邸鵬月 彭 宇 李 晨，2 盧海強，2 谷新晰，2 田洪濤，2，3*

（1 河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院 河北保定071001 2 河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心 河北保定071001 3 國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心 河北保定071001）

桑葚被稱為“21 世紀最佳保健果品”，富含多種營養(yǎng)成分和豐富的黃酮類及多酚物質(zhì)，具有提高人體免疫力，清除體內(nèi)有害自由基及促進糖類脂肪蛋白代謝等重要作用[1-2]。2017年中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會發(fā)布的《食用植物酵素》標準中定義：食用植物酵素（Edible plant Source Jiaosu）以植物為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分（多糖類、寡糖類、蛋白質(zhì)及多肽、氨基酸類、維生素類等）、可食用的酵素產(chǎn)品[3]。研究表明該類產(chǎn)品具有延緩衰老，抑菌消炎，清潔血液，提高機體免疫能力及解毒抗癌多種功效[4]。研制開發(fā)桑葚酵素具有廣闊前景。

我國現(xiàn)有的食用酵素大多延續(xù)傳統(tǒng)發(fā)酵方法——自然發(fā)酵工藝制成，此類制作方法不僅受限于發(fā)酵季節(jié)，而且發(fā)酵周期冗長，發(fā)酵菌種更是繁多混雜，造成發(fā)酵環(huán)境的不穩(wěn)定性，同時發(fā)酵產(chǎn)品的安全質(zhì)量也難以控制。實現(xiàn)食用酵素生產(chǎn)由自然發(fā)酵到接種發(fā)酵的技術(shù)飛躍，勢在必行。探究自然發(fā)酵食用酵素微生物多樣性與菌群變化規(guī)律，是篩選食用酵素，接種發(fā)酵優(yōu)良優(yōu)勢微生物菌種的基礎(chǔ)課題與首要任務(wù)。目前，對自然發(fā)酵食用酵素微生物多樣性與菌群變化規(guī)律的研究，大多采用分離純化法、PCR-DGGE 法等。隨著分子生物學的飛速發(fā)展，宏基因組學被用于分析自然發(fā)酵過程中微生物群落動態(tài)變化規(guī)律。宏基因組學是專門研究直接從樣品中提取基因組DNA 后進行測序分析，能夠準確揭示微生物群落多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系、功能活性及環(huán)境之間的相互協(xié)作關(guān)系，極大地促進和擴展了微生物學的研究范圍。例如，王海英[5]采用高通量測序分析技術(shù)對自然發(fā)酵方式制備的番木瓜酵素微生物的群落組成及多樣性進行測序分析，為有效調(diào)控發(fā)酵過程中微生物菌群提供了方向。然而，利用宏基因組學研究桑椹酵素自然發(fā)酵微生物多樣性及菌群變化規(guī)律，鮮有報道。

本研究以不同時期自然發(fā)酵的桑葚酵素為樣本，采用宏基因組學技術(shù)探究樣品中微生物的多樣性及群落動態(tài)變化，對進一步篩選桑葚酵素自然發(fā)酵優(yōu)勢微生物菌種，研制高效發(fā)酵劑，實現(xiàn)人工控制發(fā)酵桑葚酵素系列新產(chǎn)品，提高桑葚酵素產(chǎn)品生產(chǎn)效率與質(zhì)量安全水平提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料 新鮮成熟桑葚，河北省石家莊市靈壽縣海燕農(nóng)牧公司提供；白砂糖、娃哈哈純凈水、玻璃罐，購自百樂超市。

1.1.2 培養(yǎng)基 乳酸菌選擇培養(yǎng)基[6]、醋酸菌選擇培養(yǎng)基[7]、酵母菌選擇培養(yǎng)基[8]。

1.1.3 主要試劑及設(shè)備 試劑：牛肉浸膏、酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、吐溫、瓊脂等，溶菌酶、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、DNA mark，萬科公司；PCR引物，華大基因合成。所有試劑均為分析純級。

設(shè)備：FLC-3 超凈臺，哈爾濱市東聯(lián)公司；SPX-150B-Z 型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司；XSZ-G 型顯微鏡，重慶光電儀器有限公司；TGL16M 型離心機，長沙市易達科貿(mào)公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備 摘除桑葚中的枝葉和雜物，用無菌水沖洗桑葚表面，在超凈工作臺中晾干，按桑葚∶白砂糖質(zhì)量比1∶1 混勻，放入滅菌的發(fā)酵玻璃罐中，置于暗處，室溫發(fā)酵66 d[9]。

1.2.2 樣品采集 在超凈工作臺中取桑葚酵素發(fā)酵前期（18 d）、中期（42 d）、后期（60 d）的樣品45 mL 于已滅菌的離心管中，用于宏基因組研究。

1.2.3 樣品測序流程 基因組DNA 抽提→PCR擴增及產(chǎn)物純化→熒光定量→Illumina PE 文庫制備→Illumina 高通量測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 本試驗數(shù)據(jù)通過上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司多樣性測序及分析平臺完成。利用Trimmomatic 對原始數(shù)據(jù)進行篩選，用flash軟件拼接完成。將通過OTU 聚類得到的代表序列采用Usearch 選出相似性在97%以上的序列，制得OTU 表格。

運用貝葉斯算法將97%相似水平的OTU 代表物種進行物種組成統(tǒng)計分析。通過繪制稀釋性曲線、Shannon-Wiener 曲線及各微生物動態(tài)變化指數(shù)分析各樣品細菌和真菌多樣性及群落豐度變化[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚酵素樣品的高通量測序數(shù)據(jù)

對原始數(shù)據(jù)進行篩選得出優(yōu)化序列，以保證分析結(jié)果的質(zhì)量。在去除嵌合體序列后進行OTU聚類分析，對OTU 的代表序列作分類學分析。桑葚酵素不同時期樣品的高通量測序結(jié)果見圖1、圖2、表1。

桑葚酵素樣品在97%的相似水平下經(jīng)序列優(yōu)化統(tǒng)計，表1、圖1可見獲得細菌的序列數(shù)在30 000～43 000 范圍，序列長度大部分分布在441～460 bp，OUT 數(shù)在40～80 范圍。表1、圖2可見獲得真菌的序列數(shù)在37 000～42 000 范圍，序列長度主要分布在381～400 bp 和401～420 bp 范圍，OUT 數(shù)在10～20 范圍。以上表明隨著發(fā)酵的進行，細菌的序列數(shù)和OUT 數(shù)逐漸增加，真菌序列數(shù)和OUT 數(shù)則減少；細菌的多樣性隨發(fā)酵的進行而增加，真菌的多樣性則逐漸降低，整個發(fā)酵過程中細菌的多樣性明顯優(yōu)于真菌。

圖1 優(yōu)化后的細菌序列長度分布圖Fig.1 The length distribution of the optimized bacterial sequence

圖2 優(yōu)化后的真菌序列長度分布圖Fig.2 The length distribution chart of the optimized fungi sequence

表1 3 個樣品的高通量測序數(shù)據(jù)Table1 High-throughput sequencing data of 3 samples

2.2 稀釋性曲線

稀釋性曲線是從樣本中隨機抽取一定數(shù)量的個體，統(tǒng)計這些個體所代表的物種數(shù)目，并以個體數(shù)與物種數(shù)來構(gòu)建曲線[11]。稀釋曲線不僅可以反映不同樣本中物種豐富度，也可以說明測序數(shù)據(jù)的合理性。當曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU，反之表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。通過作稀釋性曲線可得出樣品的測序深度情況。桑葚酵素不同時期樣品的稀釋曲線見圖3、圖4。

圖3 3 個樣品中細菌的稀釋曲線Fig.3 The dilution curve of bacteria in 3 samples

圖4 3 個樣品中真菌的稀釋曲線Fig.4 The dilution curve of fungi in 3 samples

在使用97%相似度的OUT 水平上，隨著3 個樣品測序深度的增加，圖3和圖4顯示細菌和真菌OUT 的數(shù)量增加并呈現(xiàn)倒“J”型曲線，斜率先快速增加后逐漸減小，最終趨于平緩，即細菌和真菌含有的OTU 組數(shù)先迅速增加，然后趨于平緩，最終保持穩(wěn)定，表明在此測序深度能較準確反映桑葚酵素前、中、后3 個時期樣品中微生物的豐富度和多樣性。

2.3 Shannon-Wiener 曲線

反映樣本中微生物多樣性的指數(shù)，利用各樣本的測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此反映各樣本在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性[12]。曲線越平緩，說明測序數(shù)量越多，越能有效反映樣本中大多數(shù)微生物信息。桑葚酵素不同時期樣品的Shannon-Wiener 試驗結(jié)果見圖5、圖6。

Shannon 指數(shù)計算公式：

式中，Sobs——實際測量出的OUT 數(shù)目；ni——含有i 條序列的OUT 數(shù)目；N——所有的序列數(shù)。

由圖5、圖6可看出，在97%相似度水平上，起初曲線直線上升是由于3 個樣品對細菌和真菌的測序條數(shù)遠不足覆蓋樣品所致。隨著3 個樣品測序量的增加，數(shù)值增大，直至平緩，表明測序接近飽和，增加序列無法發(fā)現(xiàn)更多OUT，可以分別反映桑葚酵素前、中、后期樣本中絕大部分的微生物信息。

圖5 3 個樣品中細菌的Shannon-Wiener 曲線Fig.5 The Shannon-wiener curve of bacteria in 3 samples

圖6 3 個樣品中真菌的Shannon-Wiener 曲線Fig.6 The Shannon-wiener curve of fungi in 3 samples

2.4 桑葚酵素發(fā)酵不同時期樣品的微生物多樣性分析

在OTU 聚類結(jié)果中，對單樣品進行Alpha 多樣性分析，可估算環(huán)境群落物種的豐度和多樣性。分別用chao，ace 和simpson，shannon 表示菌群豐度指數(shù)和菌群多樣性指數(shù)。統(tǒng)計結(jié)果見表2和表3。shannon 和simpson 可估計微生物多樣性，shannon 值越大，群落多樣性越高，而simpson 值越大，群落多樣性越低[13]。

表2 細菌多樣性指數(shù)Table2 Bacterial diversity indices

表3 真菌多樣性指數(shù)Table3 Fungi diversity index

Coverage 表示各樣本文庫的覆蓋率，Coverage值越高，樣本中序列被測出的可能性越大。由表2看出，桑葚酵素前、中、后期樣品中，細菌豐度指數(shù)Chao 值和Ace 值逐漸增加，樣品中OTU 數(shù)目也隨之增加，表明隨者發(fā)酵的進行，桑葚酵素中細菌的物種總數(shù)增加，整個發(fā)酵環(huán)境適合細菌的生長于繁殖。Shannon 值先降低后增加，Simpon 值先上升后降低，表明隨著桑葚酵素發(fā)酵的進行，細菌多樣性在發(fā)酵前期最高，之后降低再升高，呈波動狀態(tài)，推測受發(fā)酵環(huán)境pH 值的影響，發(fā)酵前期乳酸菌快速繁殖，產(chǎn)酸量增加，pH 值減小，抑制一些細菌的生長，導致細菌多樣性降低。隨后，發(fā)酵過程中微生物利用氨基酸或水解蛋白質(zhì)，導致pH 值小幅上升并趨于平穩(wěn)。

由表3真菌多樣性指數(shù)可看出桑葚酵素不同時期樣品中，Chao 值逐漸降低，表明真菌物種總數(shù)在發(fā)酵過程中逐漸減少。Ace 值表明，OTU 數(shù)目先降低后有小幅增加，可能是受pH 值波動的影響。Shannon 值不斷減少，而Simpson 值不斷增加，表明真菌多樣性隨著桑葚酵素發(fā)酵的進行逐漸降低。綜合來看，細菌豐度指數(shù)Chao 值、Ace 值和多樣性指數(shù)Shannon 值均比真菌高，Simpon 值比真菌低，也說明桑葚酵素發(fā)酵各時期細菌多樣性比真菌多樣性復雜。

2.5 桑葚酵素發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化

采用統(tǒng)計學方法分析單個樣品及多個樣品在不同分類水平上的群落變化情況。本試驗在屬的水平上分析桑葚酵素不同時期樣品微生物群落結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化，結(jié)果見圖7、圖8。

由圖7可知，在屬水平上，桑葚酵素發(fā)酵過程中細菌主要有乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）等。桑葚酵素前、中、后期3 個樣品中乳桿菌屬所占比例最大，趨勢為先降低后升高，占比分別為80.19%，90.02%，85.72%，由此可判斷乳桿菌屬在發(fā)酵過程中為優(yōu)勢菌。其次，魏斯氏菌（前、中、后期占比分別為6.37%，2.01%，2.45%）和明串珠菌（前、中、后期占比分別為2.69%，0.81%，1.79%）所占比例先減少后有小幅度增加，而片球菌屬所占比例逐漸減少（前、中、后期占比分別為3.81%，1.47%，0.84%）。以上數(shù)據(jù)表明魏斯氏菌屬、片球菌屬和明串珠菌屬主要作用于發(fā)酵前期，隨著發(fā)酵的進行，環(huán)境pH 逐漸降低抑制其生長，其含量大幅減少，后期有小幅上升，可能是因pH 值波動所致。此外，呈現(xiàn)增長趨勢的菌屬有乳球菌屬（前、中、后期占比分別為0.44%，0.62%，1.33%）和葡萄糖酸桿菌屬（Gluconobacter）（前、中、后期占比分別為0.19%，0.18%，0.52%），醋酸桿菌屬（Acetobacter）（分別為0.46%，0.33%，0.36%）在整個發(fā)酵時期稍有降低，較穩(wěn)定存在。此外，還有一些致病菌以及一些尚未分類明確的細菌，它們所占的比例小，隨著發(fā)酵的進行，生長環(huán)境處于劣勢，其中致病菌大部分呈逐漸消亡的趨勢。在發(fā)酵前期乳桿菌屬最多，明串珠菌屬經(jīng)異型乳酸發(fā)酵，代謝產(chǎn)物除乳酸外還有乙醇、乙酸、甘露醇等，這些物質(zhì)與有機酸結(jié)合，對形成酵素特有風味起決定性作用[14]。發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH 值下降使得對酸敏感的明串珠菌屬繁殖受到阻礙甚至凋亡，而片球菌屬、魏斯氏菌屬細菌耐酸性強，逐漸取代明串珠菌屬成為優(yōu)勢菌屬。在乳桿菌屬細菌發(fā)酵作用下，發(fā)酵環(huán)境酸度增加，產(chǎn)生的細菌素等可有利于一些雜菌的生存。乳桿菌通過同型發(fā)酵對酸性環(huán)境有較強的耐受力，存在于整個發(fā)酵過程。至于其它的菌，如醋酸桿菌穩(wěn)定存在；葡萄糖酸桿菌自發(fā)富集，在發(fā)酵后期增加到0.52%；醋酸菌大量繁殖，可利用由酵母菌代謝生成的乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸，作為一種基礎(chǔ)分為物質(zhì)，對產(chǎn)品風味形成有一定的作用。鑒于醋酸菌在醋酸發(fā)酵階段具有重要的功能，推測桑葚酵素發(fā)酵過程中很可能存在醋酸發(fā)酵階段。

由圖8可知，在屬水平上，桑葚酵素發(fā)酵過程中真菌主要為未分類酵母（Saccharomycetales）、漢遜酵母（Hanseniaspora）。漢遜酵母（前、中、后期占比分別為41.4%，0.53%，0.08%）在發(fā)酵前期最多，中、后期急劇下降，表明漢遜酵母在桑葚酵素發(fā)酵前期是優(yōu)勢真菌并發(fā)揮重要作用。除此之外，還有少量覆膜酵母（Galactomyces）（前、中、后期分別為0.14%，0，0）、分子孢子菌屬（Cladosporium）（前、中、后期分別為3.55%，0.08%，0.01%）和旋孢腔菌屬（Cochliobolus）（前、中、后期分別為1.31%，0.33%，0.01%）等病原菌，隨著發(fā)酵的進行，它們逐漸減少或死亡。同樣，在發(fā)酵前期有酵母菌目和酵母科中尚未明確的種類在發(fā)酵前期占較高，隨著發(fā)酵的進行，它們逐漸減少甚至消亡。在發(fā)酵中、后期出現(xiàn)大量未知的真菌且發(fā)酵終止時還有。發(fā)酵過程中，酵母作為兼性厭氧菌可利用的糖轉(zhuǎn)化為酒精和二氧化碳。微生物發(fā)酵過程是一個復雜的過程，菌株種類多，許多病原菌可能受環(huán)境中高糖、酸度增加或者乙醇等有機物的影響而逐漸死亡。本試驗中桑葚酵素在高糖、高滲的環(huán)境，相對于很多微生物來說，本身環(huán)境惡劣，而酵母易分離于高糖環(huán)境中，在發(fā)酵初期酵母屬是真菌的優(yōu)勢菌群，之后隨著環(huán)境的變化或不同微生物間的相互作用，有未知真菌占有很大的比例。本試驗結(jié)果也反映出被人類探索出來的菌株資源有限，仍有豐富的資源及新的物種等待人們的探索和發(fā)現(xiàn)。

由以上數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)：桑葚酵素發(fā)酵過程中微生物很豐富。根據(jù)細菌和真菌種類及數(shù)量的變化，可以推測桑葚酵素發(fā)酵過程中分為不同的階段。發(fā)酵前期酵母菌啟動發(fā)酵，分解環(huán)境中的可利用的糖產(chǎn)生乙醇和二氧化碳，產(chǎn)生的乙醇由醋酸菌利用生成醋酸，而乳酸菌發(fā)酵始終貫穿于整個發(fā)酵時期。不同發(fā)酵階段發(fā)生著復雜的生化反應(yīng)及微生物間的相互作用，也因此賦予桑葚酵素獨特的風味和口感。

圖7 3 個樣品在屬的水平上細菌組成Fig.7 The bacterial composition of 3 samples at the genus level

圖8 3 個樣品在屬的水平上真菌組成Fig.8 The fungi composition of 3 samples at genus level

3 結(jié)論

通過分析生物多樣性指數(shù)獲得桑葚酵素發(fā)酵過程中細菌較真菌豐富。桑葚酵素發(fā)酵過程中的優(yōu)勢細菌是乳桿菌。優(yōu)勢真菌變化較大，在發(fā)酵前期是酵母，同時存在大量未知真菌。

4 討論

宏基因組學研究的對象是特定環(huán)境中的總DNA，對認識和利用95%以上的未培養(yǎng)微生物提供了一條新的途徑。通過高通量測定微生物基因組上的16S rRNA 基因進行生物多樣性分析，能夠提供更大的信息量，便于研究環(huán)境中物種的組成多樣性，然而多樣性分析對全面研究環(huán)境中的基因功能還有欠缺[15]。新一代高通量低成本測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用使多樣性的研究更加便利。

基于現(xiàn)今市場對食用植物酵素質(zhì)量安全性的迫切需要和宏基因組學測序技術(shù)的先進性，本文利用宏基因組學方法對桑葚酵素不同發(fā)酵時期樣品進行微生物多樣性分析，得出細菌生物多樣性大于真菌生物多樣性。在屬水平對微生物的多樣性進行分析，主要的優(yōu)勢菌群為乳桿菌屬和酵母屬。隨著發(fā)酵的進行，乳桿菌屬占比最高并穩(wěn)定存在，魏斯氏菌和明串珠菌先減少后有小幅增加；片球菌逐漸減少；漢遜酵母在發(fā)酵前期最多，之后急劇下降。綜合來看這些菌屬都在發(fā)酵前期發(fā)揮重要作用，其中乳桿菌能夠利用桑葚發(fā)酵液中的糖進行發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，說明在桑葚酵素風味形成中乳酸菌可能起重要作用。隨著發(fā)酵進行，葡萄糖酸桿菌自發(fā)富集，因存在醋酸菌，故將前期酵母發(fā)酵產(chǎn)生的酒精轉(zhuǎn)化為乙酸，產(chǎn)生基礎(chǔ)風味物質(zhì)。桑葚酵素發(fā)酵過程中不同發(fā)酵階段的菌種演替、其它菌株的相互作用機理及某些菌株在發(fā)酵過程中的作用還有待深入研究。