配體結(jié)合過程中起關(guān)鍵作用，但這兩個(gè)蛋白的特殊結(jié)構(gòu)特征還需進(jìn)一步評(píng)估，以充分闡明其在報(bào)警信息素感知過程中的作用。

6 昆蟲OBPs的配體結(jié)合特性和激活ORs的作用模式

6.1 昆蟲OBPs結(jié)合特性的研究方法

在早期的PBPs結(jié)合特性研究中，經(jīng)氚及放射性標(biāo)記的信息素常被用于定性結(jié)合分析(Plettneretal., 2000)。隨著重組蛋白的可用性，Leal等(2005a)制定了一種不需放射性配體的“冷凍結(jié)合分析法”，能夠在單一實(shí)驗(yàn)中從有機(jī)混合物中鑒定出OBPs的最佳配體。目前，熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)是研究OBPs與候選配體結(jié)合特性最常用的方法，可通過比較OBPs與生理相關(guān)化合物的結(jié)合親和力，評(píng)估它們優(yōu)先轉(zhuǎn)運(yùn)某些配體的能力(Zhuangetal., 2013)。但該方法有一定的局限性，需要一種與目標(biāo)蛋白質(zhì)具有一定親和力的熒光探針，比如1-氨基蒽(AMA)(Campanaccietal., 2001)、1-苯胺-8-萘磺酸(ANS)(Wojtasek and Leal, 1999; Lartigueetal., 2003)和N-苯基-1-萘胺(1-NPN)(Pelosietal., 2018c)。在找不到合適熒光探針的情況下，通過測(cè)定色氨酸的固有熒光以監(jiān)控配體結(jié)合特性也是可行的(Lealetal., 2005a)。例如，對(duì)ApolPBP1與其信息素混合物組分(E6,Z11)-六癸二醛、(E6,Z11)-六癸二烯基-1-乙酸鹽和(E4,Z9)-四癸二烯基-1-乙酸鹽之間的固有熒光變化進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)ApolPBP1存在3種不同類型的配體結(jié)合模式(Betteetal., 2002)。

OBPs與不同配體之間的結(jié)合勢(shì)也可以通過分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)等電腦模擬進(jìn)行估算(Venthuretal., 2014)。對(duì)金龜子甲蟲HylamorphaelegansOBPs和矮假山毛櫸Nothofagusobliqua揮發(fā)物的模擬分析表明，HeleOBPs與倍半萜烯類化合物有較高的互作能值，且疏水氨基酸主要參與這些互作(González-Gonzálezetal., 2016)。Song等(2018)也使用此方法評(píng)估了AcerOBP11與小分子物質(zhì)之間的親和力，發(fā)現(xiàn)Ile97, Ile140和Phe101是該蛋白的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)。

6.2 昆蟲OBPs的配體結(jié)合特性

OBPs是昆蟲體內(nèi)多種疏水性物質(zhì)的有效載體，與小分子有機(jī)化合物的結(jié)合力是OBPs生理功能研究的必要依據(jù)。PBPs(至少對(duì)鱗翅目昆蟲來說)對(duì)信息素具有很強(qiáng)的結(jié)合特異性，比如BmorPBP1只能特異性識(shí)別bombykol(Sandleretal., 2000)。但也有證據(jù)表明，除了性信息素組分及其類似物外，PBPs還可以與普通氣味物質(zhì)結(jié)合(Jinetal., 2014; Jiaetal., 2015; Songetal., 2018)。相對(duì)于PBPs來說，GOBPs具有相當(dāng)廣泛的配體親和特性，能夠結(jié)合多種不同種類的氣味物質(zhì)，除結(jié)合宿主植物揮發(fā)物以外，部分還偏好性地結(jié)合特定的性信息素組分(Heetal., 2010; 陳東凱等, 2018; Jingetal., 2019)。例如，梨小食心蟲GmolGOBP1對(duì)寄主植物揮發(fā)物和性信息素成分存在雙重識(shí)別功能，而GmolGOBP2主要參與對(duì)十二烷醇(一種次要性信息素)的感知(Lietal., 2016)；LstiGOBP2對(duì)植物揮發(fā)物(E)-2-己烯醛、(Z)-3-exen-1-ol和信息素組分(E)-11-十四烯-1-基乙酸鹽均有很高的親和力(Yinetal., 2012)；中紅側(cè)溝繭蜂MicroplitismediatorMmedOBP18除與16種植物揮發(fā)物結(jié)合，還與性信息素組分(Z)-9-十四碳烯醛和(Z)-11-十六碳醛有較強(qiáng)的結(jié)合(宋玄等, 2019)。此外，OBPs還可以與非揮發(fā)性代謝物相結(jié)合。果蠅DmelOBP49a能夠直接與苦味物質(zhì)結(jié)合，并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到味覺受體上(Jeongetal., 2013)；苜蓿盲蝽Adelphocorislineolatus和三點(diǎn)盲蝽Adelphocorisfasciaticollis口器中高度表達(dá)的OBP11可以優(yōu)先結(jié)合寄主植物的非揮發(fā)性次生代謝物，在味覺感受系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用(Sunetal., 2016; Li ZBetal., 2019)；黑花蠅唾液中的脂肪酶可將體內(nèi)的甘油三酯水解為游離脂肪酸，這時(shí)對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪酸有高親和力的PregOBP56a就會(huì)結(jié)合并將其轉(zhuǎn)運(yùn)至腸道(Ishidaetal., 2013)

6.3 OBPs激活ORs的作用模式

迄今為止，ORs的激活機(jī)制提出兩個(gè)作用模型：第1個(gè)模型表明氣味物質(zhì)本身單獨(dú)激活了受體，而第2個(gè)模型支持ORs被特定的OBP-氣味復(fù)合物激活的觀點(diǎn)。上述關(guān)于蛾類和蚊類的研究支持第一種假設(shè)，即氣味分子被包裹在OBPs的結(jié)合腔中，協(xié)助其通過感器淋巴液，從而避免被ODEs降解；當(dāng)復(fù)合物到達(dá)神經(jīng)元樹突區(qū)域時(shí)，OBPs-配體復(fù)合物在較低的pH下快速分離，配體以獨(dú)立的方式激活ORs(Horstetal., 2001)。有研究表明，在OBPs缺失的情況下，ORs可以被其特定配體激活，與該模型完全一致(Nakagawaetal., 2005)。

然而，黑腹果蠅的氣味結(jié)合蛋白LUSH的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式與第一種假設(shè)完全相反(Xuetal., 2005)。Lush缺陷突變體的研究表明，LUSH蛋白對(duì)于典型的cVA-誘導(dǎo)行為和T1神經(jīng)元的正常敏感性是必要的(Stowers and Logan, 2008)。結(jié)構(gòu)研究指出，LUSH不是cVA的被動(dòng)載體，其構(gòu)象變化主要通過OR67d和SNMP介導(dǎo)激活T1神經(jīng)元，而LUSH從靜息狀態(tài)的非活性形式轉(zhuǎn)化為能夠觸發(fā)T1神經(jīng)元激活的活性構(gòu)象正是由cVA刺激引起的(Jinetal., 2008; Laughlinetal., 2008)。這些結(jié)果與OBP-氣味復(fù)合物激活ORs的模型相一致。也有學(xué)者對(duì)上述模型提出質(zhì)疑，他們認(rèn)為cVA可以在沒有LUSH蛋白的情況下激活神經(jīng)元，但不能沒有SNMP或OR67d(Gomez-Diazetal., 2013)。

7 昆蟲OBPs的應(yīng)用現(xiàn)狀

明確候選化合物與嗅覺相關(guān)蛋白的分子互作，有利于研制新的昆蟲引誘劑或驅(qū)蟲劑，對(duì)于制定能夠干擾嗅覺介導(dǎo)行為反應(yīng)的傳播媒介控制新策略至關(guān)重要。由于氣味分子在沒有OBPs的情況下不能到達(dá)ORs，因此功能性O(shè)BPs可以作為篩選昆蟲引誘劑或驅(qū)蟲劑的分子靶點(diǎn)，其方法類似于“反向化學(xué)生態(tài)學(xué)”。此外，與ORs相比，OBPs具有分子量小、可溶性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、易于操作和修飾等優(yōu)點(diǎn)，是更容易體外獲得的研究對(duì)象。反向化學(xué)生態(tài)學(xué)方法依據(jù)化合物與嗅覺蛋白的結(jié)合親和力，從而減少了氣味候選化合物的數(shù)量，與在該領(lǐng)域常用的傳統(tǒng)試錯(cuò)篩選法相比，節(jié)省時(shí)間并降低研究成本。該策略首次成功應(yīng)用于臍橙螟引誘劑的研制(Lealetal., 2005b)。之后Leal(2013)以CquiOBP1為結(jié)合靶點(diǎn)，結(jié)合反向和常規(guī)化學(xué)生態(tài)學(xué)方法來鑒定非天然配體，該研究促進(jìn)了商品化的致倦庫(kù)蚊產(chǎn)卵引誘劑的研發(fā)。

目前，主要通過電腦模擬方法對(duì)“反向化學(xué)生態(tài)學(xué)”進(jìn)行改進(jìn)，以減少候選化合物的數(shù)量和加速新化學(xué)物質(zhì)發(fā)現(xiàn)，具體方法為：先采用電腦模擬方法進(jìn)行篩選，隨后通過熒光光譜法、量熱法、核磁共振或者測(cè)量結(jié)合配體的數(shù)量等不同方法來體外評(píng)估OBPs和預(yù)選配體之間的結(jié)合親和力。最后，通過生物測(cè)定和田間試驗(yàn)驗(yàn)證昆蟲對(duì)最佳配體的行為反應(yīng)(Jayanthietal., 2014)。鑒于此，閻偉等(2017)結(jié)合同源建模和分子對(duì)接方法篩選潛在的活性揮發(fā)物用于防控銹色棕櫚象Rhynchophorusferrugineus。

昆蟲OBPs除了作為開發(fā)昆蟲種群管理新產(chǎn)品的分子靶點(diǎn)之外，還在其他技術(shù)目的領(lǐng)域方面有一定的應(yīng)用。OBPs對(duì)小分子有機(jī)物質(zhì)具有親和力和特異性?；诖?，有學(xué)者合成了由家蠶BmorPBP1和致倦庫(kù)蚊CquiOBP1衍生的親和色譜柱(Margaryanetal., 2006)。同時(shí)，OBPs對(duì)酸堿、高溫的耐受性高，也可作為一種生物敏感材料，通過模擬生物嗅覺來檢測(cè)復(fù)雜環(huán)境中的不同化學(xué)物質(zhì)(盧妍利, 2017; Pelosietal., 2018b)。Larisika等(2015)就設(shè)計(jì)了一種基于還原石墨烯氧化物晶體管的嗅覺生物傳感器，該晶體管與AmelOBP14共同發(fā)揮作用，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)環(huán)境中的各種氣味。類似地，桔小實(shí)蠅OBPs也被用于高阻抗嗅覺傳感器來檢測(cè)寄主植物揮發(fā)物(Luetal., 2015)。近年來，根據(jù)完整OBPs的結(jié)合域合成有效長(zhǎng)度的小分子肽段，為高選擇性生物傳感器的研發(fā)提供了新的仿生材料(Wasilewskietal., 2019)。此外，OBPs對(duì)熱變性和蛋白降解的特殊穩(wěn)定性使其可以作為活性色譜相，直接用于分辨信息素或其他天然化合物的外消旋混合物(Pelosietal., 2014)。

8 小結(jié)與展望

盡管近十年來昆蟲嗅覺領(lǐng)域的研究取得了顯著的進(jìn)展，但對(duì)于昆蟲嗅覺感知的進(jìn)一步研究還很匱乏，仍然無法揭示OBPs參與化學(xué)感受的分子機(jī)制。OBPs如何向ORs釋放氣味, ORs如何被激活, OBPs在這些分子的特異性選擇中是否發(fā)揮作用,以及不同OBPs之間是否存在相關(guān)性等等，這些問題仍然是昆蟲嗅覺領(lǐng)域爭(zhēng)論的焦點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲嗅覺相關(guān)蛋白的作用和作用機(jī)制似乎在朝著不同的方向發(fā)展，但考慮到昆蟲種類繁多，這也是正常的。不過，OBPs可以作為氣味和信息素的載體，使其免受降解并順利通過感器淋巴液，仍然是最廣泛接受的假說。深入開展OBPs的生理功能研究有助于進(jìn)一步揭示昆蟲的化學(xué)感受機(jī)制，為昆蟲引誘劑或驅(qū)蟲劑、生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)劑的研制提供新思路。此外，通過計(jì)算機(jī)軟件模擬篩選OBPs的最佳作用配體，正在成為化學(xué)生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)非常重要的工具，該技術(shù)的發(fā)展將為昆蟲行為監(jiān)控，蟲媒傳播疾病預(yù)防以及進(jìn)一步的害蟲防治提供一種有效策略。

OBPs能夠行使除嗅覺以外的其他生理功能，值得進(jìn)一步驗(yàn)證與研究。這將意味著昆蟲OBPs不僅可以作為嗅覺傳感器的仿生材料，還可用于環(huán)境、食品質(zhì)量監(jiān)控及醫(yī)療設(shè)備等領(lǐng)域。另外，由于昆蟲OBPs易于修飾和表達(dá)，在不改變OBPs結(jié)構(gòu)的情況下通過定點(diǎn)突變技術(shù)來獲得更加穩(wěn)定、高選擇性、高靈敏度的特定OBPs，為生化檢測(cè)和疾病診斷提供新機(jī)遇。