吳鳳琪, 岳振峰*, 張 毅, 黃遠祥, 溫景嵐

(1. 深圳市檢驗檢疫科學(xué)研究院, 廣東 深圳 518045; 2. 深圳海關(guān)食品檢驗檢疫技術(shù)中心, 廣東 深圳 518045; 3. 深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 廣東 深圳 518055)

霉菌毒素是由某些生長在食品或飼料中的真菌所產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)類似的一大類二級代謝產(chǎn)物,對生物體生理功能有很強的影響,對人和動物的健康會造成不同程度的危害[1]。糧食和飼料在生產(chǎn)、收獲、儲存及加工過程中,均容易受到霉菌的污染引發(fā)霉變[1,2]。目前全球約四分之一的糧谷類食品受到不同程度的霉菌毒素污染[3],糧谷中霉菌毒素不僅會破壞或降低其營養(yǎng)價值和風(fēng)味,而且會帶來細胞毒性、生殖毒性、免疫毒性、遺傳毒性、肝腎毒性以及致癌、致畸、致突變等毒副作用,對人和禽畜的生長及健康均構(gòu)成嚴重的威脅。近年來隨著色譜、質(zhì)譜等儀器的發(fā)展,檢出水平不斷降低,特別是傳感器技術(shù)、免疫分析法、色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等新型檢測技術(shù)的應(yīng)用,可以更好地對糧谷類樣品中痕量的、高危害的霉菌毒素進行定性、定量分析,有效地推動了相關(guān)法律法規(guī)的規(guī)范化,從而減少霉菌毒素對人類的危害[4-7]。

1 霉菌毒素概述

有研究發(fā)現(xiàn),即使是超低劑量的霉菌毒素攝入,也可以造成霉菌毒素及其代謝物在生物體內(nèi)積蓄,經(jīng)過食物鏈傳導(dǎo)后危害人體健康,造成嚴重的食品安全事故。迄今為止全球已確認了大約400種霉菌毒素及其類似物,在糧食谷物中較為常見,其中因?qū)游锖腿祟愑袊乐囟拘宰饔枚鴤涫荜P(guān)注的霉菌毒素有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和伏馬菌素等[8,9]。

1.1 黃曲霉毒素

黃曲霉毒素(aflatoxins, AFs)是由黃曲霉和寄生曲霉通過聚酮途徑產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物[10],其結(jié)構(gòu)類似,均含有一個雙呋喃環(huán)和一個香豆素結(jié)構(gòu),其中兩個羰基氧化學(xué)性質(zhì)活潑,容易發(fā)生氫鍵締合,毒性強,耐高溫,不耐堿[11]?；ㄉ⒚藁?、大豆、玉米及核桃等糧谷類食品在生產(chǎn)、加工、存儲過程常常容易受到曲霉真菌感染[3],攜帶一定量的AFs,目前科學(xué)家已經(jīng)分離鑒定出30多種AFs及其衍生物[12],其中以黃曲霉毒素B族(AFB1、AFB2)和G族(AFG1、AFG2)在糧食谷物中較為常見[13],黃曲霉毒素M族(AFM1、AFM2)在動物體內(nèi)及其代謝物、動物源性食品中常常檢出[14]。AFs具有免疫抑制、細胞毒性、生殖毒性、肝毒性和腎毒性等多種毒副作用,最為致命的是其強致癌毒性,國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)已將毒性最強的AFB1列入人類致癌物(第1組)[10,15,16]。

1.2 赭曲霉毒素

赭曲霉毒素(ochratoxins)是主要由多種曲霉菌和純綠青霉產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物[17],其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,耐酸性、耐高溫,存在于一些常見的農(nóng)產(chǎn)品中,如葡萄[18]、咖啡、可可[19]、谷物[20]等,可通過畜禽食用被其污染的飼料轉(zhuǎn)移至動物源食品。赭曲霉毒素共有A、B、C、D 4種異構(gòu)體,其中,赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)對人和動物具有強烈的毒副作用,如免疫抑制作用等[21],能引起不可逆性的腎功能衰竭[22];并被證實對肝臟、腎臟及泌尿系統(tǒng)具有致癌毒性作用,IRAC及世界衛(wèi)生組織(WHO)將其列入2B類致癌物[23,24]。

1.3 玉米赤霉烯酮

玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN),又稱F-2毒素,首先從有赤霉病的玉米中分離得到,是一種由鐮刀菌毒素,如禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌等菌株污染的玉米、燕麥、小麥等谷物中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,其具有內(nèi)酯類化學(xué)結(jié)構(gòu),性質(zhì)穩(wěn)定、耐熱性好。自然界中,ZEN可被還原成兩種非對應(yīng)立體異構(gòu)體:α-玉米赤霉烯醇(α-ZEL)和β-玉米赤霉烯醇(β-ZEL),均具有雌激素活性,其中α-ZEL的毒性為ZEN的兩倍[25,26]。該類毒素具有雌激素樣活性,ZEN大量聚集可導(dǎo)致流產(chǎn)和死胎,且嬰幼兒更易受到傷害,WHO規(guī)定每日耐受量為0.5 μg/kg[27]。動物食用了該類毒素污染的飼料,極易引起雌激素樣效應(yīng)且可能轉(zhuǎn)移至人體,且具有生殖毒性、肝毒性和細胞毒性,具有潛在的致癌性[28]。ZEN污染主要存在于飼料、豆類、谷物、玉米的收割、儲藏、運輸過程中,是污染原糧和飼料的最常見霉菌毒素。

1.4 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON),又稱嘔吐毒素,主要由禾谷鐮刀菌(F. graminearum)和黃色鐮刀菌(F. culmorum)等產(chǎn)生,在小麥、大麥、燕麥、玉米等農(nóng)作物中多見,是一種分布面廣、影響較大的單端孢霉烯族化合物[29]。DON對人體和動物均有較強毒性,主要體現(xiàn)在影響生命體的正常生長發(fā)育,對脾臟、心臟和肝臟等造成潛在危害[30]。DON在全球各國均有出現(xiàn),在我國主要分布于長江以南區(qū)域,其不僅污染谷類作物及其制品,并且會轉(zhuǎn)移至肉制品、內(nèi)臟及乳及乳制品、蛋等動物源食品中[31]。DON化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,在酸性、中性、熱中穩(wěn)定,堿性條件下易分解。

1.5 伏馬毒素

伏馬毒素(fumonisin, FUM)是一類由串珠鐮刀菌(F. moniliforme Sheld)和輪狀鐮刀菌(F. vertricillioides)在適宜的環(huán)境下產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,是一類由多種多氫醇和丙三羧酸組成的雙酯化合物,耐熱,遇酸水解產(chǎn)物仍有部分毒性[32]。目前,伏馬毒素分離鑒別到FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4和FP1等11種,其中60%以上是FB1,其毒性也最強,因而被IARC歸為2B類致癌物[33]。有研究證實,伏馬毒素可產(chǎn)生神經(jīng)毒性、肺毒性、免疫抑制、致癌性等。據(jù)報道,我國8個省的玉米、水稻中的檢出率在28% ～100%之間,最高含量達到 15 252 μg/kg[34]。

近年來,鑒于食品中的真菌毒素污染范圍日益擴大,各國和相關(guān)國際組織先后制定和修訂了食品中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬毒素等真菌毒素的限量標(biāo)準。我國制定了GB 2761-2017《食品安全國家標(biāo)準食品中真菌毒素限量》,但該標(biāo)準未對伏馬毒素和T-2毒素制定限量。國際食品法典委員會(Codex Alimentarius Commission, CAC)則于2017年對CXS 193-1995《食品和飼料中污染物和毒素的通用標(biāo)準》重新修訂,制定了食品中常見真菌毒素的最大殘留限量標(biāo)準。歐盟、美國、日本等地規(guī)定[35]:食品中AFB1的限量范圍為0～20 μg/kg, AFs(B1+B2+G1+G2)總量的限量范圍為0～15 μg/kg; OTA的限量范圍為0.5～50 μg/kg,玉米赤霉烯酮的限量范圍為20～1 000 μg/kg,脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的限量范圍為200～2 000 μg/kg,伏馬毒素的限量范圍為200～4 000 μg/kg。以上食品中的霉菌毒素最大殘留限量法規(guī),以歐盟、日本規(guī)定的限量最為嚴格,我國對玉米赤霉烯酮也較為嚴格,其他各國對不同毒素要求各有差異。

2 霉菌毒素檢測的前處理方法

霉菌毒素對糧食谷物、膳食制品的污染率高,污染量大,污染范圍廣,且具有很強的毒副作用。制定和完善相關(guān)法律法規(guī)控制霉菌毒素引發(fā)的食品安全事故,需要發(fā)展高效、高靈敏、通用性好的霉菌毒素分析方法。然而,食品種類復(fù)雜多樣、基質(zhì)復(fù)雜,對霉菌毒素的準確定性定量造成較大干擾;而霉菌毒素痕量、高毒,往往需要一定樣品前處理手段將其從樣品中分離、富集,再以適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM行檢測。

圖 1 多種抗體免疫親和磁性材料的合成與分離分析AFs中的應(yīng)用[49]Fig. 1 Synthesis multiple antibody immunoaffinity & magnetic materials and applied to separate AFs[49]

2.1 液液萃取法

液液萃取(liquid-liquid extraction, LLE)利用待測物在兩種不相溶液體或相之間分配系數(shù)的差異,達到分離富集的目的。根據(jù)糧谷、飼料等樣品基質(zhì)和生物毒素化學(xué)性質(zhì)特點,常使用有機溶劑如乙腈、三氯甲烷、叔丁基甲醚或其混合溶劑從樣品液中提取目標(biāo)物[36]。然而,傳統(tǒng)的LLE法對有機溶劑需求量大,環(huán)境保護壓力大,為此發(fā)展了基于液液萃取的新技術(shù)用于霉菌毒素的檢測,如加壓液液萃取和分散液液微萃取[37,38]。其中分散液液微萃取通過少量的萃取溶劑在分散劑的幫助下,以小液滴的形式存在于整個體系中,充分接觸,將目標(biāo)物從體系中高效萃取,在食品中霉菌毒素的分析中具有有機溶劑用量少、前處理操作簡便等優(yōu)勢[39]。Zhao等[40]通過分散液液微萃取完成黃酒中多種霉菌毒素的分析,方法檢出限低于0.5 μg/kg,樣品加標(biāo)回收率在84.5% ～111.2% ,同時發(fā)現(xiàn)黃酒中霉酚酸檢出較多。Wang等[41]在分散液液微萃取過程中,耦合衍生化反應(yīng)完成植物油中AFs的一步分析。但由于液液萃取步驟繁瑣、選擇性較差且受基質(zhì)干擾影響大,在霉菌毒素的分析中應(yīng)用較少。

2.2 免疫親和技術(shù)

免疫親和層析技術(shù)能通過抗原抗體結(jié)合的高度特異性在復(fù)雜樣品基質(zhì)中選擇性捕獲霉菌毒素,再通過合適的方法使霉菌毒素解吸附,完成樣品前處理的凈化和富集,結(jié)合新型的高靈敏度儀器分析食品中痕量的霉菌毒素[42-44]。Sun等[45]采用免疫親和層析法作為前處理手段,結(jié)合HPLC-MS法分析食品中的AFs和玉米赤霉烯酮;通過組合多種單克隆抗體,制備了廣譜的霉菌毒素免疫親和層析材料,在山藥、桔梗、淫羊藿及薏仁中的加標(biāo)回收率為64.7% ～112.1% ,方法定量限為0.08-0.2 μg/kg。Iha等[46]通過免疫親和層析柱分離富集花生中的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2,回收率為70% ～125% ,滿足美國分析化學(xué)家協(xié)會(Association of Official Analytical Chemists, AOAC)方法性能要求;Sun等[47]通過超廣譜免疫親和柱同時分離富集蟲草中的6種AFs,回收率為79.28% ～103.42% ,方法定量限為0.008～0.045 μg/kg。Jinap等[48]直接用免疫親和層析材料制備色譜柱,在線完成食品中AFs的檢測分析,其中AFB1回收率為75.7% ～92.9% , AFB2回收率為72.1% ～103.0% , AFG1回收率為76.0% ～107.9% , AFG2回收率為82.1% ～103.3% 。近日Xie等[49]以多重抗體為外層、殼聚糖為中層、磁性Fe3O4為核,制備了多抗體免疫磁性納米材料(見圖1),用于谷物、堅果、植物油中6種AFs的分離分析;所建立方法的富集倍數(shù)達到同類免疫親和柱的60倍,靈敏度有了數(shù)量級的提升。目前免疫親和技術(shù)在食品中霉菌毒素殘留分析中得到了廣泛應(yīng)用,在我國多個食品安全國家標(biāo)準(如GB 5009.22-2016、GB 5009.24-2016、GB 5009.96-2016)都采用此類前處理方法。但是該技術(shù)仍然具有局限性,如單克隆抗體制備繁瑣、材料修飾復(fù)雜、抗體容易失活而需控制條件、抗體價格昂貴導(dǎo)致免疫親和層析柱價格不菲等。

2.3 固相萃取技術(shù)

固相萃取技術(shù)通過固定吸附材料對目標(biāo)組分的作用力將目標(biāo)物從試樣溶液中吸附,達到分離、凈化、富集的效果,廣泛應(yīng)用于食品中霉菌毒素的前處理過程。孟娟等[50]通過HLB柱及石墨化炭黑(GCB)富集純化糧食及其制品中6種玉米赤霉烯酮類物質(zhì)(α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇和β-玉米赤霉烯醇),以α-玉米赤霉烯酮-d4為內(nèi)標(biāo),6種目標(biāo)物的線性范圍為0.1～50 μg/L,相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.99,檢出限為0.1～0.2 μg/kg, 3個不同水平的平均加標(biāo)回收率為79.9% ～104.0% ,相對標(biāo)準偏差不大于10% 。Huang等[51]采用HLB復(fù)合柱作為樣品富集凈化手段,分析乳制品中多種霉菌毒素,方法具有較好的準確度(回收率87.0% ～109% )和重復(fù)性(RSD 3.4% ～9.9% )。傳統(tǒng)的固相萃取材料如C18復(fù)合柱、HLB復(fù)合柱,由于其吸附選擇性差、吸附容量有限,基質(zhì)抑制效應(yīng)較強,方法靈敏度低,限制了其在食品中痕量霉菌毒素分析中的進一步推廣[52]。分子印跡聚合物技術(shù)很好地彌補了傳統(tǒng)固相萃取材料選擇性不足的缺陷[52]。Cao等[53]基于分子印跡聚合物的固相萃取材料富集凈化-HPLC檢測,建立生姜中OTA的檢測方法,方法回收率為87.6% ～94.5% 。Liang等[54]制備了用于選擇性富集黃曲霉毒素B1的分子印跡聚合物整體柱,分析花生中黃曲霉毒素B1殘留,加標(biāo)回收率為79.5% ～91.2% ,日內(nèi)和日間RSD分別為1.2%和4.9% ,方法檢出限能達到0.118 ng/mL。

分子印跡聚合物固相萃取材料仍然有一些缺點,如吸附容量不足、制備復(fù)雜,但是它的出現(xiàn)為新型固相萃取材料的研發(fā)提供了思路。

3 霉菌毒素的檢測方法

樣品前處理手段盡可能將樣品中的目標(biāo)物組分從基體中分離,消除干擾,且富集到適合檢測的濃度水平。而目前用于霉菌毒素的檢測方法有:電化學(xué)分析法、酶聯(lián)免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、薄層色譜法(thin layer chromatography, TLC)、氣相色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法,其中主流技術(shù)是色譜和色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。

3.1 薄層色譜法

薄層色譜法利用真菌毒素在紫外光線產(chǎn)生的熒光,并通過熒光光度強弱和斑點大小判斷毒素類別和含量。TLC已被應(yīng)用于AFs、OTAs、ZEN等多種霉菌毒素的檢測分析[55-57]。Scott等[55]指出,高效薄層色譜法和二維薄層色譜法能縮短分析時間并提高對霉菌毒素分析結(jié)果的準確度,同時對硫華菊產(chǎn)生的微克量級的AFB1和AFG1進行了熒光衍生表征。Hoeltz等[58]用TLC聯(lián)合電感耦合檢測技術(shù)建立了花生中AFB1的檢測方法,定量限達到1.2 μg/kg,方法平均回收率為98% ,在31份花生樣品中檢出16～115 g/kg 水平的黃曲霉毒素B1。Korrapati等[59]根據(jù)AOAC方法從家畜樣品中提取AFB1,采用高效薄層色譜法分析,在4個熒光發(fā)射波長下檢測、定量,所得到的結(jié)果與酶聯(lián)免疫分析法一致。盡管如此,由于TLC檢測靈敏度受限、重復(fù)性差、不易完成自動化且準確度相對其他分析方法較差,在食品中痕量毒素分析方面應(yīng)用較少。

3.2 氣相色譜法

氣相色譜法利用惰性氣體作載氣,通過載氣將氣化樣品帶入色譜柱中,通過各個組分與固定相的分配系數(shù)的差異完成分離。毛細管氣相色譜法具有與高效液相色譜法相當(dāng)甚至更好的柱效,其具有分離效能高、方法靈敏度高、分析速度快和選擇性強等優(yōu)點。早在1988年,Goto等[60]采用毛細管氣相色譜法測定黃曲霉屬作物產(chǎn)生的AFs(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2),其中AFB1、AFB2的檢出限為1 ng, AFG1、AFG2的檢出限為2 ng;獲得了較準確的分析結(jié)果,但是受限于AFs的氣化性質(zhì)以及檢測器的性能,無法達到較高的檢測靈敏度。Yue等[61]也采用了使用電子捕獲檢測器的GC法分析中藥草及相關(guān)產(chǎn)品中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇,通過免疫親和層析凈化后,加標(biāo)回收率為85.5% ～97.2% , RSD<6.3% ,方法檢出限能達到2 μg/kg,定量結(jié)果與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)一致。由于霉菌毒素并不都具有良好的氣化性能,限制了GC法的檢出限以及適用性,故近年來較少采用GC法或GC-MS法分析霉菌毒素。

3.3 電化學(xué)分析法

3.4 免疫分析法

免疫分析法基于抗原抗體的高度特異性結(jié)合,選擇性強、靈敏度高,可分為非標(biāo)記和標(biāo)記免疫分析技術(shù)。在食品中真菌毒素檢測中常用的標(biāo)記免疫分析技術(shù)是ELISA:讓抗體與酶復(fù)合物結(jié)合,然后通過顯色來檢測;特異性好、靈敏度高、操作簡單[68],已經(jīng)在我國食品安全國家標(biāo)準(GB 5009.22-2016、GB 5009.24-2016、GB 5009.96-2016)中應(yīng)用于食品中AFs和OTA的檢測。Oplatowska等[69]以7種單克隆抗體建立了食品中AFs的酶聯(lián)免疫分析法,方法的檢測限為0.4 μg/kg,應(yīng)用于花生中AFB1的檢測,定量檢測結(jié)果與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的結(jié)果具有良好的一致性。Tsounidi等[70]和Eivazzadeh-Keihan等[71]分別利用免疫分析法的高度特異性,研發(fā)了基于免疫傳感器的毒素快速分析方法。Nabok等[72]以偏振衍射儀為基礎(chǔ)研發(fā)了一種平面波傳導(dǎo)為檢測原理的免疫傳感器,AFB1的檢出限可達0.01 ng/mL。Xie等[73]以多孔納米片作為熒光探針,設(shè)計了一種基于磁性納米顆粒的AFB1免疫傳感器,AFB1的檢出限可達0.002 ng/mL。而Bacher等[74]所研發(fā)的銀線阻抗免疫傳感器能檢測到牛奶中1 pg/mL 的AFM1。免疫分析法由于特異性強、靈敏度好、分析速度快、操作簡單等優(yōu)點,在霉菌毒素的快速檢測領(lǐng)域具有很好的發(fā)展前景[75],但是它不易實現(xiàn)自動化,且免疫抗體合成及修飾復(fù)雜、價格昂貴,可能會限制它在霉菌毒素分析檢測領(lǐng)域的發(fā)展。

3.5 高效液相色譜法

高效液相色譜法在食品中霉菌毒素殘留分析中也有廣泛的應(yīng)用。張曉旭等[76]采用柱后衍生-高效液相色譜法測定玉米中的伏馬菌素B1和B2,檢出限均為0.02 mg/kg,在0.1～4.0 mg/kg 范圍內(nèi),3個添加水平的平均回收率為82.5% ～89.8% 。Al-Hazmi等[77]通過HPLC法測定沙特阿拉伯市售果汁中的展青霉素和OTA,并檢出1例果汁中展青霉素超標(biāo)和5例OTA超標(biāo)。由于AFs的紫外吸收信號小,檢測靈敏度低,往往需要一些衍生化技術(shù),采用熒光分析法靈敏、準確分析試樣中AFs的含量,檢測靈敏度能與色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)相媲美[78]。于彥彬等[79]在固相萃取凈化后,采用高效液相色譜柱后衍生熒光檢測花生中黃曲霉毒素(B1、B2、G1和G2),回收率為68.8% ～101% , RSD為5.0% ～7.1% , Hepsag等[80]通過HPLC柱后衍生法建立了開心果和花生中AFs的分析方法,4種AFs的定量限為0.11～0.14 μg/kg。Golge等[81]也采用柱后衍生化HPLC分析核桃中的AFs,定量限為0.106～0.374 μg/kg,在112份實際樣品中檢出43.8%的樣品含有AFS。也有通過柱前衍生化HPLC法分析AFs的實例:蘇靜華等[82]利用柱前光衍生化HPLC建立胖大海中AFs的檢測方法,檢測靈敏度高,回收率為97.06% ～99.93% 。柱前衍生化技術(shù)相對柱后衍生化更加方便、準確,與GB 5009.22-2016《食品安全國家標(biāo)準食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》技術(shù)路線一致。另外Geng等[83]在檢測器流通池方面,開發(fā)了流通池集成紫外誘導(dǎo)熒光檢測器檢測AFs。

圖 2 被霉菌毒素污染的葡萄及其質(zhì)譜成像圖[94]Fig. 2 Grapes polluted by OTA and their mass spectrometry images[94]a. grape infested with A. carbonarius five days after inoculation; b. grape during cryosectioning; c-e. localization of protonated, sodiated and potassiated OTA within the grape section.

3.6 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)兼具色譜法的高效分離和質(zhì)譜檢測器的通用性,對霉菌毒素檢測的適用性廣、靈敏度高,能完成食品或飼料中多種霉菌毒素的同時檢測[84-87]。Meerpoel等[88]采用UPLC-MS法建立了能同時分析食品和飼料中OTA和桔霉素的檢測方法,定量限分別為5.6和3.9 μg/kg,方法性能指標(biāo)滿足歐盟No. 401/2006/EC和No. 2002/657/EC指令要求。Stefanovic等[89]對比了ELISA和超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)兩種檢測方法對牛奶中AFM1及玉米中AFB1的分析,兩種方法都具有特異性高和靈敏度高的特性,適用性和可靠性得到了很好的驗證。在生物化學(xué)和體內(nèi)毒理分析中,UPLC-MS/MS對霉菌毒素的分析也得到了廣泛的應(yīng)用。González-Arias等[90]采用UPLC-MS法分析共培養(yǎng)系統(tǒng)中霉菌產(chǎn)生的OTA,發(fā)現(xiàn)未來可采用OTA甲酯作為OTA暴露水平的生物標(biāo)志物進行研究。Han等[91]通過UPLC-MS研究了大鼠體內(nèi)OTA的體內(nèi)動力學(xué)和生物轉(zhuǎn)化,在大鼠腎臟和脾臟中鑒定了OTA的代謝產(chǎn)物OTβ(ochratoxin β)和OTB(ochratoxin B)甲酯,證實了OTA的一種代謝途徑。近年來,為了簡化前處理步驟、縮短分析時間,實時直接分析(direct analysis in real time, DART)與UPLC-MS聯(lián)用應(yīng)用于食品中霉菌毒素的分析檢測:宮小明等[92]采用利用QuEChERS技術(shù)對紅酒樣品進行前處理,直接進樣分析,無需色譜分離,既節(jié)省了分析時間,又減少了有機溶劑的使用,適合大批量酒樣中OTA污染殘留檢測。

3.7 質(zhì)譜成像技術(shù)

質(zhì)譜成像技術(shù)(mass spectrometry imaging, MSI)將質(zhì)譜離子掃描技術(shù)與成像技術(shù)結(jié)合,可視化呈現(xiàn)組織切片中目標(biāo)物的質(zhì)荷比(m/z)信息,再通過軟件進行有效數(shù)據(jù)的提取、分析和歸類[93]。Hickert等[94]以基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時間質(zhì)譜成像技術(shù)可同時鑒別被真菌毒素污染的葡萄中OTA及12種伏馬毒素(見圖2),可直觀顯示樣品被污染的程度及污染區(qū)域。De Oliveira等[95]通過花生皮和花生仁切片、制樣后,以SPI(silica plate imprinting)-MSI鑒別污染的黃曲霉毒素(B1、B2、G1和G2)的空間分布,可實時、快速鑒定堅果中真菌污染的空間分布。Berisha等[96]采用激光解吸-高分辨質(zhì)譜成像技術(shù),在無任何樣品前處理情況下,對小麥種子中的DON毒素進行快速篩查鑒定,質(zhì)量數(shù)誤差小于2 ppm(2×10-6),且方法分辨率不受樣品基質(zhì)中水分含量的影響。MSI檢測真菌毒素的優(yōu)勢在于,簡化(或無需)樣品前處理過程、可快速鑒別多種類毒素,且同時確定毒素樣品中的污染分布。然而MSI技術(shù)屬于典型的定性分析技術(shù),盡管鑒別篩查效率很高,但是對于初篩出的陽性樣品,后續(xù)仍需LC-MS/MS技術(shù)進一步確證。因此,MSI在食品安全檢測中的應(yīng)用尚不廣泛。

4 小結(jié)

目前,對于食品中霉菌毒素的分析檢測,已經(jīng)發(fā)展了基于液液萃取、固相萃取、磁性材料萃取和核酸適配體材料的樣品前處理技術(shù),以及基于免疫分析、傳感器技術(shù)和快速色譜-質(zhì)譜檢測技術(shù)的聯(lián)用,以滿足檢出限不斷提高的毒素檢測需求。但其樣品前處理步驟仍然較為繁瑣,高靈敏的定性定量檢測仍依賴于色譜及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等大型儀器設(shè)備,價格昂貴,普及面受限。在提高分析效率、降低成本、減少前處理步驟方面主要有以下發(fā)展趨勢。(1)研發(fā)新型高選擇性填料,例如磁性材料、功能化材料等;引入熒光標(biāo)記技術(shù)、電化學(xué)發(fā)光、納米量子點、微流控芯片技術(shù),提高毒素檢測前處理技術(shù)精準度和操作的便利性,但新型材料的價格仍然是需要解決的難題。(2)質(zhì)譜及聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用日趨廣泛,降低了毒素檢測成本,縮短了分析時間,同時滿足了政府監(jiān)管部門對于毒素高通量的檢測需求,提高了監(jiān)管效能,進一步提升了食品安全的保障能力,促進了貿(mào)易便利化。綜上所述,食品中霉菌毒素檢測技術(shù)受到國內(nèi)外研究者和相關(guān)監(jiān)管部門的高度關(guān)注,技術(shù)發(fā)展很快,法律、標(biāo)準也在不斷完善,未來將對維護食品安全和消費者健康起到重要作用。