朱 穎 吳隆坤 賈有青 李 哲 肖志剛

（1 沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院 沈陽110034 2 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱150030）

黑豆，又名黑大豆、料豆，呈卵圓形或球形，豆皮呈黑色，在豆類中蛋白質(zhì)的含量最高。黑豆不僅蛋白質(zhì)含量高于黃豆，異黃酮、維生素E 等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量也很高，素有“植物蛋白之王”的美譽(yù)[1]。研究表明黑豆蛋白的溶解分散性和乳化性以及乳化穩(wěn)定性優(yōu)越于大豆蛋白，而起泡性及起泡穩(wěn)定性較差[2]。對(duì)黑豆蛋白的研究大多數(shù)是對(duì)其提取方法進(jìn)行研究，如采用超聲、微波等方法輔助提取黑豆蛋白[3-4]。黑豆蛋白提取率提高，可節(jié)約時(shí)間與能源。還有通過物理、化學(xué)和酶法等改變黑豆蛋白的空間結(jié)構(gòu)和分子特性，從而改變蛋白的功能性質(zhì)；通過研究大豆蛋白與可溶性多糖的相互作用機(jī)制，研究其影響大豆蛋白的乳化性、起泡性等功能特性。

研究表明，蛋白質(zhì)可以通過靜電吸引與糖類形成靜電復(fù)合物，改變蛋白的表面電性，進(jìn)而影響蛋白的乳化性能。樊雪靜等[5]研究發(fā)現(xiàn)大豆蛋白與寡糖形成的可溶性復(fù)合物的溶解性、乳化性和乳化穩(wěn)定性均得到提高。

超聲波技術(shù)在各行業(yè)都有應(yīng)用。超聲波可分為兩種：一種是功率超聲波（低頻率、高能量），另一種是檢測(cè)超聲波（高頻率、低能量）。功率超聲主要是進(jìn)行超聲治療、超聲霧化等。檢測(cè)超聲中的超聲波主要作為信號(hào)使用。在食品行業(yè)中經(jīng)常使用超聲技術(shù)，如提取和分離、殺菌、干燥、乳化、檢測(cè)等方面[6]。超聲波技術(shù)為一種物理處理方法，被視為食品行業(yè)中“綠色加工”的發(fā)展需要，是當(dāng)代食品行業(yè)研究中的新熱點(diǎn)[7]。

通過研究黑豆蛋白與可溶性多糖的協(xié)同作用，研究二者的復(fù)合物在不同超聲功率作用下的結(jié)合情況以及對(duì)黑豆蛋白功能性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的影響，為黑豆蛋白的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所；可溶性多糖，鄭州荔諾生物有限公司；金龍魚大豆油，市售。氫氧化鈉，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；鹽酸，北京新光化工試劑廠；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；其它試劑的最低純度為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

LS-55 熒光分光光度計(jì)，美國(guó)PE 公司；UV-240IPC 紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司；JY92-IIN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；LGR20-W 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑豆蛋白的制備 黑豆蛋白的制備參考Wolf[8]的方法。將新鮮黑豆用磨粉機(jī)研磨成磨粉并過60 目篩，將得到的豆粉以1∶3 的比例與正己烷混合，置水浴鍋中于40 ℃攪拌2 h，靜置一段時(shí)間后倒掉上清液，即1 次脫脂，重復(fù)脫脂過程3 次。將豆粉與蒸餾水以1∶10 的比例混合，用NaOH 溶液將混合液的pH 值調(diào)至8.5，放在水浴鍋中保持在45 ℃并用攪拌器攪拌2 h（在攪拌期間保持溶液的pH 8.5）。取出懸浮液在4 ℃、9 000×g 的條件下離心20 min，取其上清液用HCl 將溶液的pH值調(diào)節(jié)至4.5。放置一段時(shí)間后在4 ℃、6 000×g 條件下離心20 min，得到蛋白沉淀用蒸餾水洗2 次，最后用NaOH 將溶液的pH 值調(diào)節(jié)至7.0。將此溶液冷凍干燥后研磨即為黑豆蛋白。

1.3.2 黑豆蛋白與可溶性多糖復(fù)合物溶解性的測(cè)定 將所制備的蛋白與多糖按1∶1，1∶2，1∶3 的比例混合，溶解于蒸餾水中并調(diào)節(jié)溶液的pH 值為3.0。將溶液磁力攪拌3 h，加入0.02%的疊氮化鈉。用Lowry 法測(cè)定可溶性蛋白含量。

1.3.3 黑豆蛋白與可溶性多糖復(fù)合物乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定 復(fù)合物的乳化性釆用Li 等[9]的方法測(cè)定。分別取9 mL 復(fù)合物溶液加入3 mL 的菜籽油，在室溫（25 ℃）下用10 000 r/min 高速勻漿機(jī)均質(zhì)1 min，快速取出50 μL 樣品，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的SDS 溶液稀釋250 倍，漩渦震蕩混勻后用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)500 nm 處測(cè)定吸光值A(chǔ)0。靜置30 min 后用同樣方法測(cè)定吸光值A(chǔ)30。乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）計(jì)算公式如下：

式中：A0——最初的乳化液在500 nm 處的吸光值；C——乳化液形成之前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度（g/mL）；Φ——菜籽油占乳化液的體積分?jǐn)?shù)（φ=0.25）；A30——乳化液靜置30 min 后的吸光值。

1.3.4 黑豆蛋白與可溶性多糖復(fù)合物起泡性及氣泡穩(wěn)定性的測(cè)定 稱取0.605g tris 溶于50 mL 蒸餾水中，用2 mol/mL HCl 溶液調(diào)節(jié)pH 值為8.5，分別取復(fù)合物溶液2 mL 于試管中，各加入8 mL tris-HCl 緩沖液，用高速分散機(jī)均質(zhì)1 min。將均質(zhì)后的溶液快速轉(zhuǎn)移到25 mL 量筒中，每隔一段時(shí)間記錄泡沫的體積，通過觀察泡沫體積和靜置穩(wěn)定后的泡沫體積來評(píng)定樣品的起泡性（FC）和泡沫穩(wěn)定性（FS）。計(jì)算公式為：

式中：V0——起泡0 h 時(shí)的泡沫體積/mL；Vt——起泡t h 后的泡沫體積/mL；Vi——起泡前最初液體的體積/mL。

1.3.5 超聲處理對(duì)復(fù)合物理化性質(zhì)的影響 黑豆蛋白與可溶性多糖以1∶2 的比例混合，溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)溶液的pH 值為3.0，磁力攪拌溶液3 h 后，將復(fù)合物放在冰水浴中，將超聲探頭浸入液面以下2 cm 的位置，選用工作時(shí)間5 s，間隔時(shí)間5 s 的操作方法在特定超聲功率400 W[10]下分別超聲處理8，16，24 min，在波長(zhǎng)500 nm 處測(cè)定超聲后3 種樣品的乳化性質(zhì)及起泡性質(zhì)。

1.3.6 熒光光譜測(cè)定 采用熒光光度計(jì)測(cè)定超聲處理后的蛋白-多糖復(fù)合液，將3 種樣品稀釋10倍后放入試管中。熒光光譜的激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm，掃描發(fā)射光譜范圍250～400 nm，掃描的速度60 nm/min，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為5 nm。

1.3.7 圓二光譜測(cè)定 在遠(yuǎn)紫外區(qū)域進(jìn)行圓二光譜測(cè)定，探究超聲對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。稱取一定量超聲處理后的樣品，溶于pH 7.0 的磷酸鹽緩沖溶液中，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL。圓二光譜在200～300 nm 之間掃描，試驗(yàn)溫度20 ℃，樣品池的光學(xué)長(zhǎng)度1 mm，敏感度100 med g/cm，掃描速度100 nm/min，分辨率0.1 nm。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次，通過SPSS2.0 軟件分析數(shù)據(jù)，采用SigmaPlot 12.5 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同比例黑豆蛋白-可溶性多糖復(fù)合物理化性質(zhì)比較

2.1.1 對(duì)溶解性的影響 將各標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)液分別用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，列出方程。該標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=0.448x-0.0083，回歸系數(shù)R2= 0.9908，線性良好，可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算復(fù)合物中蛋白質(zhì)的濃度。

將所測(cè)吸光度值帶入方程，得到3 種待測(cè)的蛋白濃度分別為0.36，0.29，0.49 mol/L。由此得知將大豆分離蛋白與可溶性多糖以1∶3 的比例混合時(shí)得到的復(fù)合物的蛋白溶解性最好。

2.1.2 乳化性質(zhì)比較 將樣品溶液加入菜籽油后均質(zhì)1 min，取樣加入SDS 溶液稀釋，在波長(zhǎng)500 nm 處測(cè)定它的吸光值。分析圖1發(fā)現(xiàn)，1∶1 復(fù)合物的乳化性最差，1∶2 的復(fù)合物的乳化性最好。這是因?yàn)槎嗵堑拇嬖谑沟鞍椎娜榛栽黾?，多糖可與溶液中的蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，其中接枝的多糖所具有的空間位阻作用抑制了乳液液滴間的凝集，使乳液的穩(wěn)定性提高[11]。

將測(cè)定乳化性后的溶液靜置30 min，在波長(zhǎng)500 nm 處測(cè)定其吸光值。分析圖1發(fā)現(xiàn)，1∶1 復(fù)合物在16.5 min 內(nèi)的乳化穩(wěn)定性較好，而1∶2 復(fù)合物在27.8 min 內(nèi)乳化穩(wěn)定性最好。這是因?yàn)楹诙沟鞍字械牡鞍踪|(zhì)與多糖形成的共價(jià)接枝物所具有的物理化學(xué)性質(zhì)，尤其是疏水和親水特性，使它們能夠穩(wěn)定泡沫體系[12]。

2.2 不同超聲處理時(shí)間對(duì)復(fù)合物的影響

2.2.1 乳化性質(zhì)的變化 經(jīng)分析，以1∶2 的比例混合時(shí)，蛋白與多糖復(fù)合程度較好。選用1∶2 的復(fù)合物進(jìn)行相應(yīng)試驗(yàn)處理。選用工作時(shí)間4 s，間隔時(shí)間4 s 的操作方式，在一定的超聲功率下分別處理8，16，24 min。在波長(zhǎng)500 nm 處測(cè)定它的吸光值。對(duì)圖2進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)超聲處理均不同程度地提高溶液的乳化性。不同的超聲處理使溶液發(fā)生物理振蕩，破壞分子結(jié)構(gòu)，分離蛋白發(fā)生部分展開并在油-水界面聚集，降低了溶液的表面張力，從而使乳化性有一定的提高[13]。超聲處理16 min 時(shí)，乳化值達(dá)到最大值。可能是因?yàn)槌幚頃r(shí)產(chǎn)生的空化和機(jī)械作用，使可溶蛋白成分中的4 級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，短時(shí)間內(nèi)釋放出小分子多肽分散到溶液中，增加復(fù)合物的溶解性，乳化性隨之增加。而隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)生的能量不能使這些小分子分散，分子間出現(xiàn)聚集，乳化能力下降。

將測(cè)定乳化性后的溶液靜置30 min，在波長(zhǎng)500 nm 處測(cè)定其吸光度。根據(jù)圖2，超聲處理時(shí)間對(duì)復(fù)合物的乳化穩(wěn)定性影響較大，可能是由于超聲處理使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得疏松，有利于吸附在水-油界面。超聲處理使復(fù)合物的乳化穩(wěn)定性有一定提高。

圖1 不同比例黑豆分離蛋白-可溶性多糖復(fù)合物的EAI 和ESIFig.1 EAI and ESI of different black soybean protein and soluble polysaccharide complexes

圖2 不同超聲處理時(shí)間的黑豆蛋白-可溶性多糖復(fù)合物的EAI 和ESIFig.2 EAI and ESI of different ultrasonication-treated time of black soybean protein and soluble polysaccharide complexes

2.2.2 起泡性質(zhì)的變化 復(fù)合物經(jīng)高速攪拌后，大量的氣體進(jìn)入溶液中形成水-空氣界面，溶液表面張力降低后形成泡沫的能力即此復(fù)合體系的起泡性[14]。起泡性的變化與其溶液中蛋白結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)的變化有關(guān)。超聲處理有助于將蛋白質(zhì)分子解聚成小分子亞基，同時(shí)暴露了蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)，增加了氣-水界面蛋白分子數(shù)目和與磷脂疏水結(jié)合的程度，從而不同程度地提高了起泡能力[15]。分析圖3，隨著超聲處理時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)打開更完全，分子間重新聚集形成更大的聚集體，表現(xiàn)為溶液表面膜的穩(wěn)定性下降，從而起泡能力下降[16]。

分別取不同處理時(shí)間的混合溶液2 mL，加入8 mL pH 8.05 的0.05 mol/L Tris-HCL 緩沖液。室溫下用高速分散機(jī)均質(zhì)1 min，快速將溶液轉(zhuǎn)移至25 mL 量筒中，每隔30 min 記錄泡沫的體積。計(jì)算復(fù)合液的起泡性。分析圖4，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，泡沫穩(wěn)定性均有所下降。

圖3 不同超聲處理時(shí)間的黑豆蛋白-可溶性多糖復(fù)合物的FCFig.3 FC of different ultrasonication-treated time of black soybean protein and soluble polysaccharide complexes

圖4 不同超聲處理時(shí)間的黑豆蛋白-可溶性多糖復(fù)合物的FSFig.4 FS of different ultrasonication-treated time of black soybean protein and soluble polysaccharide complexes

2.3 復(fù)合物的熒光分析

熒光光譜是一種可以反映蛋白質(zhì)3 級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化的靈敏且有效的方法。λmax大于280 nm。蛋白質(zhì)在多糖和超聲的雙重作用下構(gòu)象發(fā)生改變。高強(qiáng)度超聲波處理后蛋白質(zhì)分子發(fā)生一定的聚集，形成不溶性的蛋白質(zhì)，并且隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)分子解聚成新的大分子物質(zhì)[17]，與可溶性多糖間的作用減弱。與此同時(shí)，多肽鏈及氨基酸殘基變化幅度較小，說明超聲對(duì)黑豆蛋白-可溶性多糖復(fù)合物之間的作用影響較小，而發(fā)色基團(tuán)暴露在蛋白質(zhì)聚集體外側(cè)使其熒光性又有一定程度的升高。

圖5 不同超聲處理時(shí)間的大豆分離蛋白-可溶性多糖復(fù)合物的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectrum of different ultrasonication-treated time of soybean protein isolate and soluble polysaccharide complexes

2.4 圓二光譜分析

圓二光譜顯示超聲處理對(duì)黑豆蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。利用CD Pro 擬合軟件對(duì)圖譜進(jìn)行分析計(jì)算，得到黑豆蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況，見表1。當(dāng)超聲功率為400 W 時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，黑豆蛋白中的α-螺旋含量上升，β-折疊下降，24 min 時(shí)變化較為明顯，這可能是功能性質(zhì)差異的原因。二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化與Chandrapala 等[18]的研究結(jié)果相同。由于蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由氨基酸序列及其相互作用決定，上述結(jié)果可能表明超聲處理破壞分子間相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)柔性結(jié)構(gòu)的變化。與此同時(shí)Hu 等[19]在研究中發(fā)現(xiàn)不僅超聲時(shí)間對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響較大，在不同超聲功率下蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化也存在差異。

表1 超聲處理后黑豆蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化Table1 Secondary structural content of native and ultrasonication-treated black soybean protein estimated from circular dichroism spectra in the far-UV region

3 結(jié)論

采用超聲波處理的方法探究一定的超聲功率下不同超聲時(shí)間對(duì)黑豆蛋白與多糖復(fù)合物的功能性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)論如下：1）將黑豆蛋白與可溶性多糖以1∶3 的比例復(fù)合時(shí)，復(fù)合物中蛋白的溶解性最好；2）當(dāng)?shù)鞍着c多糖以1∶2 的比例復(fù)合時(shí)，復(fù)合物的乳化性和乳化穩(wěn)定性最好；3）超聲處理復(fù)合物時(shí)，處理時(shí)間為16 min 的混合液的乳化性最好，處理時(shí)間為8 min 的復(fù)合物的乳化穩(wěn)定性最好，而處理時(shí)間為24 min 的復(fù)合物的乳化穩(wěn)定性最差；4）隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量上升，β-折疊下降，導(dǎo)致柔性區(qū)間變化，說明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)密切相關(guān)。