許崇利， 許崇波， 林一民

（1.吉林化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，吉林 吉林132022； 2.重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，重慶401331；3.韶關(guān)學(xué)院 英東生命科學(xué)院，廣東 韶關(guān)512005；4.重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 腫瘤轉(zhuǎn)移與個(gè)體化診治轉(zhuǎn)化研究重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400030）

新生仔豬腹瀉是目前規(guī)?；B(yǎng)豬生產(chǎn)面臨的主要難題之一，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1-2］.致病性大腸桿菌是造成新生仔豬和斷奶仔豬腹瀉的最重要病原，其中產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coil，ETEC）是最主要的致病菌，它包括黏著素和腸毒素2 種致病因子.黏著素具有良好的免疫原性，主要有K88、987P、K99和F41 等，黏著素使ETEC 黏著于腸黏膜上皮細(xì)胞從而使其發(fā)生病理性變化最終導(dǎo)致仔豬腹瀉.腸毒素包括ST1、ST2耐熱性腸毒素和LTA、LTB不耐熱性腸毒素，其中ST1沒(méi)有免疫原性，LTB無(wú)毒性［3-6］.為了更好地解決免疫效果，構(gòu)建了大腸桿菌K88ac-ST1-LTB基因工程疫苗［7-8］.

雖然抗生素作為控制細(xì)菌感染的有效藥物廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)中，但抗生素的長(zhǎng)期使用引起的耐藥性問(wèn)題和生產(chǎn)中超量使用抗生素的現(xiàn)象越來(lái)越突出，而且控制效果也并不樂(lè)觀［9-10］.抗生素替代品的研究成為畜牧業(yè)發(fā)展的迫切需求.初生仔豬和早期斷奶仔豬自身免疫功能的不成熟以及早期斷奶應(yīng)激引起的免疫抑制，是造成仔豬對(duì)ETEC 敏感性增高、抗病力下降、引發(fā)ETEC 感染性腹瀉的主要因素.利用外源抗體為仔豬提供被動(dòng)免疫，可有效預(yù)防和治療腸道ETEC 感染引起的疾病，其中雞卵黃抗體因其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、特異性抗體含量高、安全性好、易規(guī)?；a(chǎn)等特點(diǎn)，越來(lái)越受到人們的關(guān)注，并有潛力開發(fā)為一類可替代抗生素的高效生物防治制劑［11-14］.為此，課題組以產(chǎn)蛋雞為生物反應(yīng)器，采用大腸桿菌K88ac-ST1-LTB基因工程疫苗作為抗原，研究開發(fā)引起新生仔豬腹瀉的ETEC最主要致病因子（K88ac、ST、LT）的特異性卵黃抗體，為進(jìn)一步研究開發(fā)出一種新型高效、可替代抗生素的防治新生仔豬大腸桿菌性腹瀉的特異性卵黃抗體生物防治制劑打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 載體和菌株 BL21（DE3）（pETXKSL3）重組菌株由課題組構(gòu)建，海蘭蛋雞和仔豬購(gòu)自正大畜禽有限公司.

1.2 試劑 TaKaRa 質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司；限制性核酸內(nèi)切酶NcoI、HindIII和IPTG購(gòu)自TaKaRa公司；兔抗雞IgG辣根過(guò)氧化物酶（HRP）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，卡那霉素購(gòu)自Promega公司.

1.3 重組菌株BL21（DE3）（pETXKSL3）鑒定和Western blot 分析 按照TaKaRa 質(zhì)粒DNA 小量純化試劑盒說(shuō)明書提取pETXKSL3 重組質(zhì)粒，利用限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，鑒定正確后送TaKaRa公司進(jìn)行測(cè)序.取5 mL LB培養(yǎng)基，質(zhì)量濃度30 μg／mL 的Kan，按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%接種BL21（DE3）（pETXKSL3）重組菌株，37 ℃ 200 r／min恒溫培養(yǎng)12 ～16 h，轉(zhuǎn)接至200 mL Kan 質(zhì)量濃度為30 μg／mL的LB 培養(yǎng)基中37 ℃恒溫培養(yǎng)，當(dāng)OD600＝0.6 ～0.8 時(shí)加入IPTG 誘導(dǎo)劑，其濃度為1 mmol／L，37 ℃誘導(dǎo)4 h后，4 ℃12 000 r／min離心1 min，棄去培養(yǎng)基上清液，所得沉淀即為菌體，20 mL 50 mmol／L Tris·Cl -2 mmol／L EDTA 重新懸浮菌體，12 000 r／min 離心10 min，棄去上清液，10 mL 10 mmol／L Tris·Cl再次懸浮菌體并使用質(zhì)量濃度為1 mg／mL 溶菌酶破碎菌體，2 mL Triton X-100混勻并于30 ℃條件下水浴15 min.超聲波碎菌儀連續(xù)2 個(gè)10 s 破碎，12 000 r／min 離心15 min，收集所得沉淀進(jìn)行SDS -PAGE 電泳分析和Western blotting鑒定［15］.

1.4 卵黃抗體的制備

1.4.1 蛋雞的免疫 將購(gòu)買的4 月齡海蘭蛋雞隨機(jī)分為5 組，按照5∶ 1 的比例將抗原與弗氏完全佐劑均勻混合進(jìn)行首次免疫，充分乳化后選取胸肌部位進(jìn)行分點(diǎn)注射，第二次免疫和第三次免疫在首次免疫14 d和28 d后進(jìn)行，3 次免疫的抗原質(zhì)量濃度分別為0.4、0.6 和0.8 mg／mL，注射量為每只1 mL／每次，在第二次免疫7 d 后開始收集蛋并以免疫前雞蛋和血清分別作為陰性對(duì)照.

1.4.2 卵黃抗體的提取純化 采用水稀釋-鹽析法提取卵黃抗體，首先使用清水去除蛋殼表面的污

物，接著用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 5%新潔爾滅浸泡20 ～30 min并晾干，無(wú)菌條件下使用蛋黃分離器分離蛋黃與蛋清，9 倍體積的蒸餾水對(duì)提取的卵黃液進(jìn)行稀釋并將pH值調(diào)至5.0 ～5.2，置于冰箱4 ℃過(guò)夜后收集上清液，滴加飽和（NH4）2SO4至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%，6 000 r／min 4 ℃離心15 min 后棄去上清液，收集得到的高免卵黃抗體置于-20 ℃?zhèn)溆?

1.4.3 卵黃抗體的效價(jià)檢測(cè) 采用間接ELISA對(duì)卵黃抗體效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)，利用包被液將抗原稀釋至質(zhì)量濃度為3.0 μg／mL，酶標(biāo)板4 ℃孵育過(guò)夜，棄去包被液洗板3 次，加入200 μL／孔封閉液37 ℃孵育2 h，洗板3 次，將卵黃抗體以1∶ 500 的比例進(jìn)行稀釋，按照100 μL／孔的量加入酶標(biāo)板37 ℃孵育1 h，洗板3 次后加入兔抗雞辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體（1∶ 2 000），按照100 μL／孔的量加入酶標(biāo)板37 ℃孵育15 min，50 μL／孔加入2 mol／L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值并記錄［16］.

1.5 仔豬預(yù)防效果試驗(yàn) 在有仔豬大腸桿菌病患病史的豬場(chǎng)選取3 窩30 頭健康仔豬，分為3 組每組10 頭，1 ～2 組于出生2 h和6 h后口服制備的多價(jià)高免卵黃抗體，每次4 mL，對(duì)照組3 組未采取任何免疫預(yù)防措施，14 d后觀察仔豬腹瀉情況.

1.6 仔豬攻毒保護(hù)試驗(yàn) 將70 頭健康的新生3 日齡仔豬按自然窩次分成7 組，每組10 頭，1 ～5 組為試驗(yàn)組，50 頭仔豬于出生4 h 和8 h 后分別口服多價(jià)高免卵黃抗體4 mL，對(duì)照6 ～7 組20 頭不口服高免卵黃抗體.48 h后用8 株大腸桿菌混懸液進(jìn)行口服攻毒實(shí)驗(yàn)，每頭5 mL，含菌量為1 ×1012CFU／mL，觀察仔豬發(fā)病與病死情況并進(jìn)行病理檢測(cè).

2 結(jié)果

2.1 pETXKSL3 重組質(zhì)粒酶切鑒定 試劑盒快速抽提pETXKSL3 重組質(zhì)粒，經(jīng)NcoI／HindIII 雙酶切后進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明目的基因830 bp 位于750 ～1 000 bp 之間，序列測(cè)序表明pETXKSL3 重組質(zhì)粒含有目的基因且序列和閱讀框架均正確（圖1）.

2.2 K88ac-ST1-LTB融合蛋白SDS-PAGE分析和Western blot鑒定 BL21（DE3）（pETXKSL3）重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)3 h 后，收集菌體并進(jìn)行破碎處理，SDS - PAGE 分析表明K88ac - ST1-LTB融合蛋白在BL21（DE3）宿主菌中高效表達(dá)，目的蛋白占菌體總蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32%. Western blot鑒定證實(shí)K88ac -ST1-LTB融合蛋白能夠被ST1單抗、K88ac和LTB抗體所識(shí)別（圖2）.

圖1 重組質(zhì)粒pETXKSL3 酶切鑒定結(jié)果Fig. 1 Identification of the recombinant plasmid pETXKSL3 by enzyme digestion

圖2 K88ac-ST1 -LTB融合蛋白的SDS-PAGE（A）和Western blot（B）鑒定Fig. 2 SDS-PAGE analysis（A）and Western blotting identification（B）of the K88ac-ST1 -LTB protein

2.3 卵黃抗體的純化 采用水稀釋-硫酸銨二次沉淀法純化制備的多價(jià)高免卵黃抗體，其為澄清透明狀，質(zhì)量分?jǐn)?shù)15% SDS-PAGE凝膠電泳分析表明在31 ku處有清晰的蛋白質(zhì)條帶且純度較高（圖3）.

圖3 純化的卵黃抗體SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the purified egg yolk antibody

2.4 卵黃抗體效價(jià)檢測(cè) 間接ELISA方法測(cè)定多價(jià)高免卵黃抗體效價(jià)，抗原包被質(zhì)量濃度為3.0 μg／mL，加入稀釋度為1∶ 2 000 的二抗后，檢測(cè)結(jié)果顯示水稀釋-硫酸銨二次沉淀法提取的多價(jià)高免卵黃抗體效價(jià)為1∶ 13 200.

2.5 仔豬預(yù)防效果試驗(yàn) 試驗(yàn)組20 頭仔豬口服制備的多價(jià)高免卵黃抗體14 d后均未發(fā)病，預(yù)防有效率為100%，對(duì)照組10 頭有3 頭發(fā)病并死亡.

2.6 仔豬攻毒保護(hù)試驗(yàn) 5 組仔豬進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)后，試驗(yàn)組保護(hù)率為96%（48／50）（表1），剖檢后組織學(xué)檢查無(wú)病理變化，表明口服多價(jià)高免卵黃抗體具有很好的免疫預(yù)防效果.而對(duì)照組20 頭仔豬全部發(fā)病并死亡且出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，剖檢后組織學(xué)檢查發(fā)生病理變化.上述結(jié)果說(shuō)明K88ac -ST1-LTB多價(jià)卵黃抗體對(duì)由ETEC 引起的新生仔豬腹瀉具有很好的預(yù)防效果.

表1 仔豬攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果Tab. 1 Piglet challenge test results

3 討論

目前為止，針對(duì)仔豬黃痢和仔豬白痢的預(yù)防與治療措施主要包括接種大腸桿菌多價(jià)疫苗以及注射抗生素［17-18］.但抗生素治療由于缺乏有效的監(jiān)管，往往造成抗生素使用不當(dāng)，甚至出現(xiàn)抗生素濫用現(xiàn)象，而且長(zhǎng)期使用抗生素也會(huì)引起耐藥性問(wèn)題，不斷出現(xiàn)大腸桿菌耐藥菌株從而影響治療效果.另外，肉制品中超標(biāo)的抗生素也會(huì)危害身體健康［19-20］.國(guó)內(nèi)對(duì)于仔豬腹瀉的免疫預(yù)防雖然取得了較好的效果，但商業(yè)化的疫苗往往只針對(duì)ETEC菌毛，尚未有針對(duì)腸毒素的疫苗且只產(chǎn)生體液免疫，而且即使疫苗預(yù)防在體內(nèi)產(chǎn)生高水平的抗體，但對(duì)于已經(jīng)侵入腸道內(nèi)的致病菌仍不能抑制其復(fù)制釋放毒素.另外，疫苗預(yù)防會(huì)有不同程度的副作用，甚至?xí)a(chǎn)生炎癥反應(yīng)從而影響免疫效果.因此，探索研發(fā)替代抗生素更有效的預(yù)防和治療措施變得尤為重要.

迄今為止對(duì)于仔豬腹瀉治療主要采用抗生素，但抗生素僅對(duì)細(xì)菌起到抗菌效果，對(duì)于腸毒素作用效果并不顯著，而且大腸桿菌極易產(chǎn)生耐藥性，長(zhǎng)時(shí)間使用抗生素會(huì)導(dǎo)致濫用現(xiàn)象并產(chǎn)生耐藥菌株.另外，抗生素在殺菌同時(shí)也會(huì)抑制腸道內(nèi)正常的益生菌從而導(dǎo)致腸道內(nèi)微生物菌群失衡，干擾消化吸收功能.卵黃抗體是從免疫禽蛋中提取出來(lái)的針對(duì)特定抗原的抗體，卵黃抗體因其穩(wěn)定性好、耐酸堿、耐高溫、易于制備及純化等獨(dú)有的特點(diǎn)從而得到很好的開發(fā)和應(yīng)用.近年來(lái)，研究人員利用卵黃抗體治療仔豬腹瀉方面進(jìn)行了大量研究，研究表明卵黃抗體能有效防制仔豬腹瀉且不會(huì)產(chǎn)生耐藥性，有望成為新型可替代抗生素的高效生物防治制劑.課題組以產(chǎn)蛋雞為生物反應(yīng)器，采用大腸桿菌K88ac -ST1-LTB基因工程疫苗作為抗原，研究開發(fā)引起新生仔豬腹瀉的ETEC最主要致病因子（K88ac、ST、LT）的特異性卵黃抗體，為進(jìn)一步研究開發(fā)出一種新型高效、可替代抗生素的防治新生仔豬大腸桿菌性腹瀉的特異性卵黃抗體生物防治制劑打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ).