樓汪洲洋，許杰，戚璐，徐俊，程良斌

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢）

0 引言

活血化濕湯是河南省中醫(yī)院劉高仁、肖亞珍醫(yī)師自擬方藥，經(jīng)臨床實(shí)際試用，活血化濕湯治療晚期肝癌黃疸收到良好效果，但其對肝癌本身是否也具有抗癌效果以及潛在作用機(jī)制并無相關(guān)數(shù)據(jù)，故筆者通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)工具對活血化濕湯治療肝癌的潛在機(jī)制進(jìn)行分析探討，尋找活血化濕湯可能的治療肝癌的途徑。

中藥組方是多組分、多靶點(diǎn)及其組分間協(xié)同作用的復(fù)雜體系,因其主要成分復(fù)雜, 作用途徑較多, 使得中藥的深入研究極為困難, 而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)的思想, 被應(yīng)用到生命科學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域, 如新藥靶的識別、先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)、作用機(jī)制的研究、物質(zhì)基礎(chǔ)的篩選等, 為復(fù)雜中藥系統(tǒng)的研究提供了新的思路和視角[1]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于“藥物-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò), 其研究策略的整體性、系統(tǒng)性特點(diǎn)與中醫(yī)學(xué)從整體觀念、辨證論治的角度去診治疾病的理論，中藥及其方劑的多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的原理不謀而合[2]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法, 對活血化濕湯主要功效物質(zhì)以及配伍機(jī)制進(jìn)行研究，為活血化濕湯治療肝癌作用機(jī)制的科學(xué)內(nèi)涵提供參考。

1 材料與方法

1.1 活血化濕湯的化學(xué)成分

本文通過查詢BATMAN（http://bionet.ncpsb.org/batmantcm/），以Score＞20 分，P＜0.05 作為搜索條件，檢索活血化濕湯全方組成藥物黨參、茵陳、赤芍、梔子、大黃、益母草、澤蘭、紅花、茯苓、白術(shù)、赤小豆、白茅根、玉米須的所有化學(xué)成分和相應(yīng)靶蛋白，去除重復(fù)化合物和蛋白，共收集203 種化合物和2012 個(gè)靶蛋白。

1.2 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將收集的化合物與其靶點(diǎn)蛋白上傳至Cytoscape 3.7.1 軟件，生成一個(gè)體現(xiàn)藥物靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖, 以探究活血化濕湯的藥理學(xué)作用機(jī)制。

1.3 疾病靶點(diǎn)的確定

通過DisGeNET，OMIM，genecards，HPO 檢索并刪除重復(fù)項(xiàng)，篩出1111 個(gè)肝癌相關(guān)的靶點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 (PPI) 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和GO、KEGG 等途徑富集分析

將活血化濕湯與肝癌靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行映射篩選，得到302 個(gè)活血化濕湯-肝癌相關(guān)靶點(diǎn)蛋白，導(dǎo)入STRING（https://string-db.org/）進(jìn)行多種蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)分析，獲取蛋白的相互作用以及蛋白作用途徑的分類富集分析。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選

通 過 查 詢BATMAN（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/），設(shè)置搜索篩選條件Score＞20 分，P＜0.05，分次輸入活血化濕湯全方組成藥物黨參、茵陳、赤芍、梔子、大黃、益母草、澤蘭、紅花、茯苓、白術(shù)、赤小豆、白茅根、玉米須進(jìn)行查詢，獲取各個(gè)中藥符合Score＞20 的化學(xué)成分和相應(yīng)靶蛋白，分別為黨參化學(xué)成分71 個(gè)，蛋白1260 個(gè)；茵陳化學(xué)成分19 個(gè)，蛋白910 個(gè)；赤芍化學(xué)成分9個(gè)，蛋白56 個(gè)；梔子化學(xué)成分14 個(gè)，蛋白665 個(gè)；大黃化學(xué)成分30 個(gè)，蛋白936 個(gè)；益母草化學(xué)成分9 個(gè)，蛋白690 個(gè)；澤蘭化學(xué)成分4 個(gè)，蛋白216 個(gè)；紅花化學(xué)成分22 個(gè)，蛋白525 個(gè)；茯苓化學(xué)成分18 個(gè)，蛋白525 個(gè)；白術(shù)化學(xué)成分5 個(gè)，蛋白56 個(gè)；赤小豆化學(xué)成分3 個(gè)，蛋白416 個(gè)；白茅根化學(xué)成分7 個(gè)，化學(xué)成分53個(gè)；玉米須化學(xué)成分4 個(gè)，蛋白258 個(gè)，化學(xué)成分合計(jì)215 個(gè)，運(yùn)用EXCEL 合并篩選去除重復(fù)成分和蛋白，共收集203 種化學(xué)成分和2012 個(gè)靶蛋白（其中有12 個(gè)化學(xué)成分重復(fù)）。

2.2 活血化濕湯化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將收集整理的化合物與其靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入至Cytoscape 3.7.1 軟件，生成一個(gè)體現(xiàn)藥物-靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）, 以探究活血化濕湯本身的藥理學(xué)作用機(jī)制。

圖1 活血化濕湯藥物成分與靶蛋白對應(yīng)關(guān)系（左側(cè)藥物成分，右側(cè)靶蛋白，由內(nèi)向外按Drgaee 大小分布，越接近圈中心，該藥物/蛋白所對應(yīng)的蛋白/藥物數(shù)越多）

2.2.1 活血化濕湯藥物成分見圖2，詳細(xì)成分見表2-1。

其中對應(yīng)蛋白數(shù)大于100 的化學(xué)成分，見圖3。

圖2 活血化濕湯藥物成分

圖3 活血化濕湯中對應(yīng)蛋白數(shù)大于100 的化學(xué)成分

表3 -1 活血化濕湯中對應(yīng)蛋白數(shù)大于100 的化學(xué)成分

表2 -1 活血化濕湯藥物成分表

續(xù)表2-1 活血化濕湯藥物成分表

2.2.2 活血化濕湯靶蛋白見圖4，主要靶蛋白見圖5，表5-1

圖4 活血化濕湯靶蛋白

圖5 主要靶蛋白（蛋白對應(yīng)化學(xué)成分?jǐn)?shù)大于等于20）

2.3 肝癌疾病靶點(diǎn)蛋白的獲得

將 Adult Hepatocellular Carcinoma、Childhood Hepatocellular Carcinoma、Early Hepatocellular Carcinoma、Fibrolamellar Hepatocellular Carcinoma、Hepatitis B Virus-Related Hepatocellular Carcinoma、Hepatocellular Carcinoma、Hepatoblastoma、Hepatocellular adenoma、Neoplasm of the liver 分別輸入DisGeNET，OMIM，genecards，HPO 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，其中DisGeNET 以得分大于0.01 為標(biāo)準(zhǔn)獲取蛋白153 個(gè)，Genecards以得分大于10 為標(biāo)準(zhǔn)獲取蛋白918 個(gè)，HPO 獲取蛋白86 個(gè)，OMIM 獲取蛋白105 個(gè)，將獲取的以上蛋白匯總并刪除重復(fù)項(xiàng)，篩出1111 個(gè)肝癌相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白。

2.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 (PPI) 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和GO、KEGG 等途徑富集分析

將上述獲取的肝癌靶蛋白與活血化濕湯靶蛋白進(jìn)行映射，獲得活血化濕湯-肝癌關(guān)聯(lián)靶蛋白302 個(gè)，具體蛋白如表6-1：

2.4.1 將表6-1 中302 個(gè)活血化濕湯-肝癌關(guān)聯(lián)靶蛋白上傳STRING 網(wǎng)站，設(shè)定為置信度＞0.9,隱藏?cái)嚅_的節(jié)點(diǎn)，進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)關(guān)系分析和GO、KEGG 等途徑富集分析，獲得276 個(gè)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)及富集分析結(jié)果，蛋白質(zhì)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)見圖6。

表5 -1 主要靶蛋白（蛋白對應(yīng)化學(xué)成分?jǐn)?shù)大于等于20）

表6 -1 活血化濕湯-肝癌關(guān)聯(lián)靶蛋白

將蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)關(guān)系下載并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件，構(gòu)建PPI 蛋白質(zhì)關(guān)系分析網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用Cytoscape 的NetworkAnalyzer功能進(jìn)行分析，以Dagree（度中心性）大小為蛋白質(zhì)重要性評判標(biāo)準(zhǔn)，Dagree 越大，證明該蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)越緊密，參與治療肝癌的重要性就越大。

圖6 活血化濕湯-肝癌關(guān)聯(lián)靶蛋白STRING 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)分析

圖7 276 個(gè)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

結(jié)合圖7 和查閱上表7-1，我們可以得知，關(guān)聯(lián)度最重要的TOP10 蛋 白 依 次 是STAT3、TP53、PIK3CA、MAPK1、PIK3R1、AKT1、EP300、MAPK3、JUN、CREBBP，意味著以上蛋白可能涉及活血化濕湯用于治療肝癌。

2.4.2 活血化濕湯-肝癌關(guān)聯(lián)蛋白的GO、KEGG 等途徑富集分析

STRING 網(wǎng)站有GO、KEGG 等途徑富集分析功能，對276 個(gè)蛋白的富集分析見表8。

3 總結(jié)

3.1 通過以上圖表結(jié)合實(shí)際綜合分析，活血化濕湯能用于治療肝癌的主要KEGG 途徑可能是癌癥通路、PI3K-Akt 信號通路、癌癥糖蛋白、人類乳頭瘤病毒感染、MAPK 信號通路、乙型肝炎通路、癌癥小分子RNA、HTLV-I 感染途徑、肝細(xì)胞癌通路、FoxO 信號通路、Ras 信號通路、HIF-1 信號通路等途徑。

3.2 其涉及的生物過程主要與細(xì)胞過程、生物調(diào)節(jié)、刺激反應(yīng)、代謝過程、有機(jī)物質(zhì)代謝過程、生物過程調(diào)節(jié)、細(xì)胞代謝過程、細(xì)胞過程調(diào)節(jié)、初級代謝過程、化學(xué)反應(yīng)、細(xì)胞對刺激的反應(yīng)、氮化合物代謝過程、多細(xì)胞組織過程、生物過程的正規(guī)律、代謝過程調(diào)節(jié)、細(xì)胞過程的正調(diào)節(jié)、發(fā)展過程、細(xì)胞代謝過程調(diào)節(jié)、原發(fā)性代謝過程調(diào)節(jié)等過程密切相關(guān)。

表7 -1 276 個(gè)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)關(guān)系大小

續(xù)表7-1 276 個(gè)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)關(guān)系大小

表8 關(guān)聯(lián)蛋白KEGG 途徑（TOP50）

表9 關(guān)聯(lián)蛋白生物過程（TOP50）

表10 關(guān)聯(lián)蛋白分子功能(TOP50)

表11 核心蛋白結(jié)構(gòu)域分析

3.3 對分子功能的影響主要在蛋白質(zhì)結(jié)合、離子結(jié)合、有機(jī)循環(huán)復(fù)合結(jié)合、催化活性、雜環(huán)復(fù)合結(jié)合、酶結(jié)合、陽離子結(jié)合、金屬離子結(jié)合、信號受體結(jié)合相同蛋白結(jié)合、陰離子結(jié)合、小分子結(jié)合、藥物結(jié)合、分子調(diào)節(jié)、核苷酸結(jié)合、蛋白質(zhì)二聚作用、碳水化合物衍生物、轉(zhuǎn)移酶活性、核酸結(jié)合、作用于DNA 結(jié)合蛋白質(zhì)、核糖核苷酸結(jié)合催化活性，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器活動、嘌呤核苷酸結(jié)合、嘌呤核糖核酸、嘌呤核糖核酸、腺酰核苷酸結(jié)合、腺基核糖核苷酸結(jié)合、ATP 結(jié)合、含蛋白質(zhì)的復(fù)雜裝訂、蛋白質(zhì)均聚化活動、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、分子換能器活動、過渡金屬離子結(jié)合等方面。

3.4 作用的主要核心蛋白域家族：蛋白激酶域、核激素受體類域超家族、酪氨酸蛋白激酶催化域、Serine / threon 蛋白激酶、細(xì)胞色素P450 超家族、AAA + atp 酶域、agc -激酶、BLC2 家族、TGF-β 蛋白、ABC 跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族等。

4 討論

活血化濕湯全方充分體現(xiàn)了大積大聚，必須大破方能大立，其對傷肝久積成疾之巨塊型肝癌以攻為主，寓補(bǔ)于攻的思想。積無除，病不解，不搜而逐之，日進(jìn)補(bǔ)湯無益也。也應(yīng)注意攻邪而不傷正，養(yǎng)正而不助邪[3]。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析，活血化濕湯其治療肝癌的潛在通路除了癌癥通路外，首當(dāng)其沖的就是PI3K-Akt 信號通路。目前醫(yī)學(xué)界通過對肝癌患者癌組織以及肝癌細(xì)胞株內(nèi)存在多條信號通路過度活化的研究中，我們可以發(fā)現(xiàn)PI3 K/Akt 信號通路是細(xì)胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)一個(gè)重要紐帶，在細(xì)胞抗凋亡、增殖、分化以及侵襲轉(zhuǎn)移中起到至關(guān)重要作用[4]。另外MAPK 信號通路抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[5]， PI3K/AKT/FOXO4 信號軸影響HCC 的增殖能力與凋亡能力,在HCC 的發(fā)病和進(jìn)展中起著非常重要的作用，[6]影響Ras 信號通路激活Myc 表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)周期進(jìn)程[7]。對HIF-1 信號通路可通過抑制HIF-1α 影響癌細(xì)胞的能量代謝,進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的目的[8-10]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)層面，基于中藥藥理學(xué)BATMAN數(shù)據(jù)庫平臺的活血化濕湯有效成分及體內(nèi)預(yù)測靶標(biāo)理論化揭示了活血化濕湯對肝癌的作用機(jī)制，為活血化濕湯及相關(guān)藥物的新藥研發(fā)和機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。