于永杰，顏寅萍，王旭，吳俊珠

（云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（大理大學(xué)）,大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理）

0 引言

美洲大蠊為節(jié)肢動(dòng)物門昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，民間俗稱“蟑螂”，入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]。美洲大蠊提取物中所含的化學(xué)成分主要有尿嘧啶等核苷類、氨基酸類、多糖類、多肽等[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，美洲大蠊提取物具有促進(jìn)組織修復(fù)、抗肝纖維化、提高免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛、改善微循環(huán)等作用[3]。近年來(lái)，對(duì)美洲大蠊提取物的研究和利用越來(lái)越多，上市制劑有康復(fù)新液、心脈隆注射液、肝龍膠囊、消癥益肝片等[4]。目前美洲大蠊提取物的劑型有膠囊、片劑、凝膠劑、軟膏劑等劑型[5-6]，關(guān)于美洲大蠊提取物脂質(zhì)體的研究尚未見報(bào)道。脂質(zhì)體是將藥物包封于類脂雙分子層中的超微型囊泡狀藥物載體，能夠提高美洲大蠊提取物的滯留時(shí)間、增加病灶部位靶向性及掩蓋藥物的不良味道[7-8]，本課題制備美洲大蠊提取物脂質(zhì)體，以包封率為指標(biāo)，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選處方及制備工藝，并考察最優(yōu)工藝脂質(zhì)體的外觀、Zeta 電位、粒徑等指標(biāo)，為美洲大蠊提取物脂質(zhì)體的制備和應(yīng)用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CP224C 型分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；KQ5200DB 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Agilent1260 型高效液相色譜儀（G1315D 型DAD 檢測(cè)器）；RE-2000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；TGL-20B 型數(shù)顯高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Tecnai-G20 型透射電鏡（美國(guó)FEI 公司）；ZS90 型納米粒徑電位分析儀（英國(guó)Malvern 公司）。

1.2 藥物與試劑

美洲大蠊提取物（云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室大理大學(xué)劉光明教授提供）；尿嘧啶（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100469-201302）；大豆卵磷脂（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；膽固醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；三氯甲烷（天津利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司）；葡聚糖凝膠G-50（上海麥克林生化科技有限公司）；乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 美洲大蠊提取物脂質(zhì)體的制備

分別稱取適量大豆卵磷脂和膽固醇，置于茄型瓶中，用適量三氯甲烷使其充分溶解，減壓抽濾旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去三氯甲烷，在瓶壁上形成均勻類脂薄膜。稱取適量美洲大蠊提取物浸膏，用pH6.6 磷酸鹽緩沖液( PBS)配成溶液，倒入上述茄形瓶10mL 含藥PBS，常壓旋轉(zhuǎn)水化1.5h，經(jīng)f0.45μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得脂質(zhì)體混懸液。

2.2 脂質(zhì)體中指標(biāo)成分含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色 譜 柱：ZORBOX SB-C18 柱（250mm×4.6mm，5μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，流動(dòng)相：水（A）-乙腈（B）梯度洗脫（0～2min，2%B；2～16min，7.3%B；16～20min，8%B；20～25min，2%B），流 速0.6mL·min-1，進(jìn)樣量20μL，柱溫25℃。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密吸取美洲大蠊提取物脂質(zhì)體0.5mL 至10mL 容量瓶，用適量甲醇破乳，超聲15min 后用pH6.6 PBS 定容，f0.22μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。于4℃保存，備用。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密量取尿嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品適量至容量瓶，超聲溶解后用pH6.6 PBS 定容，即得。

2.2.4 專屬性實(shí)驗(yàn)

取對(duì)照品與空白脂質(zhì)體混合溶液，對(duì)照品溶液，空白脂質(zhì)體溶液用適量甲醇處理后進(jìn)樣，結(jié)果證明脂質(zhì)體輔料對(duì)含量測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)果如圖1。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密稱取尿嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品1.60mg，置于100mL 容量瓶中，用pH6.6 PBS 溶解，超聲，待尿嘧啶完全溶解后定容，得16μg·mL-1貯備液，精密量取貯備液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.25，0.5，1，2，4，8，16μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行操作，測(cè)定色譜峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y=128.29X-12.193（R2=0.9999），尿嘧啶在0.25～16μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好。

圖1 專屬性實(shí)驗(yàn)HPLC 色譜圖

2.2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，以尿嘧啶峰面積進(jìn)行計(jì)算，RSD 為0.16%，表明儀器的精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一批供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12h 依次進(jìn)樣，以尿嘧啶峰面積進(jìn)行計(jì)算，RSD 為1.6%，表明在12h 內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

平行制備6 份供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣6次，以尿嘧啶峰面積進(jìn)行計(jì)算，RSD 為1.78%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密吸取0.5mL 空白脂質(zhì)體至10mL 容量瓶中，分別精密量取0.8、1.0、1.2mL 的16μg·mL-1的尿嘧啶對(duì)照品溶液，各平行3份，加入適量甲醇破乳，超聲混勻后用PBS 定容至刻度，過(guò)濾后按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，得平均回收率為99.15%，RSD 為0.94%，表明此方法的加樣回收率良好，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.3 微柱離心法測(cè)定美洲大蠊提取物脂質(zhì)體的包封率

2.3.1 微柱的制備

取2.5mL 一次性注射器，將濾紙置于針筒管底防漏，然后倒入充分溶脹且除去氣泡的葡聚糖凝膠G-50，4000r·min-1離心3min，除去多余PBS，即得微型柱，所得柱床高度與2.5mL 刻度線相平。

2.3.2 微柱離心法的洗脫條件

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終洗脫條件為：取0.5mL 脂質(zhì)體混懸液緩慢添加于微柱的柱床上，4000r·min-1離心3min，得第一次濾液。然后加入0.5mL PBS，4000r·min-1離心3min，得第二次濾液。重復(fù)此操作三次，最后將以上五次濾液收集待測(cè)。

2.3.3 柱回收率實(shí)驗(yàn)

精密吸取空白脂質(zhì)體0.5mL，緩慢添加于微柱的柱床上，按2.3.2 項(xiàng)下條件洗脫，將收集的濾液入10mL 容量瓶，用PBS 定容。以PBS 為空白對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)500nm 波長(zhǎng)處的吸光度（A1），另精密吸取空白脂質(zhì)體0.5mL 入10mL 容量瓶，用PBS定容。同法測(cè)定500nm 波長(zhǎng)處的吸光度（A2）。根據(jù)公式計(jì)算脂質(zhì)體的柱回收率（%）=A1/A2×100%[9]。比較上柱前后吸光度的變化，結(jié)果見表2。

表2 空白脂質(zhì)體柱回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.3.4 凝膠微柱對(duì)美洲大蠊提取物的吸附實(shí)驗(yàn)

精密吸取一定濃度的美洲大蠊提取物溶液0.5mL 加入到0.5mL 空白脂質(zhì)體溶液中，將混合溶液緩慢添加于微柱的柱床上，按2.3.2 項(xiàng)下條件，將收集的濾液入10mL 容量瓶，破乳定容后經(jīng)f0.22μm 微孔濾膜過(guò)濾，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。另精密吸取同濃度美洲大蠊提取物溶液0.5mL 入10mL 容量瓶，同法進(jìn)樣檢測(cè)。表明葡聚糖凝膠G-50 微柱可基本完全吸附游離藥物。結(jié)果見表3。

表3 美洲大蠊提取物柱吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.3.5 包封率的測(cè)定

精密吸取美洲大蠊提取物脂質(zhì)體混懸液0.5mL 緩慢添加于微柱的柱床上，按2.3.2 項(xiàng)下條件，收集濾液入10mL 容量瓶，加入適量甲醇破乳，超聲15min 后用pH 6.6 PBS 定容，f0.22μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。計(jì)算包封率（EE），EE（%）=( 上柱后脂質(zhì)體中藥物含量/上柱前脂質(zhì)體中藥物含量)× 100%[10]。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批美洲大蠊提取物脂質(zhì)體混懸液，按2.3.5 項(xiàng)下方法測(cè)定其包封率，重復(fù)3 次，結(jié)果分別為44.77%，45.63%，45.01%，RSD 為0.98%，符合測(cè)定要求。

2.4 制備工藝優(yōu)化

在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取大豆卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量比、卵磷脂和美洲大蠊提取物的質(zhì)量比、有機(jī)溶劑體積、水化溫度為考察因素，以美洲大蠊提取物中成分尿嘧啶的包封率為指標(biāo)，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化美洲大蠊提取物脂質(zhì)體的制備工藝，因素水平表見表4，正交試驗(yàn)安排及直觀分析見表5，方差分析見表6。

表4 美洲大蠊提取物脂質(zhì)體制備工藝優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表6 方差分析

表5 美洲大蠊提取物脂質(zhì)體工藝優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)安排及直觀分析

由直觀分析可知，各因素對(duì)脂質(zhì)體中尿嘧啶包封率的影響程度為A＞B＞C＞D 。以極差最小的D 因素為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)因素A、B 具有顯著性，最佳處方A3B3C2D2,即最佳處方為藥脂比1:5，磷脂膽固醇質(zhì)量比4:1，水浴溫度50℃，有機(jī)溶劑體積10mL。

2.5 美洲大蠊提取物脂質(zhì)體的體外性質(zhì)表征

2.5.1 脂質(zhì)體形態(tài)

取適量最佳工藝美洲大蠊提取物脂質(zhì)體混懸液，用適量3%的磷鎢酸負(fù)染，滴至銅網(wǎng)表面，待晾干后在透射電子顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示脂質(zhì)體外觀接近球形，形態(tài)完整，粒徑分布較為均勻，見圖2。

圖2 美洲大蠊提取物脂質(zhì)體透射電鏡圖

2.5.2 粒徑與Zeta 電位

取適量最佳處方美洲大蠊提取物脂質(zhì)體混懸液稀釋液，用納米粒徑電位分析儀檢測(cè)，測(cè)得平均粒徑233.7nm，多分散系數(shù)0.105，Zeta 電位為-28.3mV。

2.5.3 包封率

按最佳處方制備3 批美洲大蠊提取物脂質(zhì)體，測(cè)定尿嘧啶包封率。所得包封率為（62.9±0.7）%，表明優(yōu)選工藝所制備的脂質(zhì)體包封率處于較穩(wěn)定的水平。結(jié)果見表7。

表7 最佳處方包封率驗(yàn)證

3 討論

美洲大蠊提取物中含有多種化學(xué)成分如核苷類、氨基酸類、多糖類、多肽類、油脂類等，核苷類物質(zhì)是抗病毒、腫瘤等藥物的中間體，有重要的生物活性[11]。故本實(shí)驗(yàn)選擇了美洲大蠊提取物中含量較高的核苷類物質(zhì)尿嘧啶作為包封率測(cè)定指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、曲拉通X-100、氯仿等破乳劑對(duì)美洲大蠊提取物脂質(zhì)體的破乳效果，結(jié)果證明破乳劑的量過(guò)大會(huì)使尿嘧啶的色譜峰分裂，最后選擇甲醇作為破乳劑，加入量應(yīng)少于樣品10 倍量[12]。美洲大蠊提取物多為水溶性成分，故先嘗試了逆相蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體，結(jié)果證明逆相蒸發(fā)法制備的脂質(zhì)體包封率低且不穩(wěn)定，后采用薄膜分散法制備美洲大蠊提取物脂質(zhì)體。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)，確定了薄膜分散法制備美洲大蠊提取物脂質(zhì)體的最佳工藝。最佳處方為藥脂比1:5，磷脂膽固醇質(zhì)量比4:1，水浴溫度50℃，三氯甲烷體積10mL。用該方法制備美洲大蠊提取物脂質(zhì)體簡(jiǎn)便可行，可為美洲大蠊提取物的制劑研究提供參考。