龐 杰，劉 海，康立茹，于傳宗，王海燕，李亞嬌，孫國琴

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.食用菌內(nèi)蒙古自治區(qū)工程研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3.鄂托克旗草原工作站，內(nèi)蒙古 烏蘭鎮(zhèn) 016100）

羊肚菌（Morchella esculenta）隸屬于子囊菌門（Ascomycota） 盤 菌 綱（Pezizomycetes） 盤 菌 目（Pezizales） 羊肚菌科（Morchellaceae）羊肚菌屬（Morchella），是世界公認(rèn)的一類珍貴、稀有食（藥）用真菌，在歐洲被認(rèn)為是僅次于塊菌的美味食用菌[1]。在北美洲、亞洲（中國、日本、印度、朝鮮）和歐洲均有分布，在我國的分布范圍比較廣泛，主要分布在西南、中原、華中、華東區(qū)域。目前，關(guān)于內(nèi)蒙古地區(qū)野生羊肚菌研究尚屬空白。

羊肚菌屬根據(jù)形態(tài)特征被劃分為四大類群：黑色羊肚菌類、黃色羊肚菌類、半開羊肚菌類和變紅羊肚菌類[2-4]?，F(xiàn)代分子系統(tǒng)發(fā)育分析認(rèn)為，羊肚菌屬由黃色羊肚菌（Esculenta）支系、黑色羊肚菌（Elata）支系和變紅羊肚菌（Rufobrunnea）支系構(gòu)成，半開羊肚菌類被劃分到黑色羊肚菌支系中[5-6]。杜習(xí)慧等[7]將我國羊肚菌分布劃分為六個區(qū)域，其中歐亞草原亞區(qū)和中亞荒漠亞區(qū)的羊肚菌有待調(diào)查和研究。內(nèi)蒙古地處我國北疆，生態(tài)類型多樣，生物多樣性豐富。筆者在內(nèi)蒙古鄂爾多斯市進(jìn)行野外食用菌資源調(diào)查中發(fā)現(xiàn)了野生羊肚菌的分布，并且鄂爾多斯地區(qū)地處歐亞草原亞區(qū)和中亞荒漠亞區(qū)交匯地區(qū)，目前上述地區(qū)羊肚菌鑒定工作尚屬空白。因此，該項研究工作的開展填補(bǔ)了內(nèi)蒙古羊肚菌鑒定的空白。

1 材料和方法

1.1 材料

羊肚菌子實體采集于內(nèi)蒙古鄂爾多斯市獨貴塔拉鎮(zhèn)附近，采集時間為2016年4月，標(biāo)本保藏于內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所（圖1）。

1.2 羊肚菌菌種分離

分離方法和培養(yǎng)基配方參見文獻(xiàn)［8］。

1.3 DNA 提取、ITS 擴(kuò)增及測序

DNA 提取采用CTAB 法[9]，PCR 反應(yīng)體系參考王凱[10]所采用的方法。PCR 引物為ITS1/4，由上海生工生物工程有限公司合成；ITS 測序由北京博邁德基因技術(shù)有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測序數(shù)據(jù)提交NCBI 數(shù)據(jù)庫和羊肚菌多基因序列模標(biāo)數(shù)據(jù)庫（Morchella MLST 數(shù)據(jù)庫），獲得比對數(shù)據(jù)；采用MEGA v7.0.14 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及遺傳距離的計算，遺傳距離采用鄰接法（Neighbor-joining methhod）。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS 測序NCBI 數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果分析

將培養(yǎng)的菌絲體提取DNA 并經(jīng)過PCR，交測序公司進(jìn)行測序。測定的樣品子實體rDNA ITS 序列長度為1 185 bp，其中CG 為54.43%，測序質(zhì)量優(yōu)良，將測得的序列提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫，獲得序列號為MN872380。

將測序獲得的堿基序列提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對（2019年12月27日），共計獲得100 個比對結(jié)果，最大評分范圍為1 884～1 029；同源性范圍為97.97%～88.19%。進(jìn)一步對100 個比對結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果將目標(biāo)羊肚菌分在8 種類型中（表1），剔除無法獲得準(zhǔn)確名稱的Morchella sp. 和Uncultured Morchella，目標(biāo)測序結(jié)果（MN872380）可能的學(xué)名為M. spongiola、M. esculenta、M. prava、M. dunensis、M. vulgaris、M. crassipes。

表1 ITS 序列在GenBank 中比對結(jié)果（2019-12-27）

進(jìn)一步選用NCBI 數(shù)據(jù)庫51 個有確定拉丁學(xué)名的DNA 序列結(jié)果，采用遺傳距離的計算（鄰接法，Neighbor-joining methhod）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及遺傳距離的計算。結(jié)果表明，目標(biāo)測序結(jié)果（MN872380）單獨成一類，與其他相關(guān)的DNA 序列結(jié)果都不接近（圖2）。

2.2 Morchella MLST 數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果分析

為了進(jìn)一步確定目標(biāo)測序結(jié)果（MN872380），將ITS 測序結(jié)果提交至Morchella MLST 數(shù)據(jù)庫[7]進(jìn)行比對，獲得50 個比對結(jié)果，評分范圍為1 586.55～1 228.35，相似性范圍為98.03～94.20，重疊百分比范圍為90.13%～73.92%。進(jìn)一步對50 個比對結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果將目標(biāo)羊肚菌分在4 種類型中（表2），剔除無法獲得準(zhǔn)確名稱的Morchella sp.，目標(biāo)測序結(jié)果（MN872380）可能的學(xué)名為M. spongiola、M. prava、M. esculenta。

進(jìn)一步選用Morchella MLST 數(shù)據(jù)庫27 個有確定拉丁名的DNA 序列結(jié)果，采用MEGA v7.0.14 軟件對其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及遺傳距離的計算（鄰接法）。結(jié)果表明，目標(biāo)測序結(jié)果（MN872380）與KM485935、JQ691480、EU834822 和EU834821 分在一類（圖3）。

表2 ITS 序列在Morchella MLST 數(shù)據(jù)庫中比對結(jié)果（2019-12-27）

3 結(jié)論與討論

羊肚菌屬由黃色羊肚菌（Esculenta）支系、黑色羊肚菌（Elata）支系和變紅羊肚菌（Rufobrunnea）支系構(gòu)成[5-6]。WIPF 等[11]對黃色羊肚菌和黑色羊肚菌的ITS 序列進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)黑色羊肚菌的ITS 序列長度為740～750 bp，黃色羊肚菌的ITS 序列長度為1 150～1 220 bp，本次采集的羊肚菌ITS 序列長度為1 185 bp，因此推斷為黃色羊肚菌支系。

進(jìn)一步對兩個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，雖然通過Morchella MLST 數(shù)據(jù)庫比對結(jié)構(gòu)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹中將目標(biāo)測序結(jié)果（MN872380）與KM485935、JQ691480、EU834822 和EU834821 分 在 一 類，但是，有同一類拉丁學(xué)名并不統(tǒng)一，相同拉丁學(xué)名也在不同類別當(dāng)中出現(xiàn)的問題。并且在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)一步檢索KM485935、JQ691480、EU834822和EU834821 的相關(guān)信息，無法獲取準(zhǔn)確地采集地等信息。綜上所述，鄂爾多斯地區(qū)分布有黃色羊肚菌類（yellow morels），但其拉丁學(xué)名尚不能通過單一的ITS 確認(rèn)，目標(biāo)測序結(jié)果（MN872380）的拉丁學(xué)名確定，仍需要進(jìn)一步采取LSU、EFla、RPB1 和RPB2 等多基因聯(lián)合分析才能完成[12]。