姜蕾 張麗媛 劉大寧★

2019 新型冠狀病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）是一種單鏈RNA 冠狀病毒，基因組序列由29 903 bp 構成，該基因組擁有10 個基因，可以有效地編碼10 個蛋白。2019-nCoV 可引起呼吸道感染，目前WHO 已確定其感染所致肺炎統(tǒng)一命名為“新型冠狀病毒肺炎（Novel coronavirus pneumonia，NCP）”。目前，新型冠狀病毒肺炎并沒有特定的治療方法，早期診斷與早期隔離是防止疫情擴散的關鍵，因此，及時篩查出確診病人是疫情控制的首要任務［1-2］。在最新版本（新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案）的診療方案中，新型冠狀病毒核酸的檢出是確診依據，熒光定量PCR 技術為新型冠狀病毒核酸檢測的主要方法［3］。新型冠狀病毒具有較強的傳染性，在進行核酸檢測過程中，實驗室的檢測人員具有較大的感染風險。本研究比較兩種不同咽拭子標本滅活方法對熒光定量PCR 實驗結果的影響，為防止實驗室內感染和傳播，保護實驗室檢測人員的安全提供有效的安全方法。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2020年2月1日以來濮陽地區(qū)確診病例3例，依據《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第四版）》和《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第七版）》，符合相關流行病學、臨床表現，以及咽拭子檢測2019-nCoV 核酸陽性。

1.2 試劑和儀器

病毒RNA 提取試劑盒由中山大學達安基因股份有限公司提供、熒光定量RT-PCR 試劑由中山大學達安基因股份有限公司（試劑A）和上海之江生物科技股份有限公司提供（試劑B）。RNA 樣本保存液由廣州邦德盛生物科技有限公司提供。熒光定量PCR 儀為ABI7500（Life Technologies，NY，USA）。

1.3 標本采集與處理

被采集人員先用生理鹽水漱口，采樣人員將拭子放入無菌生理鹽水中濕潤，被采集人員頭部微仰，嘴張大，露出兩側咽扁桃體，將拭子越過舌根，在被采集者兩側咽扁桃體稍微用力來回擦拭至少3 次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3 次，將拭子頭浸入含2～3 mL 病毒保存液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。

每份標本分為三組，每組提取140 μL，分別采用三種處理方法，未滅活加入280 μL 生理鹽水，56℃滅活30 min 后加入280 μL 生理鹽水和加入280 μL 胍鹽RNA 保存液滅活。

1.4 核酸提取

中山大學達安基因股份有限公司的核糖核酸（RNA）抽提試劑盒，在生物安全柜內對咽拭子樣本進行核酸提取，嚴格安裝說明書上的操作步驟提取病毒提取液。

1.5 上機檢測

使用兩種不同的核酸檢測試劑對樣本進行實時熒光定量PCR 檢測。

1.6 統(tǒng)計學分析

Graphpad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。Spearman 相關系數對不同處理的標本CT 值進行相關性分析，采用Bland-Altman 圖對CT 值一致性進行分析。

2 結果

2.1 3 組qPCR 結果相關性分析

用試劑A 檢測，未滅活組與56℃滅活30 min組CT 值相關性分析，Spearman 相關系數為r=0.9959（P＜0.001）；未滅活組與胍鹽RNA 保存液滅活組CT 值相關性分析，相關系數為r=0.9958（P＜0.001）；56℃滅活30 min 組與胍鹽RNA 保存液滅活組CT 值相關性分析，相關系數為r=0.9966（P＜0.001），見圖1。用試劑B 檢測，未滅活組與56℃滅活30 min 組CT 值相關性分析，Spearman 相關系數為r=0.9886（P＜0.001）；未滅活組與胍鹽RNA保存液滅活組CT 值相關性分析，相關系數為r=0.9967（P＜0.001）；56℃滅活30 min 組與胍鹽RNA保存液滅活組CT 值相關性分析，相關系數為r=0.9915（P＜0.001），見圖2。用試劑A 與試劑B 兩種不同的試劑同時檢測，未滅活組、56℃滅活30 min 組和加入胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結果相關性明顯。

2.2 3 組qPCR 結果一致性分析

用試劑A 檢測，未滅活組與56℃滅活30 min組CT 值差異性分析，偏差=0.3055（圖3a）；未滅活組與胍鹽RNA 保存液滅活組CT 值差異性分析，偏差=0.2335（圖3b）；56℃滅活30 min 組與胍鹽保存液滅活組CT 組差異性分析，偏差=0.2640（圖3c）。用試劑B 檢測，未滅活組與56℃滅活30 min組CT 值差異性分析，偏差=0.1643（圖4a）；未滅活組與胍鹽RNA 保存液滅活組CT 值差異性分析，偏差=0.06325（圖4b）；56℃滅活30 min 組與胍鹽保存液滅活組CT 組差異性分析，偏差=0.1472（圖4c）。Bland-Altman 分析結果顯示，用試劑A 與試劑B 兩種不同的試劑盒同時檢測，未滅活組、56℃滅活30 min 組和加入胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結果具有較好的一致性。

圖1 未滅活組，56℃30 min 加熱滅活組與胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結果相關性分析（試劑A）Figure1 Correlation analysis of qPCR results among the un-inactivated group，the inactivated group heated at 56℃for 30 minutes and the guanidine inactivation group（detection kit A）

圖2 未滅活組，56℃30 min 加熱滅活組與胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結果相關性分析（試劑B）Figure1 Correlation analysis of qPCR results among the un-inactivated group，the inactivated group heated at 56℃for 30 minutes and the guanidine inactivation group（detection kit B）

圖3 未滅活組，56℃30 min 加熱滅活組與胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結果一致性分析（試劑A）Figure3 Consistency analysis of qPCR results among the un-inactivated group，the inactivated group heated at 56℃for 30 minutes and the guanidine inactivated group（detection kit A）

圖4 未滅活組，56℃30 min 加熱滅活組與胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結果一致性分析（試劑B）Figure4 Consistency analysis of qPCR results among the un-inactivated group，the inactivated group heated at 56℃for 30 minutes and the guanidine inactivated group（detection kit B）

2.3 不同檢測試劑對同一種標本處理方法下檢測結果一致性分析

試劑A 與試劑B 檢測結果CT 值差異性分析，偏差=1.031（圖5）。Bland-Altman 分析結果顯示，兩種試劑盒檢測同一標本，qPCR 結果具有良好的一致性。

圖5 兩種檢測試劑對同一標本處理方法下檢測qPCR結果一致性分析Figure5 Consistency analysis of qPCR results between the two test reagents treated the same specimen

3 討論

新型冠狀病毒屬于β 屬的冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或者橢圓形，常為多形性，直徑60～140 nm。其基因特征與SARA-CoV 和MERS-CoV有明顯區(qū)別。目前研究顯示與蝙蝠SARS 樣冠狀病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性達85%以上。對冠狀病毒理化特征的認識多來自對SARA-CoV 和MERS-CoV 的研究。病毒對紫外線和熱敏感，56℃30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒，氯已定不能有效滅活病毒。經呼吸道飛沫和密切接觸傳播是主要的傳播途徑［4］。在相對封閉的環(huán)境中長時間暴露于高濃度氣溶膠情況下存在經氣溶膠傳播的可能。檢驗人員在做好生物安全防護外，在不影響結果的前提下，若能在檢測前將標本進行滅活處理，將大大降低感染的幾率［5］。本研究通過2019新型冠狀病毒樣本核酸提取前，用兩種不同滅活方法分別處理咽拭子標本，對熒光定量PCR 檢測結果進行統(tǒng)計學分析。

本研究選用兩種滅活方法處理咽拭子標本，56℃30 min 加熱滅活和胍鹽病毒保存液滅活。胍鹽可使蛋白質變性，溶解蛋白質并使蛋白質二級結構消失，導致細胞結構降解，核蛋白迅速與核酸分離。胍鹽可對新型冠狀病毒2019-nCoV 臨床樣本進行蛋白質變性而起到滅活作用，大大降低了檢驗過程中的生物傳染風險。胍鹽不僅具有沉淀蛋白質的作用，還具有抑制核酸酶的作用，從而保證釋放出來的核酸不被降解。

本研究用兩種新型冠狀病毒核酸檢測試劑同時檢測，Spearman 相關系數對不同處理的標本CT值進行相關性分析后得出，未滅活組、56℃滅活30 min 組和加入胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結果相關性明顯。Bland-Altman 分析結果顯示，未滅活組、56℃滅活30 min 組和加入胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結果具有良好的一致性。

綜上所述，56℃滅活30 min 組和加入胍鹽RNA 保存液滅活對于檢測2019-nCoV 核酸結果無影響，可在檢測前滅活以降低檢驗人員感染風險。在后續(xù)的研究中，需加大標本量，將有助于進一步明確不同滅活處理對于檢測結果的影響。